2.6. Expression von Caspase-3 und Caspase-6

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen, reaktive Sauerstoffspezies abzufangen und den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau zu verhindern, und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch freie Thymin-Radikalanionen.

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TgAPP-Mäuse zeigten einen Anstieg der Caspase{{0}}-Genexpression (Abbildung 8C1, H1), der im Vergleich zu den Hippocampi von WT-Mäusen signifikant war und mehr als 30 Prozent betrug (Abbildung 8H1; p < 0,05). Was die Caspase-6-Expression betrifft, wurden keine Unterschiede zwischen transgenen und nicht-transgenen Mäusen beobachtet (Abbildung 8C2, H2).

Quercetin- und Rutin-Behandlungen konnten die Caspase{{0}}-mRNA-Spiegel im Hippocampus auf statistisch signifikante Weise senken (Abbildung 8H1; p < 0.05), mit Hemmungsprozentsätzen von etwa 17 Prozent und 27 Prozent für weibliche bzw. männliche Mäuse. In der Großhirnrinde wurden signifikante Unterschiede nur bei der Behandlung mit Rutin bei Männern beobachtet (Abbildung 8C1; p < 0,05).

In Bezug auf Caspase-6 hatten Quercetin- und Rutin-Behandlungen keine statistisch signifikante Wirkung auf den Kortex oder den Hippocampus (Abbildung 8C2, H2), obwohl Caspase-6 bei TgAPP-Männchen im letzteren Fall dazu tendierte abnehmen (Abbildung 8H2).

2.7. Entzündungsmarker

Die erhaltenen Ergebnisse zur Genexpression der Entzündungsmediatoren IL-1 , TNF- und IFN- sind in Abbildung 9 dargestellt.

Im TgAPP kam es bei beiden Geschlechtern im Vergleich zu WT-Mäusen zu einem signifikanten Anstieg der IL{{0}}-Genexpression von etwa 20 Prozent im Cortex und Hippocampus (Abbildung 9C1, H1; S < 0,05). Was TNF- betrifft, so sind in TgAPP zwar höhere mRNA-Spiegel zu erkennen, diese sind jedoch bei WT-Mäusen statistisch nicht signifikant (Abbildung 9C2, H2). Bei IFN- kam es bei Männern zu einem Anstieg der Expression um etwa 30 Prozent, der nur im Kortex statistisch signifikant war (Abbildung 9C3; p < 0,05).

Behandlungen mit Quercetin und Rutin konnten sowohl bei Frauen als auch bei Männern die IL{{0}}-Expression in der Großhirnrinde und im Hippocampus im Vergleich zu Kontroll-TgAPP-Mäusen verringern (Abbildung 9C1, H1; p < {{8 }}.05), wobei ähnliche Werte wie bei WT-Mäusen erzielt wurden, insbesondere niedrigere Werte im Hippocampi männlicher Mäuse (Abbildung 9H1; p < 0,05).

Die Gesamtwirkung beider Flavonoidbehandlungen auf die IL{{0}}-Expression wurde weder bei TNF- noch bei INF- beobachtet. Somit kam es bei TgAPP-Männern nach der Behandlung mit Quercetin zu einer signifikanten Abnahme der hippocampalen TNF- (Abbildung 9H2; p < 0,05) und der kortikalen IFN-Expression (Abbildung 9C3; p < 0,05).

2.8. Beurteilung degenerierender Neuronen und ihrer Projektionen

In dem Alter, in dem die transgenen TgAPP-Mäuse getestet wurden, wurden im Vergleich zu WT-Mäusen keine charakteristischen Anzeichen einer Neurodegeneration beobachtet, und Behandlungen mit Quercetin und Rutin zeigten 4 Wochen lang keine Veränderung im Vergleich zu TgAPP (Abbildung S1, ergänzende Daten).

2.9. Expression ionotroper Glutamatrezeptoren

Beim Vergleich der Werte der Kontroll-TgAPP-Mäuse mit denen der WT-Mäuse wurden keine signifikanten Unterschiede in der Rezeptorexpression festgestellt. Es gab auch keine nennenswerten Auswirkungen auf die Expression dieser ionotropen Rezeptoren in Gegenwart einer Quercetin- oder Rutin-Behandlung (Tabelle S5, Ergänzende Daten).

3. Diskussion

Der Zweck unserer vorliegenden Studie bestand darin, den Einfluss der beiden Flavonoide Quercetin und Rutin in den ersten Stadien der AD-Pathogenese zu bewerten, unabhängig von ihrer Wirkung auf die Neurodegeneration und/oder die kognitive Funktion. Der Kortex und der Hippocampus waren die Bereiche des Gehirns, die untersucht wurden, da sie die am stärksten betroffenen Gehirnstrukturen bei AD sind. Es sollte berücksichtigt werden, dass Quercetin und Rutin über eine formulierte Diät verabreicht wurden, die eines der beiden Flavonoide enthielt, um in einem AD-Tiermodell die Aufnahme einer gesunden menschlichen Ernährung mit einem Wirkstoff nachzuahmen.

Insbesondere das transgene APPswe in der C57B6-Maus hatte einen signifikanten Einfluss auf das GSH/GSSG-Verhältnis, die MDA-Spiegel, die antioxidative Enzymkapazität, die APP-Expression, die BACE1-Aktivität sowie die Caspase-3- und IL-1-Expression. Während APP-Mutationen beim Menschen im Allgemeinen zu typischer Alzheimer-Krankheit führen, sind sie bei transgenen APP-Mäusen vorwiegend mit einer ausschließlich Amyloid-Pathologie verbunden und es gibt keine erkennbare Neurodegeneration [14,15], da bei unseren transgenen Mäusen im Gegensatz zu TgAPP keine charakteristischen Anzeichen beobachtet wurden die WT-Mäuse (Ergänzende Daten, Abbildung S1). Die Gegenfärbung mit 40 -6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) von Hippocampus-Neuronen ermöglichte uns die Beobachtung der Kernmorphologie, da diese Verbindung ein Fluoreszenzfarbstoff für Nukleinsäuren ist. Wir haben keine fragmentierten oder lobulären Kerne beobachtet, die typischerweise apoptotisch sind; Wir beobachteten auch keine bemerkenswerten Unterschiede beim Vergleich der histologischen Schnitte des Hippocampus der transgenen Kontrolllinie TgAPP hinsichtlich der WT-Schnitte. Auch bei den Kontroll-TgAPP-Mäusen konnten wir keine Unterschiede zwischen den Quercetin- und Rutin-Behandlungen feststellen.

In der Gruppe der zu analysierenden biochemischen Merkmale der Alzheimer-Krankheit konzentrierten wir uns hauptsächlich auf die Bestimmung des GSH/GSSG-Verhältnisses bei einer der beiden Flavonoid-Diäten, da die Erschöpfung des GSH-Spiegels einen der wichtigsten frühen biochemischen Marker bei AD darstellt [16,17]. ] und wurde während seiner Pathogenese und seines Krankheitsverlaufs beobachtet. Die Messung des GSH-Spiegels im Gehirn [18] und in jüngerer Zeit auch des GSH-Spiegels im Blut [19] hat sich als diagnostische Marker für die frühen Stadien der AD erwiesen. Darüber hinaus wurden auch Anstrengungen unternommen, endogene GSH-Speicher durch sich selbst oder ihre Vorläufer zu ergänzen [20–22]. In unserer Studie wurde bei den TgAPP-Mäusen bei WT-Tieren ein Rückgang der zellulären Reduktionskraft (GSH/GSSG) beobachtet, sowohl bei Männern als auch bei Frauen und in beiden Bereichen des Gehirns. Im Kortex und Hippocampus von WT- und TgAPP-Mäusen war das GSH/GSSG-Verhältnis bei Männern niedriger als bei Frauen. Quercetin- und Rutin-Diäten erhöhten das GSH/GSSG-Verhältnis im Vergleich zu unbehandelten TgAPP-Mäusen signifikant, und dieser Anstieg war im Hippocampus stärker ausgeprägt. Die Veränderungen der GSH- und GSSG-Spiegel und des GSH/GSSG-Verhältnisses nach der Behandlung mit Quercetin oder Rutin waren bei Männern im Hinblick auf die Erhöhung der Redoxkraft stärker ausgeprägt als bei Frauen. Die Ergebnisse unserer Bestimmungen könnten eine wichtige Grundlage für geschlechtsspezifische Unterschiede bei Tg2576-Mäusen offenbaren, einerseits in der Anfälligkeit für oxidative Schäden von Makromolekülen, da das Glutathionsystem ein vielseitiges Reduktionsmittel in mehreren biologischen Funktionen ist, und andererseits in der präventiven Wirkung Andererseits können Flavonoid-Diäten ihren physiologischen Status wiederherstellen. Wie wir in dieser Diskussion sehen werden, haben wir den Anstieg des GSH/GSSG-Verhältnisses als Hauptachse festgelegt, die die bei den TgAPP-Mäusen beobachteten Effekte erklären könnte.

Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass das GSH/GSSG-Verhältnis nicht nur als Redoxpuffer, sondern als Hauptregulationsmechanismus fungiert und es Proteinen ermöglicht, ihre native Konformation und Funktionalität zu erreichen, indem sie das Thiol-Disulfid-Gleichgewicht der Zelle streng kontrolliert Proteom. Kurz gesagt, das Glutathionsystem ist für die Erhaltung eines gesunden Proteoms unerlässlich, was zeigt, dass eine Störung der Glutathion-Redox-Homöostase (dh genetisch oder pharmakologisch) die Proteinaggregation aufgrund von Störungen der Wirksamkeit der Autophagie erhöht [23]. Daher könnten Strategien zur Aufrechterhaltung der Glutathion-Redox-Homöostase therapeutisches Potenzial bei Krankheiten haben, die mit Proteinaggregation einhergehen, wie z. B. AD. Eng mit der Erhaltung des Proteoms verbunden ist die Ubiquitin-Proteasom-Abbaumaschinerie, die an der Pathogenese von AD beteiligt ist. Das Proteasom baut selektiv mehrere Substrate ab, die für die Aufrechterhaltung der neuronalen Homöostase, einschließlich des Katabolismus oxidierter und aggregierter Proteine, von entscheidender Bedeutung sind. BACE1 wird ubiquitiniert, und es wurde gezeigt, dass die Blockierung des Ubiquitin-Proteasom-Signalwegs den BACE1-Abbau hemmt und folglich zu einer erhöhten Produktion der enzymatischen Aktivität von BACE1, mehr -Spaltungsprodukt C99 und einem Anstieg von A 1-40 und A { {8}} in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen [10]. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass beide Flavonoide, Quercetin und Rutin, verschiedene Signalwege und molekulare Netzwerke beeinflussen, die mit der Modulation der Proteasomfunktion in Neuroblastomzellen verbunden sind [9]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mit reduziertem Glutathion (GSH) ergänzte Neuronen die Proteasomaktivität wiederherstellten und die Aggregatbildung verringerten [11], da die Proteasomfunktion vom Redoxstatus reguliert wird [24]. Daher steht der Anstieg des GSH/GSSG-Verhältnisses, den die Tiere bei einer Quercetin- oder Rutin-Diät verspürten, mit der zuvor ex vivo nachgewiesenen Modulation des Proteasoms durch Quercetin und Rutin im Einklang.

Wie bereits erwähnt, führt ein Redox-Ungleichgewicht zu stark oxidativ veränderten Proteinen, die dazu neigen, sich anzusammeln und Aggregate zu bilden, was zu einer Beeinträchtigung des Proteasoms führt [25]. Angesichts der entscheidenden Rolle von oxidativem Stress bei der Pathogenese von AD wurden daher Biomarker für oxidativen Stress, einschließlich Lipidperoxidation (MDA-Spiegel) und antioxidative Enzyme, im Kortex und Hippocampus der TgAPP- und WT-Mäuse untersucht. SOD, CAT, GR und GPx sind die wichtigsten antioxidativen Enzyme, die gegen freie Sauerstoffradikale wirken, den Stoffwechsel freier Radikale im Körper regulieren und eine Rolle im System zum Abfangen freier Radikale spielen, indem sie die Zellen im Körper vor Lipidperoxidation schützen . In unserer Studie wurde als Folge der APP-Überexpression eine allgemeine Abnahme der antioxidativen Enzymaktivitäten bei TgAPP-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen beobachtet, was für CAT statistisch signifikant ist. In Übereinstimmung mit den verringerten GSH-Spiegeln war die Lipidperoxidation bei den TgAPP-Mäusen signifikant erhöht. Während die Quelle von oxidativem Stress bei menschlicher Alzheimer-Krankheit hochkomplex und multifaktoriell ist, scheint die bei Mäusen entwickelte Amyloid-Pathologie auszureichen, um den pathologischen Prozess auszulösen, der zu erhöhtem oxidativen Stress im Gehirn führt [26]. Bei mit Rutin behandelten Tieren kam es sowohl bei Männern als auch bei Frauen zu einem Anstieg der CAT-Aktivität im Kortex und der GR-Aktivität im Hippocampus. Nur mit Rutin behandelte Tiere zeigten Veränderungen in der Genexpression von CAT und GR im Kortex und im Hippocampus sowohl bei Männern als auch bei Frauen und bei GPx im Hippocampi weiblicher Mäuse. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass mehrere natürliche Verbindungen die Wechselwirkung zwischen dem Proteasom und der Redoxregulation beeinflussen. Genauer gesagt ist Quercetin ein bekannter Nrf2-Aktivator [27], der antioxidative Eigenschaften durch die Stimulierung der Proteasomfunktion aufweist, eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen oxidativen Stress fördert und eine längere Zelllebensdauer verleiht [28].

Die gewebespezifische Expression von BACE1 ist für die normale APP-Verarbeitung von entscheidender Bedeutung, und seine fehlregulierte Expression könnte eine Rolle bei der AD-Pathogenese spielen. BACE1 wird vorwiegend in Neuronen des Hippocampus, im Kortex und in der Körnerschicht des Kleinhirns exprimiert [10]. Es ist zu beachten, dass frühere Studien gezeigt haben, dass transgene schwedische APP-Mäuse im Steady-State einen signifikant erhöhten A-Spiegel im Gehirn aufwiesen [29], was darauf hindeutet, dass BACE1 eine wesentliche Rolle im amyloidogenen Signalweg bei der AD-Pathogenese spielt und ein gutes therapeutisches Ziel darstellt zur AD-Behandlung. In unserer Studie beobachteten wir eine signifikante Verringerung der BACE1-Aktivität bei Quercetin- und Rutin-Behandlungen, was möglicherweise zur Verringerung der A-Ablagerung bei Mäusen beiträgt. Wir argumentieren, dass Quercetin und Rutin, die nicht nur als BACE1-Inhibitoren des Enzyms wirken, eine Verringerung der BACE1-Aktivität bewirken könnten, die mit einem Anstieg des Verhältnisses GSH/GSSG einhergeht, basierend auf der Hypothese, dass die Wiederherstellung der Proteasomaktivität verbessert wird. In diesem Sinne ist bekannt, dass das Targeting von BACE1-Inhibitoren an der Spaltstelle von APPswe (schwedische Mutation) erfolgt, bevor es die Plasmamembran erreicht, wohingegen APPwt (Wildtyp) in einem frühen Endosom verarbeitet wird, das von der Zelloberfläche ausgeht. Daher wird BACE1, das APPwt spaltet, manchmal vor der APP-Verarbeitung an den BACE1-Inhibitor auf der Zelloberfläche gebunden, das Enzym, das APPswe verarbeitet, jedoch nicht [30]. Aus diesem Grund könnte die fehlerhafte Lokalisierung der APPswe-Prozessierung die Wirksamkeit von Quercetin und Rutin als BACE1-Inhibitoren erheblich verringern. Daher sind wir eher geneigt zu behaupten, dass die Abnahme der BACE-Aktivität in diesem In-vivo-Modell nicht so sehr auf die Hemmung des Enzyms zurückzuführen ist, sondern auf den Anstieg des GSH/GSSG-Verhältnisses. In jedem Fall könnte die verringerte BACE1-Aktivität als mutmaßlicher Versuch interpretiert werden, die Amyloidproduktion in den TgAPP-Mäusen zu reduzieren. Was die bemerkenswerteste Wirkung von Quercetin und Rutin im Hippocampus auf die Abschwächung der BACE1-Aktivität betrifft, ist anzumerken, dass der Kortex eine deutlich höhere Neuronendichte als der Hippocampus aufweist [31] und eine selektive Beeinträchtigung des Proteasoms im pathologischen Phänotyp von AD dazu führt Der Kortex ist anfälliger und betroffener als der Hippocampus [32].

Nachdem wir die Wirkung der Behandlungen auf die Aktivität des BACE1-Enzyms ermittelt hatten, waren wir daran interessiert, dessen Expression zu bewerten. Merkwürdigerweise wurden keine signifikanten Unterschiede in der BACE1-Expression zwischen TgAPP-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen gefunden, und bei der Behandlung mit Quercetin oder Rutin wurden keine merklichen Veränderungen beobachtet. Daher scheint es, dass die Erhöhung der BACE1-Enzymaktivität nicht mit einer Erhöhung der Expression verbunden ist. In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, dass Apelt et al. [14] fanden einen Anstieg der kortikalen BACE1-Aktivität bei Tg2576-Mäusen im Alter zwischen 9 und 13 Monaten, während sich das Expressionsniveau von BACE1-Protein und mRNA mit dem Alter nicht änderte. Darüber hinaus wurden Belege gefunden, die belegen, dass fibrilläres Amyloid A 1–42 anstelle von löslichem Amyloid A 1–42 die BACE1-Proteinexpression hochregulieren kann und daher kleine Änderungen im Verhältnis der Amyloid-Isoformen die Amyloid-Aggregatkonformationen und Zellschäden modulieren können [ 33]. Daher könnte das von uns festgestellte Fehlen einer Änderung der BACE1-Expression bei einer Erhöhung seiner Aktivität für die Prävalenz von löslichem Amyloid A 1–42 gegenüber der fibrillären Amyloid A 1–42-Isoform in unserem Mausmodell TgAPP verantwortlich sein.

Nach der Bestimmung der Genexpression der an der APP-Verarbeitung beteiligten Enzyme untersuchten wir die Wirkung von Quercetin und Rutin auf das Enzym -Sekretase, das an der nicht-amyloidogenen Verarbeitung von APP beteiligt ist. Wir haben uns auf ADAM10 konzentriert, da es die physiologisch wichtigste konstitutive Isoform der -Sekretase ist. ADAM10 wirkt der Entstehung neurotoxischer oligomerer A-Plaques entgegen, indem es APP innerhalb der A-Domäne spaltet, um sAPP und C-terminale Fragmente (-CTF) zu produzieren [34,35]. Obwohl die in unserer Studie festgestellten Veränderungen der ADAM10-Expression statistisch nicht signifikant waren, wurde bei TgAPP-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen eine leichte Abnahme der ADAM10-Expression beobachtet. Vorwiegend zeigte die Rutin-Behandlung eine Tendenz zur Steigerung der ADAM10-Genexpression in beiden untersuchten Gehirnbereichen. Postina et al. [36] zeigten, dass die Hochregulierung von Wildtyp-ADAM10 im Hippocampus eines AD-Mausmodells die sAPP-Sekretion vermittelte, was zur Hemmung der A-Plaque-Erzeugung führte. Die Wirkung von Quercetin wurde in einem Rattenmodell mit Aluminiumchlorid-induzierter AD untersucht und zeigte eine signifikante Steigerung der -Sekretase (ADAM10 und ADAM17) im Hippocampus im Vergleich zu unbehandelten Modellen. Dies weist darauf hin, dass Quercetin das Potenzial besitzt, den nicht-amyloidogenen Signalweg durch die Aktivierung von -Sekretase-Genen zu verstärken [37]. Präklinische Daten untermauern die Hypothese, dass die Erhöhung der sAPP-Spiegel im Gehirn eine potenzielle Strategie zur Verbesserung von AD-bedingten Symptomen und zur Abschwächung synaptischer Defizite darstellt. ADAM10 und BACE1 konkurrieren um die APP-Spaltung, daher könnte eine Potenzierung der ADAM10-Aktivität die neurotoxische Amyloidbildung hemmen. Darüber hinaus kann sAPP die Aktivierung des Stress-JNK-Signalwegs verhindern, was zur Aktivierung der NF-κB-induzierten Phosphorylierungsaktivität führt, was zum Abbau des Proteasoms führt [38]. Dadurch wird die Bildung und Akkumulation krankheitsbedingter Proteinaggregate deutlich reduziert und die zelluläre Proteasomaktivität erhöht, was Hinweise auf eine Funktion von sAPP bei der Regulation der Proteostase liefert [39]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sAPP die Glutamat-AMPA-Rezeptorsynthese und deren Transport spezifisch hochreguliert [40]. In unserer Studie haben wir untersucht, ob der leichte Anstieg der ADAM10-Expression bei der Behandlung mit Rutin einen gewissen Einfluss auf die glutamaterge synaptische Übertragung hat. Wie im Abschnitt „Ergänzende Daten“ gezeigt, wurden bei Quercetin- und Rutin-Diäten keine signifikanten Auswirkungen auf die Expression dieses ionotropen Rezeptors beobachtet, was möglicherweise auf einen schwachen Anstieg der ADAM10-Expression zurückzuführen ist, der für die Hochregulierung des AMPA-Rezeptors nicht ausreicht (Ergänzende Daten). , Abbildung S2 und Tabelle S5).

Es sollte berücksichtigt werden, dass In-vitro-Studien eine große Vielfalt an ADAM10-Substraten gezeigt haben [41] und daher unerwünschte Wirkungen, die durch unspezifisches ADAM10--Targeting erzielt werden, bei der Krebsproliferation, Zelladhäsion und Förderung auftreten können von T-Zellen/NK-Zellen-Vorläufern und Entzündungen usw. [42]. Um diese Einschränkung zu umgehen, schlägt unsere Studie eine Strategie vor, die darauf abzielt, die Freisetzung von sAPP physiologischer zu fördern. Dieser Ansatz könnte auf einer langfristigen Einnahme eines Wirkstoffs (Quercetin oder Rutin) basieren, der über eine gesunde menschliche Ernährung aufgenommen wird. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um herauszufinden, ob der Anstieg von ADAM10 von der Flavonoiddosis abhängig ist und ob die möglichen positiven Auswirkungen die mutmaßlichen Nebenwirkungen überwiegen.

Was die Expression von APPswe betrifft, so wurde zwar durch die Insertion des menschlichen APP-Transgens in das Mausgenom garantiert, dass APPswe von Geburt an überexprimiert wird, es wurde jedoch berichtet, dass die APP-mRNA- und Proteinspiegel im Hippocampus während der Tierentwicklung erhebliche Schwankungen aufweisen und bei Mäusen am höchsten sind asymptomatisch (1-Monate alt) und nimmt ab, wenn vollständige Symptomatik auftritt [43]. Ungeachtet dieses Problems war die APP-Expression sowohl im Kortex als auch im Hippocampus im Vergleich zu der von WT-Mäusen in unserer Studie signifikant höher. Eine weitere Behandlung mit Quercetin oder Rutin konnte diese Expression sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen in beiden Bereichen des Gehirns deutlich reduzieren. Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Augustin et al. überein. [44] untersuchten einen standardisierten Extrakt von Ginkgo biloba (Egb761), der reich an Flavonolen wie Quercetin ist, bei 4- Monaten alten weiblichen TgAPP-Mäusen und stellten verringerte APP-mRNA- und Proteinspiegel fest. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Hochregulierung der APP-Translation bei Tg2576-Mäusen im prodromalen und frühen symptomatischen Stadium erfolgt (45), ist es wahrscheinlich, dass bei unseren TgAPP-Mäusen eine Wiederherstellung der APP-Translation durch Quercetin oder Rutin stattgefunden hat, und zwar wahrscheinlich schon in einem frühen Stadium symptomatisches Stadium, was zu einer Verringerung der kortikalen und hippocampalen APP-, BACE1-Aktivitäts- und Caspase-3-Aktivierung führt.

Darüber hinaus wurde an anderer Stelle berichtet, dass es bei Tg2576-Mäusen (ohne neuronalen Verlust) zu einem Anstieg der Caspase-3-Aktivierung im Hippocampus kommt, wie in unserer Studie festgestellt wurde, zu Beginn der Gedächtnisstörung , zusammen mit einer Reduzierung der dendritischen Stacheln vor der Ablagerung von extrazellulärem Amyloid [46]. Es gibt Belege für eine nicht-apoptotische Rolle von Caspasen im Nervensystem ohne neuronalen Tod [47], und die Caspase-3-Aktivität wurde auf dendritische Dornen lokalisiert, wo sie den Calcineurinspiegel erhöhen kann. Es wird angenommen, dass die durch Calcineurin ausgelöste Dephosphorylierung der GluR1-Untereinheit von AMPA-ähnlichen Rezeptoren wiederum zu einer postsynaptischen Dysfunktion führt. Unsere Werte der Caspase-3-Expression als Folge der Transgenese stimmen mit denen anderer Forscher überein, die über einen Anstieg der Caspase-3-Expression auf der Ebene dendritischer Stacheln im Hippocampus von TgAPP-Mäusen berichteten [48]. Da APP in seiner Aminosäuresequenz drei unterschiedliche Spaltungsstellen für Caspase-3 enthält, von denen sich zwei auf der Ebene der extrazellulären Domäne und eine im intrazellulären C-terminalen Teil des APP-Schwanzes befinden [49], kommt es zur Hydrolyse von APP durch Caspase-3 kann die proteolytische Verarbeitung von APP zugunsten des amyloidogenen Weges verändern [50], was zur Freisetzung eines zytotoxischen, vom C-Terminus abgeleiteten Peptids mit einer Länge von 31 Aminosäuren (C31) führt, z Beispiel [51]. Dies deutet darauf hin, dass, da Caspase-3 die Verstärkung der Freisetzung toxischer Fragmente aus APP vermitteln kann, eine Verringerung der Caspase-3-Expression durch Quercetin oder Rutin die Clearance von aggregiertem Protein ermöglichen könnte. Darüber hinaus haben wir, wie bereits erwähnt, den Einfluss sowohl der Zunahme als auch der Abnahme der Caspase-3-Expression auf die glutamaterge synaptische Übertragung untersucht, basierend auf der Fähigkeit der Calcineurin-aktivierten Caspase-3, die GluR1-Untereinheit zu dephosphorylieren von AMPA-Rezeptoren auf postsynaptischer Ebene. Diese molekularen Modifikationen verändern die glutamaterge synaptische Übertragung und die neuronale Plastizität auf der Ebene der dendritischen Stacheln im Hippocampus [48]. Theoretisch könnte die pharmakologische Hemmung der Caspase-3-Aktivität in TgAPP-Mäusen die AD-ähnlichen Phänotypen vor einem Mechanismus bewahren, der zum synaptischen Versagen führt. Trotz der Steigerung der Caspase-3-Expression in unserer TgAPP-Maus fanden wir jedoch, wie bereits erwähnt, keine signifikanten Unterschiede in der AMPA-Rezeptor-Expression im Vergleich zu der in WT-Mäusen. Es könnte sein, dass die Änderungen in der Caspase-3-Expression nicht deutlich genug sind, um signifikante Modifikationen in der AMPA-Rezeptor-Expression hervorzurufen (Ergänzende Daten, Abbildung S2 und Tabelle S5).

Was die Werte der Caspase-6-Expression betrifft, wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen TgAPP- und WT-Mäusen gefunden. Die Aktivierung von Caspase-6 wurde als wichtiger Vermittler von neuronalem Stress identifiziert, der wichtige Proteine ​​des Zytoskeletts (Tau und -Tubulin) spaltet und so den Ubiquitin-Proteasom-Abbau fehlgefalteter Proteine ​​sowie mehrere Aktin-regulierende postsynaptische Dichte stört Proteine ​​[52]. Die unveränderte Expression von Caspase-6 in unserer Studie stimmt mit dem Fehlen charakteristischer Anzeichen einer Neurodegeneration in dem Alter überein, in dem diese transgenen Mäuse im Vergleich zu den WT-Mäusen untersucht wurden (Ergänzende Daten, Abbildung S1).

Bei AD-Patienten wurde ein deutlicher Anstieg neuroinflammatorischer Mediatoren beobachtet, hauptsächlich im Bereich seniler Plaques [53–55]. Astrozyten sind der Hauptlieferant von GSH für Mikroglia und Neuronen. Bei chronischen Entzündungen und oxidativem Stress setzen Astrozyten toxische Entzündungsmediatoren und freie Radikale frei und beschleunigen so die Aktivierung von Mikroglia und die Neurodegeneration [56]. Es ist erwähnenswert, dass ein verringertes intrazelluläres Glutathion mit der Aktivierung der Entzündungswege p38 MAP-Kinase, Jun-N-terminale Kinase (JNK) und NF-κB in menschlichen Mikroglia und Astrozyten zusammenhängt [57]. In diesem Zusammenhang haben wir beschlossen, die Spiegel von IL-1, IFN- und TNF- in unserem Tiermodell zu quantifizieren und die Wirkung von Quercetin und Rutin auf sie zu bestimmen. Wie bekannt ist, fördert eine Entzündung eine fehlerhafte Verarbeitung von A-Peptid und APP, was die A-Peptid-Aggregation fördert und wiederum die A-Reaktivität verändert [58]. So beobachteten wir in unserer Studie, dass TgAPP-Mäuse im Vergleich zu WT-Mäusen erhöhte mRNA-Spiegel der entzündungsfördernden Mediatoren IL-1, TNF- und IFN- aufwiesen, was zeigt, dass eine Überexpression von APPswe neuroinflammatorische Kaskaden auslösen könnte Es löst eine Reihe molekularer Signalwege in Gliazellen und Neuronen aus, die die Entzündungsreaktion auslösen würden. Quercetin und Rutin konnten die IL-1-Genexpression sowohl bei Männern als auch bei Frauen und den untersuchten Gehirnbereichen abschwächen. Mehrere Belege belegen die entzündungshemmende Wirkung von Quercetin auf ZNS-Ebene, da es die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie dem Kernfaktor Kappa B (NF-κB) [59], der an der Induktion von iNOS beteiligt ist, hemmen kann Daher wird die Freisetzung von Mediatoren wie IL-1, TNF- und IFN- verringert [60]. Bezüglich des Einflusses von GSH auf die Entzündungsreaktion ist zu beachten, dass GSH an der Aufrechterhaltung optimaler Zytokinspiegel beteiligt ist, sodass die Expression proinflammatorischer Zytokine (TNF-, IL-1 und IL -6) sind aufgrund der GSH-Depletion erhöht, wohingegen die Expression entzündungshemmender Zytokine (d. h. IL-10) unverändert blieb. Diese Veränderung der GSH-Homöostase erfolgt aufgrund einer Hochregulierung der NF-κB- und JNK-Signalwege, die der mögliche apoptotische Weg zum neuronalen Zelltod sein könnten [61]. In unserer Studie könnte die Herunterregulierung von NF-κB durch Quercetin und Rutin ein plausibler Mechanismus zur Wiederherstellung der GSH/GSSG-Homöostase und damit die Ursache für das Gleichgewicht zwischen entzündungsfördernden und entzündungshemmenden Zytokinen sein. Da der BACE1-Promotor schließlich über eine NF-κB-Bindungsstelle verfügt, erleichtert die entzündungsinduzierte Aktivierung von NF-κB die Hochregulierung der BACE1-Expression und erhöht anschließend die A-Produktion [62]. Wenn es also zu einer Herunterregulierung von NF-κB bei Quercetin- und Rutin-Diäten kommt, würde die BACE1-Aktivität aufgrund der Freisetzungsregulierung entzündungsfördernder und nicht entzündungshemmender Zytokine abnehmen.

4. Material und Methoden

4.1. Versuchstiere

Als Tiermodell für experimentelle AD wurde eine transgene Maus (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) verwendet, die die schwedische Doppelmutation des menschlichen Amyloid-Vorläuferproteins (hAPP) exprimiert [14]. Die Maus ist eine Knock-in-Heterozygotenlinie, die die menschliche A PP695-Isoform mit der doppelten schwedischen Mutation (K670N/M671L; Lys670→Asn und Met671→Leu) unter der Kontrolle des Hamster-Prion-Protein-Promotors exprimiert [63]. Infolgedessen weist diese Maus Werte des menschlichen Amyloid-Vorläuferproteins (A PP) auf, die sechsmal höher sind als die A PP-Werte einer Maus. Darüber hinaus weist diese Maus höhere Werte von A 40 und A 42 auf. A-Ablagerungen beginnen im Alter von 9 Monaten [63]. Im Hippocampus und Kortex von Tg2576 erfolgt die Expression des APPswe-Transgens hauptsächlich neuronal [64].

Als Negativkontrolle wurden Wildtyp-Mäuse (WT) aus derselben Kolonie [65,66] verwendet. Die Mauskolonie Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) wurde in unserem Labor aus heterozygoten Tg2576-Männchen und Wildtyp-Weibchen entwickelt. Die transgenen Eltern wurden von Dr. Diana Frechilla von der Abteilung für Neurowissenschaften am Zentrum für angewandte medizinische Forschung der Universität Navarra (Pamplona, ​​Spanien) gespendet [67].

Die Tiere wurden in einzeln belüfteten Käfigen gehalten und bei 22–24 °C in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 50–60 Prozent Luftfeuchtigkeit gehalten. Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Complutense-Universität Madrid genehmigt und standen in voller Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, und der spanischen Gesetzgebung zum Tierschutz ( Königlicher Erlass 53/2013, 1. Februar 2013).

4.2. Genotypisierungsanalysen von Mäusen

Die Transgenität wurde innerhalb von 30 Tagen nach der Geburt durch Schwanzbiopsie bestimmt. Genotypisierungsanalysen der Tiere wurden mittels PCR durchgeführt. Da es sich bei Tg2576 (TgAPP) um eine heterozygote Linie handelt, wurde das Insertionsgen (PrP, aus Prionprotein) als positive Reaktionskontrolle verwendet. Genomische DNA wurde aus Mäuseschwänzen extrahiert, die mit Proteinase K (0,1 µg/µL) in NID-Puffer (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50, verdaut wurden mM MgCl2, 0,05 Prozent Gelatine, 0,45 Prozent NP-40 und 0,4 Prozent Tween 20) bei 56 ◦C für 3 Stunden und geschüttelt. DNA-Fragmente wurden mit Isopropanol gefällt und mit 70-prozentigem Ethanol gewaschen. DNA-Präzipitate wurden in 30 µL TE-Puffer (10 mM Tris-1 mM EDTA) gelöst. Die Reinheit und Konzentration der DNA wurden bei 260 und 280 nm bestimmt.

Die PrP- und APP-Gene wurden durch PCR amplifiziert. Die zum Screening der transgenen Mäuse verwendeten Primersequenzen waren wie folgt: PrP vorwärts: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP-Rückseite: GTGGATACCCCCTCCCCCAGCCTAGACC; APP-Rückseite: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Die Schritte der PCR-Reaktion waren wie folgt: Denaturierung bei 94 °C für 90 s, 39 Zyklen bei 60 °C für 60 s und 72 °C für 90 s, dann abschließende Verlängerung bei 72 °C für 7 min.

In allen Fällen wurden Negativkontrollen (ohne DNA-Schimmel) und Positivkontrollen des APP-Gens berücksichtigt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in 1,5-prozentigen Agarosegelen in 0,5X TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) bei 70 V (konstante Spannung) aufgetrennt und anschließend durch Anfärben mit abgebildet GelRed (Millipore).

4.3. Tierbehandlungen

TgAPP-Mäuse und Wildtyp-Wurfgeschwister, beide im Alter von 6–7 Wochen und einem anfänglichen Körpergewicht von 16,2 ± 0,8 g, wurden in die folgenden vier Gruppen randomisiert (n=8/Gruppe): ( a) Unbehandeltes TgAPP; (b) Quercetin-behandeltes TgAPP; (c) Rutin-behandeltes TgAPP; und (d) Unbehandelter Wildtyp. Da sowohl männliche als auch weibliche Mäuse untersucht wurden, wurden zwei Gruppengruppen gebildet. Im Alter von 45 Wochen wurde begonnen, die Mäuse vier Wochen lang mit Quercetin oder Rutin zu behandeln.

Quercetin (3,30,40,5,7-Pentahydroxyflavon) und Rutinhydrat (Quercetin-3-O-Rutinosidhydrat) hatten eine Reinheit von mindestens 95 Prozent und wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Jedes der Flavonoide wurde in einer Standarddiät (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Spanien) in einer Konzentration von 200 ppm aufgenommen, was einer Aufnahme von 30 mg Flavonoid/kg Körpergewicht/Tag entspricht. Die unbehandelten Mäuse erhielten ausschließlich die nicht ergänzte Standardnahrung. Für die ad libitum-Zufuhr wurden Futter und Wasser bereitgestellt.

4.4. Vorbereitung von Hirngewebe für biochemische und histologische Untersuchungen

Am Ende der Behandlung ließ man die Mäuse über Nacht fasten, sie wurden durch Genickbruch eingeschläfert und das gesamte Gehirn wurde schnell entfernt. Das Gehirn wurde in Kochsalzlösung bei 4 °C gespült und die Arachnoidea vorsichtig entfernt. Anschließend wurden Hippocampus und Kortex isoliert. Die Proben wurden sofort bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C gelagert.

Das gesamte Gehirn einiger Tiere wurde für die Gewinnung histologischer Schnitte verwendet. Nach der Euthanasie mittels Zervixluxation wurden die Gehirne durch Eintauchen in Isopentan bei –80 °C eingefroren. Unmittelbar danach wurden koronale Schnitte des Gehirns (30 µm dick) vom Riechkolben bis zum Kleinhirn im Abstand von 120 µm in einem Kryostat (Leica CM1850, Nussloch, Deutschland) angefertigt. Der gesamte Vorgang wurde bei −20 ◦C durchgeführt. Histologische Schnitte wurden auf Objektträgern gesammelt und bis zur Analyse bei –80 °C aufbewahrt (siehe ergänzende Methoden).

4.5. Glutathion

Für Glutathiontests wurden Großhirnrinden- und Hippocampusproben in einem Redox-Löschpuffer mit einer Konzentration von -5 Prozent Trichloridessigsäure (RQB-5 Prozent TCA) (zuvor 15 Minuten lang auf Eis mit N2 durchperlen gelassen) homogenisiert von 25 mg/ml (w/v). Die Proben wurden durch Ultraschallbehandlung für 10 s resuspendiert, dann 10 min lang bei 12,000× g und 4 °C zentrifugiert und die Überstände gesammelt.

Anschließend wurden im erhaltenen Überstand spektrofluorometrische Methoden angewendet, um die GSH- und GSSG-Spiegel unter Verwendung der von Senft et al. beschriebenen o-Phthalaldehyd-Methode zu bestimmen. [68]. Die GSH- und GSSG-Werte wurden hinsichtlich der spontanen Reaktion in Abwesenheit einer biologischen Probe korrigiert. In beiden Fällen wurden die Überstände 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die Fluoreszenz mit einem FLUOSTAR-Mikroplattenlesegerät (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Deutschland) gemessen, wobei der Anregungsfilter auf 360 nm (Bandbreite 5 nm) eingestellt war. und der Emissionsfilter auf 460 nm eingestellt (Bandbreite 5 nm). Die Konzentration von GSH und GSSG in jeder Probe wurde aus bekannten GSH-Standards interpoliert. Die Konzentrationen von GSH und GSSG wurden als nmol GSH/mg Protein ausgedrückt, was die Berechnung des Glutathion-Redox-Verhältnisses GSH/GSSG ermöglichte.

Die verbleibenden Pellets wurden gevortext, bis sie vollständig in 240 µL 0,1 M NaOH gelöst waren, um die Proteinkonzentration mit der Bicinchoninsäure (BCA)-Methode zu messen, wobei Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde.

【Für weitere Informationen:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】