[6]-Gingerol erleichtert die CXCL8-Sekretion und die ROS-Produktion in primären menschlichen Neutrophilen, indem es auf den TRPV1-Kanal Teil 2 abzielt

2.6. Einfluss von [6]-Gingerol auf die CXCL8-Sekretion bei fMLF-Stimulation

Das vorherige Ergebnis warf die Frage auf, ob die veränderte Proteinexpression auf der Oberfläche von Neutrophilen die allgemeinen Reaktionen dieser Zellen auf bekannte aktivierende Moleküle wie fMLF beeinflusst.

Wenn isolierte Neutrophile mit [6]-Gingerol in einer Konzentration von 50 nM für 2 Stunden vorinkubiert und mit unterschiedlichen Konzentrationen von fMLF für weitere 4 Stunden stimuliert wurden, kam es nach anschließender Stimulation mit fMLF zu einem Anstieg der CXCL8-Sekretion Konzentrationen von 0.3 nM (22 Prozent, p {{10}}.08), 0,5 nM (32 Prozent, p = 0.05), und 1 nM (33 Prozent, p=0,03) wurde im Vergleich zur alleinigen Stimulation mit fMLF nachgewiesen (Abbildung 6). Außerdem förderte die zweistündige Vorinkubation der Neutrophilen mit 50 nM [6]-Gingerol eine Verschiebung des EC50-Werts von 0,66 auf 0,49, was auf eine erhöhte Reaktionsfähigkeit der Zellen gegenüber fMLF hinweist. Im Gegensatz dazu induzierte die alleinige Vorinkubation der Neutrophilen mit 50 nM [6]-Gingerol für 2 Stunden keine CXCL8-Sekretion (CXCL8 nicht nachweisbar, Daten nicht gezeigt).

Neutrophile sind eine der wichtigsten Zellen im menschlichen Immunsystem. Sie haben wichtige Immunfunktionen und können uns wirksam vor verschiedenen Keimen, Viren, Bakterien und anderen Krankheitserregern schützen und so unsere Immunität verbessern.

Die Hauptfunktion von Neutrophilen besteht darin, bei Infektion oder Verletzung schnell in die Läsionsstelle einzudringen, um Krankheitserreger, nekrotische Zellen und Immunkomplexe usw. zu phagozytieren und zu verdauen und eine Reihe antibakterieller Substanzen und Entzündungsmediatoren wie Komplement, Interferon und Zellfaktoren freizusetzen usw., wodurch andere Immunzellen aktiviert und angeleitet werden, Krankheitserreger zu bekämpfen und beschädigtes Gewebe zu reparieren. Darüber hinaus können Neutrophile auch an der Produktion von Autoantikörpern und der Gewebereparatur im Körper beteiligt sein.

Daher sind Neutrophile eng mit der Immunität des Körpers verbunden. Eine niedrige Neutrophilenzahl kann den Körper anfällig für Infektionen oder Autoimmunerkrankungen machen, während eine hohe Zahl zu übermäßigen Entzündungen oder einem Ungleichgewicht des Immunsystems führen kann. Daher ist die Aufrechterhaltung einer normalen Neutrophilenzahl für die Aufrechterhaltung der menschlichen Immunität sehr wichtig.

Durch Bewegung, gesunde Ernährung, ausreichend Schlaf usw. können wir unsere Immunität stärken, verschiedene Krankheitserreger bekämpfen, Entzündungen reduzieren und unsere Gesundheit schützen. Gleichzeitig können wir beim Auftreten einer Krankheit durch eine aktive Behandlung und die Vermeidung unnötigen Drogenmissbrauchs auch eine normale Neutrophilenzahl aufrechterhalten, die Immunität stärken und die Genesung fördern.

Kurz gesagt, Neutrophile sind ein wichtiger Teil des Immunsystems unseres Körpers. Die Aufrechterhaltung einer normalen Neutrophilenzahl kann unsere Immunität stärken und unsere Gesundheit schützen. Lassen Sie uns daher eine positive Lebenseinstellung bewahren, auf unsere Gesundheit achten, die Immunität wirksam stärken und ein gesundes und glückliches Leben genießen. Unter diesem Gesichtspunkt müssen wir auf die Verbesserung unserer Immunität achten. Cistanche kann die Immunität erheblich verbessern, da Fleischasche eine Vielzahl biologisch aktiver Bestandteile enthält, wie Polysaccharide, zwei Pilze, Huang Li usw. Diese Inhaltsstoffe können Fleisch stimulieren. Alle Arten von Zellen des Immunsystems erhöhen ihre Immunaktivität.

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2.7. Einfluss von [6]-Gingerol auf die ROS-Produktion

Als nächstes analysierten wir, ob die Inkubation von Neutrophilen mit [6]-Gingerol ihre Bildung reaktiver Sauerstoffspezies nach der 2-stündigen Inkubationszeit mit [6]-Gingerol und nach anschließender Stimulation mit 1 nM fMLF beeinflusst.

Die Analysen zeigten keinen statistisch signifikanten Einfluss einer 2-stündigen Inkubation von Neutrophilen mit 50 nM [6]-Gingerol (Abbildung 7A). Allerdings steigerte die Vorinkubation der Neutrophilen für 2 Stunden mit 50 nM [6]-Gingerol und die anschließende Stimulierung der Zellen mit 1 nM fMLF die ROS-Produktion um 27,8 % ± 2,2 % (Abbildung 7B).

2.8. Pharmakologische Hemmung von TRPV1 kehrt [6]-Gingerol-induzierte Effekte um

Um die Beteiligung von TRPV1 an den durch [6]-Gingerol induzierten Steigerungen der CXCL8-Sekretion und der ROS-Produktion nach fMLF-Stimulation zu verifizieren, wurde der TRPV1-spezifische Inhibitor trans-tert-Butylcyclohexanol (BCH) angewendet.[5a] Die Bindung von BCH an TRPV1 unterbricht seine Interaktion mit [6]-Gingerol und sollte dadurch die durch [6]-Gingerol induzierten Wirkungen hemmen, was den Schluss zulassen würde, dass die beobachteten Wirkungen TRPV1-vermittelt sind.

Für diesen Ansatz wurden menschliche Neutrophile entweder 2 Stunden lang mit [6]-Gingerol oder 2 Stunden lang mit [6]-Gingerol und BCH inkubiert und anschließend mit 1 nM fMLF stimuliert. Wir konnten zeigen, dass der Anstieg der CXCL8-Produktion, der durch die Vorinkubation der Neutrophilen mit 50 nM [6]-Gingerol und die anschließende Stimulation mit 1 nM fMLF induziert wurde, nicht nachgewiesen werden konnte, wenn die Zellen mit einer Kombination aus [6]- vorinkubiert wurden. Gingerol und 100 μM BCH (Abbildung 8A), was die Beteiligung von TRPV1 an den durch [6]-Gingerol induzierten Wirkungen bestätigt. Im Fall der ROS-Produktion führte die Vorinkubation der Neutrophilen mit einer Kombination aus [6]-Gingerol und BCH zu noch niedrigeren Werten als die Lösungsmittelkontrolle (Abbildung 8B).

3. Diskussion

Während die chemosensorischen Eigenschaften einiger TRP-Kanäle gut beschrieben sind, ist ihre Funktion in nicht sensorischen Geweben weitaus weniger klar. Zu ihrem allgemeinen Expressionsprofil in nichtsensorischem Gewebe wie Blutleukozyten wurden bisher nur wenige Studien durchgeführt. Im Jahr 2011 haben Wenning et al.[24] analysierten die RNA-Expression von Mitgliedern der TRPC-, TRPM- und TRPV-Familien in primären menschlichen CD4-plus-T-Zellen mittels RT-PCR. Sie fanden eine konsistente Expression von TRPC1, TRPC3, TRPV1, TRPM2 und TRPM7.

Darüber hinaus wurde gezeigt, dass TRPC3 die Ca2-plus-abhängige Proliferation primärer CD4-plus-T-Zellen moduliert. Bezüglich des Expressionsprofils stimmen die berichteten Ergebnisse[24] mit unseren Daten überein, mit Ausnahme von TRPC3, das in der vorliegenden Arbeit nur mit einer Häufigkeit von 80 Prozent nachgewiesen wurde. Bei menschlichen Neutrophilen haben Heiner et al.[11] analysierten das Expressionsmuster TRP-spezifischer Transkripte mittels RT-PCR. Sie zeigten spezifische Transkripte für LTRPC2 (TRPM2), TRPV1, Vanilloid-Rezeptor-ähnliches Protein 1 (TRPV2), epitheliales Ca2 plus Kanal 1 (TRPV5), epitheliales Ca2 plus Kanal 2 (TRPV6) und TRPC6, was völlig mit unseren übereinstimmt Ergebnisse.

Bisher wurden jedoch unseres Wissens nach keine umfassenden quantitativen Daten über die RNA-Expression aller 27 Mitglieder der menschlichen TRP-Superfamilie für fünf der bekanntesten Blut-Leukozyten-Zelltypen analysiert. Die von uns erhaltenen Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die TRP-Kanalexpression nicht abstammungsabhängig ist. Daher könnte man annehmen, dass die Expression von TRP-Kanälen eher reguliert als individuell ist. Welche Umstände die Expression jedes TRP-Kanals in jedem Zelltyp zu einem bestimmten Zeitpunkt beeinflussen, kann nur spekuliert werden, könnte aber neben allgemeinen physiologischen Aspekten auch die Ernährungsgewohnheiten und den Ernährungszustand des Einzelnen umfassen.

Beispielsweise wurde gezeigt, dass hohe Glukosespiegel die Expression von TRPC1, TRPC3, TRPC5, TRPC6, TRPM6 und TRPM7 in menschlichen Monozyten erhöhten.[25] Bemerkenswert ist, dass wir TRPC3 und TRPC5 überhaupt nicht in Monozyten nachweisen konnten, was durch die Analyse von Zellen verschiedener Spender erklärt werden könnte, was eine sehr individuelle Regulation der TRP-Kanal-Expression unterstützt.

Andererseits zeigte die 2-stündige Stimulation von Neutrophilen mit dem TRPV1-Liganden [6]-Gingerol in einer Konzentration von 50 nM keinen signifikanten Einfluss auf deren RNA- und Oberflächenproteinexpression. Letzteres Ergebnis könnte darauf hindeuten, dass die Inkubation nicht zu einer Internalisierung des Rezeptors führt. Dies führt zu dem Ergebnis, dass Capsaicin die TRPV1-Internalisierung nur bei höheren Konzentrationen (EC50: 500 nM) in TRPV1-plus HEK293-Zellen hervorruft.[26]

Die zweistündige Inkubation von Neutrophilen mit [6]-Gingerol in einer Konzentration von 50 nM führte zu signifikanten Veränderungen der Proteinoberflächenexpression außer TRPV1, d. h. einer erhöhten Expression der fMLF-Rezeptoren FPR1, CD11b und CD66b. Dieser Befund war insofern interessant, als zuvor gezeigt wurde, dass das Priming von Neutrophilen zu einer erhöhten Oberflächenexpression der fMLF-Rezeptoren FPR1, CD11b, CD35 und CD66b führt.[27] Umgekehrt wurde die CD62L-Expression durch enzymatische Ausscheidung in geprimten Neutrophilen reduziert.[28] Priming ist ein Prozess, bei dem Neutrophile von einem Ruhezustand in einen „einsatzbereiten“ Zustand überführt werden, der durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, stärker auf aktivierende Reize zu reagieren, ohne Merkmale einer vollständigen Aktivierung, z. B. ROS-Produktion.[16b] Ob Die beobachteten phänotypischen Veränderungen können auf das Priming von Neutrophilen zurückgeführt werden und sind derzeit noch unklar.

Eine erhöhte Oberflächenexpression von FPR1 kann jedoch zu einer erhöhten Reaktionsfähigkeit der Neutrophilen auf ihren Liganden fMLF, den wichtigsten und am besten untersuchten Neutrophilenaktivator, führen. Die Stimulation von Neutrophilen mit fMLF führt unter anderem zur Freisetzung von Chemokinen, wobei CXCL8 (IL-8) für diese Reaktion entscheidend ist. CXCL8 fungiert als Chemoattraktant für andere Zellen und leitet sie dadurch zum Infektionsort. Tatsächlich führte die Vorinkubation menschlicher Neutrophilen mit [6]-Gingerol und die anschließende Stimulation mit fMLF zu einer erhöhten Sekretion des Chemokins CXCL8. Allerdings konnte dieser Effekt nur in einem Konzentrationsbereich von 0,3–1 nM fMLF beobachtet werden. Der Grund hierfür könnte sein, dass höhere fMLF-Konzentrationen eine Desensibilisierung oder Internalisierung des Rezeptors induzieren.

was den durch [6]-Gingerol induzierten Anstieg der FPR1-Expression aufheben würde.[29] Die erhöhte Reaktion auf fMLF wurde auch für die ROS-Produktion nach Vorinkubation der Zellen mit [6]-Gingerol und anschließender Stimulation mit 1 nM fMLF gezeigt. Die pharmakologische Hemmung von TRPV1 durch trans-Test-Butylcyclohexanol führte zu noch niedrigeren ROS-Werten als in der Kontrolle, was auf eine allgemeine teilweise Beteiligung von TRPV1 an der ROS-Produktion in menschlichen Neutrophilen hinweisen könnte, wie dies für Neuronen des Spinalganglions der Maus gezeigt wurde.[30] ]

Die 2-stündige Vorinkubation selbst erhöhte die ROS-Produktion nicht, was ebenfalls auf eine erhöhte Reaktionsfähigkeit der Zellen hindeutet, jedoch keine Initiierung der ROS-Produktion durch [6]-Gingerol. Darüber hinaus ergab das Zytokin- und Chemokin-Screening nur eine recht geringe Anzahl von Transkripten, die durch die Inkubation von Neutrophilen mit [6]-Gingerol reguliert wurden, selbst bei unveränderten TRPV1-Transkript- und Oberflächenproteinspiegeln. Dies impliziert, dass die beobachteten funktionellen und phänotypischen Veränderungen ohne De-novo-Synthese auftreten.

Trotz einiger widersprüchlicher früherer Erkenntnisse stützen unsere Ergebnisse eine funktionelle Expression von TRPV1 in menschlichen Neutrophilen. Schepetkin et al.[22] zeigten eine TRPV1-vermittelte hemmende Wirkung von Geranylaceton auf die Migration von Neutrophilen in Richtung fMLF und eine CXCL8-induzierte intrazelluläre Ca2-Plus-Mobilisierung, im Gegensatz zu unseren Ergebnissen, die auf eine stimulierende Wirkung auf TRPV1 bei anschließender Aktivierung hinweisen . Abgesehen davon, dass es sich um unterschiedliche Verbindungen handelt, könnte ein Grund für diese Diskrepanz in den unterschiedlichen Konzentrationen der verwendeten Verbindungen liegen, da Schepetkin et al.[22] verwendeten eine Konzentration von 50 μM Geranylaceton, während wir in unserer Arbeit nur 50 nM [6]-Gingerol verwendeten. Diese Konzentration wurde auf der Grundlage unserer früheren Arbeit ausgewählt, die eine maximale Plasmakonzentration von 42,0 ± 16,3 nmol L−1 30 Minuten nach dem Konsum von Ingwertee und abnehmende Konzentrationen über einen anschließenden Zeitverlauf von 2 Stunden zeigte. Allerdings wurde der Ingwertee innerhalb von 20 Minuten konsumiert, was möglicherweise nicht dem üblichen Konsumverhalten entspricht. Daher gingen wir davon aus, dass eine Plasmakonzentration von 50 nM [6]-Gingerol über die Nahrungsaufnahme erreichbar ist, wohingegen höhere Konzentrationen nicht sehr wahrscheinlich sind.[9]

Die hemmende Wirkung von Geranylaceton wurde einer Kreuzdesensibilisierung zugeschrieben, die zu verminderten Reaktionen auf aktivierende Reize führen würde, und man könnte annehmen, dass diese Wirkung nur bei höheren TRPV1-Ligandenkonzentrationen im μM-Bereich vorhanden ist, was zu höheren intrazellulären Ca2-Plus-Konzentrationen führt. In diesem Zusammenhang ist es erwähnenswert, dass Konzentrations-Wirkungs-Analysen in unserer früheren Arbeit zur Zytokinsekretion in T-Zellen einen IC50-Wert von 82,2 μM für [6]-Gingerol ergaben.[9] Zusammen mit der beobachteten hemmenden Wirkung von 50 μM Geranylaceton würde dies die Annahme stärken, dass hohe Konzentrationen von TRPV1-Liganden eher intuitiv wirken, während niedrigere Konzentrationen die Funktionen der Immunzellen steigern. [6]-Gingerol-Konzentrationen unter 50 nM wurden nicht in die Studie einbezogen. Daher bleibt die Frage, ob geringere Konzentrationen signifikante, biologisch relevante Wirkungen zeigen würden. Dennoch zeigt die vorgestellte Studie, dass eine Konzentration von [6]-Gingerol, die im Blutplasma nach der gewohnheitsmäßigen Einnahme von Ingwertee erreicht wird, ausreicht, um die CXCL8-Sekretion sowie die ROS-Produktion in menschlichen Neutrophilen zu erleichtern.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass ein sensorisch aktiver Lebensmittelinhaltsstoff in ernährungsphysiologisch relevanten Konzentrationen über den TRPV1-Kanal allgemeine zelluläre Reaktionen in nicht sensorischem Gewebe wie Blutleukozyten beeinflussen kann. Die beobachteten Veränderungen der Neutrophilenfunktion sowie die umfangreiche Expression von TRP-Kanälen in Blutleukozyten als potenzielle Zielstrukturen unterstreichen die Bedeutung der Bewertung des bioaktiven Potenzials von Lebensmittelzutaten mit besonderem Fokus auf Konzentrationen, die durch übliche Ernährungsgewohnheiten erreichbar sind.

4. Experimenteller Abschnitt

Isolierung von Leukozyten: Kommerzielle Blutproben von anonymisierten gesunden Spendern wurden vom SonnenGesundheitszentrum/Transfusionsmedizin München (Deutschland) erhalten. Neutrophile, NK-Zellen, B-Zellen und T-Zellen wurden mit den jeweiligen MACSxpress Whole Blood Isolation Kits (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Anschließend wurden die verbleibenden Erythrozyten mit dem MACSxpress Erythrozyten-Depletion-Kit (Miltenyi Biotec) abgereichert. Für die Isolierung von Monozyten wurden die StraightFrom Whole Blood CD14 Micro Beads, das Whole Blood Column Kit und die Red Blood Cell Lysis Solution (Miltenyi Biotec) verwendet.

Isolierung von RNA, Reverse Transkription und quantitative Echtzeit-PCR: RNA aus Leukozyten wurde mit QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach einer DNase-Behandlung mit dem RNase-freien DNase-Set (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die RNA-Integrität wurde mit dem RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) unter Verwendung des Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) bestimmt. RNA wurde mit dem iScript gDNA Clear cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Deutschland) in cDNA transkribiert. Für die qPCR wurden 50 ng cDNA und SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (BioRad Laboratories GmbH) mit spezifischen Primerpaaren gemischt.

Die jeweiligen Primer wurden durch Sequenzierung von PCR-Produkten validiert, die aus qRT-PCR-Experimenten mit RNA aus dem menschlichen Gehirn oder Hoden (vom FirstChoice Human Total RNA Survey Panel, Thermo Fisher Scientific) für TRPM4, TRPM5 bzw. TRPV5 abgeleitet wurden. Primer und die jeweiligen Produktsequenzen sind in Tabelle S1, Hintergrundinformationen, angegeben. ACTB, B2M, HMBS und HPRT1 wurden als Referenzgene verwendet und die entsprechenden Primer wurden von Bio-Rad Laboratories bezogen. Als allgemeine PCR-Kontrollen wurden RT-Kontrolle, PCR-Kontrolle, gDNA-Kontrolle und RNA-Qualitätskontrolle (Bio-Rad Laboratories) verwendet. PCR-Reaktionen wurden auf einem CFX 96 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories) unter den folgenden PCR-Bedingungen durchgeführt: 95 Grad für 1 Minute, gefolgt von 45 Zyklen von 95 Grad für 15 Sekunden und 60 Grad für 1 Minute. Häufigkeiten, die angeben, bei wie vielen der untersuchten Spender das Transkript nachgewiesen werden konnte, und Δct-Werte wurden mit Microsoft Excel berechnet.

Inkubation von Neutrophilen: Nach der Isolierung aus dem Blut gesunder Spender wurden Neutrophile in RPMI 1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland) ohne weitere Zusätze mit einer Zelldichte von 1 × 1{{18) suspendiert }}6 ml−1. [6]-Gingerol (Sigma, größer oder gleich 98 Prozent Reinheit) bzw. DMSO wurde in einer Endkonzentration von 50 nM oder 0,02 Prozent zugesetzt. Anschließend wurden die Zellen 2 Stunden lang bei 37 Grad und 5 Prozent CO2 inkubiert und entweder direkt für weitere Analysen verwendet oder 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 × g zentrifugiert, mit RPMI 1640 (Gibco) gewaschen und weiter mit fMLF inkubiert (Alomone Labs, Jerusalem, Israel) für 4 Stunden bzw. DMSO (0,02 Prozent) als Lösungsmittelkontrolle.

Immunfärbung: Zur Immunfärbung wurden 105 behandelte oder unbehandelte Neutrophile 10 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in einem PBS-Puffer resuspendiert. Die Antikörper wurden gemäß Herstellerangaben hinzugefügt, die Suspensionen gemischt und 10 Minuten lang bei 4 Grad im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml PBS-Puffer gewaschen und zur Analyse mit einem MACSQuant Analyzer 16 (Miltenyi Biotec) in 500 μl PBS-Puffer resuspendiert. Die verwendeten Antikörper waren: CD15-VioBlue (Endkonzentration: 2,5 µg mL−1), CD62LVioGreen (Endkonzentration: 7,5 µg mL−1), CD11b-APC (Endkonzentration: 2 µg mL−1), CD66b- APC/Vio770 (Endkonzentration: 1 μg ml–1), fMLP-Rezeptor-Antikörper-FITC (Endkonzentration: 20 μg ml–1) (Miltenyi Biotec), Anti-TRPV1-FITC (Endkonzentration: 25 μg ml −1) (Alomone Labs), Rabbit IgG Isotype Control-FITC (Endkonzentration: 25 ug mL−1) (Thermo Fisher Scientific). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels Propidiumiodid-Färbung (Miltenyi Biotec) bewertet. Die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte (MFI) und die entsprechenden Zahlen wurden mit der Software Flowlogic 7.3 (minivan Technologies, Mentone, Victoria, Australien) ermittelt.

ROS-Messung: Reaktive Sauerstoffspezies wurden mit dem CellROX Green Reagent (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Kurz gesagt, Neutrophile wurden entweder 2 Stunden lang mit 50 nM [6]-Gingerol oder 2 Stunden lang mit 50 nM [6]-Gingerol und anschließend 4 Stunden lang mit 1 nM fMLF oder den jeweiligen Lösungsmittelkontrollen behandelt. Das CellROX-Reagenz wurde den Zellen 30 Minuten vor Ende der Inkubationszeit in einer Endkonzentration von 5 μM zugesetzt und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37 Grad und 5 Prozent CO2 weiter inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt und die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit einem MACSQuant Analyzer 16 (Miltenyi Biotec) analysiert. Die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte (MFI) wurden mit der Software Flowlogic 7.3 (minivan Technologies) ermittelt.

Spektrofluorimetrie: Zur Messung intrazellulärer Ca2-Plus-Konzentrationen wurden Neutrophile in RPMI 1640 (Gibco) mit einer Zelldichte von 1 × 106 mL−1 suspendiert. Die Zellen wurden 45 Minuten lang bei 37 Grad und 5 Prozent CO2 mit Fura-2 AM (Promocell, Heidelberg, Deutschland) beladen, gewaschen und in RPMI 1640 (Gibco) resuspendiert. Die Fluoreszenz der Zellen wurde mit einem SAFAS Xenius XC Spectrofluorometer (SAFAS, Monaco) bei den folgenden Wellenlängen bewertet: 340 nm Anregung/510 nm Emission und 380 nm Anregung/510 nm Emission. Fura-2 M ist ein ratiometrischer Farbstoff, der in seiner an Kalzium gebundenen Form bei 340 nm und in seiner ungebundenen Form bei 380 nm angeregt werden kann. Eine Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration würde zu einer erhöhten Fluoreszenz für die an Calcium gebundene Form und zu einer verringerten Fluoreszenz für die ungebundene Form führen. Das Verhältnis 340/380, das zur Berücksichtigung der ungleichen Zellbeladung des Farbstoffs verwendet wurde, wurde mit Microsoft Excel berechnet. Das 340/380-Verhältnis für die nach 2 Stunden mit dem Ionophor Ionomycin behandelten Zellen wurde auf 100 Prozent gesetzt und das Verhältnis für die mit 50 nM [6]-Gingerol behandelten Zellen und die Lösungsmittelkontrolle wurden darauf bezogen.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Die CXCL8-Konzentrationen in den Überständen der Inkubationsexperimente (Abschnitt 4.3) wurden mittels Sandwich ELISA (DuoSet, R&D Systems, bio-techne, Minneapolis, MN, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt.

Statistische Analysen: Alle Experimente wurden mit Zellen von mindestens drei unabhängigen Spendern durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angezeigt, berechnet mit GraphPad Prism 9.0. Für die Analyse statistisch signifikanter Unterschiede wurden zwei Stichproben von Student-T-Tests oder, falls mehr als zwei Variablen verglichen wurden, eine einfache ANOVA gefolgt von einem Tukey-Mehrfachvergleichstest als Post-hoc-Test durchgeführt. Der jeweils verwendete Test ist in der entsprechenden Abbildungslegende angegeben. Ein p-Wert von kleiner oder gleich 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

zusätzliche Informationen

Unterstützende Informationen sind in der Wiley Online Library oder beim Autor erhältlich.

Danksagungen

Die Erklärung zur Datenverfügbarkeit wurde am 20. Februar 2023 hinzugefügt.

Interessenkonflikt

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Autorenbeiträge

GA, DK und VS konzipierten und planten die Experimente; GA und KK führten die Experimente durch; VS betreute das Projekt; GA hat den ersten Entwurf des Manuskripts geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit

Daten sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

Schlüsselwörter

Lebensmittel, Ingwer, Immunsystem, Immunmodulation, polymorphkernige Leukozyten (PMNs).

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