4.6. Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARs)

Der Gehalt an TBARs wurde als Index für die Lipoperoxidation verwendet. Im Hirngewebe wurden 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) bis zu einer Konzentration von 25 mg/ml (Gew./Vol.) zugegeben und die Suspension durch Ultraschallbehandlung für 10 s homogenisiert. Zu 30 µL des Homogenats wurden 250 µL 1-prozentige Phosphorsäure und 75 µL 0,6-prozentige Thiobarbitursäure (TBA) hinzugefügt. Die Reagenzmischung wurde 45 Minuten lang bei 100 °C in einem Wasserbad inkubiert, anschließend in einem Eisbad abgekühlt und dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 3000 × g zentrifugiert. Von jeder Probe wurde ein Volumen von 150 µL Überstand entnommen. Die Fluoreszenz wurde mit einem FLUOSTAR-Mikroplattenlesegerät (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Deutschland) gemessen, wobei der Anregungsfilter auf 485 nm (Bandbreite 5 nm) und der Emissionsfilter auf 530 nm (Bandbreite 5 nm) eingestellt war. Unter Verwendung von Malondialdehyd (MDA) als Standard wurde eine Kalibrierungskurve erstellt. Die Ergebnisse wurden in pmol MDA/mg Protein ausgedrückt.

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen, reaktive Sauerstoffspezies abzufangen und den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau zu verhindern, und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch freie Thymin-Radikalanionen.

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4.7. Enzymatische Aktivität der wichtigsten antioxidativen Enzyme

Zur Bestimmung der Enzymaktivität im Hirngewebe wurde a ein Lysepuffer mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) und Antiproteasen (1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 g/ml Pepstatin und 1 g/ml Leupeptin) zugesetzt Konzentration von 50 mg/ml (w/v). Anschließend wurde die Suspension 30 s lang in einem Eisbad beschallt und das Homogenat 15 min lang bei 4 °C und 10,000× g zentrifugiert. Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der antioxidativen Enzyme wurden Überstände gesammelt.

Die Aktivität der Superoxiddismutase (SOD) wurde gemessen, indem die Hemmung der Pyrogallol-Autoxidation bei 420 nm verfolgt wurde [69]. Eine Enzymeinheit wurde als die Enzymmenge definiert, die erforderlich ist, um die Geschwindigkeit der Pyrogallol-Autoxidation um 50 Prozent zu hemmen. Die SOD-Enzymaktivität wurde in internationalen Einheiten (IE)/mg Protein ausgedrückt. Die Katalase (CAT)-Aktivität wurde in mit Triton-X-100 (1 Prozent, v/v) behandelten Überständen gemessen, indem das Verschwinden von Wasserstoffperoxid (H2O2) bei 240 nm verfolgt wurde [70], und die Enzymaktivität wurde als Substrat angegeben ( µmol H2O2) transformiert/min · mg Protein. Die Gesamtglutathionperoxidase (GPx) wurde nach NADPH-Oxidation bei 340 nm in Gegenwart von überschüssigem GR, GSH und Cumolhydroperoxid bestimmt [71]. Die GPx-Aktivität wurde als transformiertes Substrat (nmol NADPH/min mg Protein) ausgedrückt. Die Aktivität der Glutathionreduktase (GR) wurde nach NADPH-Oxidation bei 340 nm in Gegenwart von GSSG analysiert [72] und als transformiertes Substrat (nmol NADPH)/min · mg Protein ausgedrückt. GR- und beide GPx-Aktivitäten wurden hinsichtlich der spontanen Reaktion in Abwesenheit biologischer Proben (in Abwesenheit von Enzymen) korrigiert.

4.8. BACE1-Aktivitätstest

Das BACE1-Testprotokoll beinhaltet die Verwendung eines Sekretase-spezifischen Substrats (Peptids), das an zwei Reportermoleküle, nämlich EDANS und DABCYL, konjugiert ist, was zur Freisetzung eines Fluoreszenzsignals führt [73,74]. Die BACE1-Aktivität wurde sowohl im Kortex- als auch im Hippocampus-Lysat gemessen. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 37 °C unter Verwendung von 10 µM Substrat in 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,5) durchgeführt. Fluoreszenzintensitätsmessungen wurden mit einem FLUOSTAR-Mikroplattenlesegerät (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Deutschland) durchgeführt, wobei der Anregungsfilter auf 360 nm (Bandbreite 5 nm) und der Emissionsfilter auf 530 nm (Bandbreite 5 nm) eingestellt war. Der Grad der Sekretase-Enzymaktivität ist proportional zur fluorometrischen Reaktion, und die Daten werden als x-facher Anstieg der Fluoreszenz gegenüber Hintergrundkontrollen (Reaktionen ohne Substrat oder Gewebe) ausgedrückt. Die BACE1-Aktivität wurde mit der Proteinkonzentration normalisiert. Die BACE1-Aktivität der mit Quercetin oder Rutin behandelten Mäuse wurde als Prozentsatz der Aktivität der TgAPP-Kontrollmäuse ausgedrückt.

4.9. RT-PCR-Genexpression der wichtigsten antioxidativen Enzyme APP, BACE1, ADAM10, Caspase-3 und Caspase-6 und entzündlicher Zytokine

4.9.1. Gesamt-RNA-Extraktion und -Reinigung

Wir haben die verschiedenen Bereiche des Gehirns, nämlich den Kortex und den Hippocampus, analysiert, die bei −80 ◦C gelagert wurden. Zu einer bekannten Menge Hirngewebe wurde Triomol®-Lysepuffer im Verhältnis 1:10 (Gew./Vol.) hinzugefügt. Die Proben wurden 30 Sekunden lang mit einem Akku-Motor (Pellet-Pistill, Sigma-Aldrich) homogenisiert und 5 Minuten lang bei 25 °C inkubiert, um eine vollständige Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu ermöglichen. Dann wurden 0,2 ml Chloroform für jeden verwendeten ml Triomol®-Lysepuffer hinzugefügt. Die Röhrchen wurden 15 Sekunden lang kräftig geschüttelt und 3 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurden sie 15 Minuten lang bei 4 °C und 11,000× g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden drei Phasen erhalten, mit RNA in der oberen Phase.

Um die RNA zu isolieren, wurde die obere Phase in ein anderes Röhrchen überführt und durch Zugabe von 0,5 ml Isopropanol präzipitiert. Nach gründlichem Mischen von Isopropanol und wässriger Lösung durch Inversion wurde die Mischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Ausfällung zu fördern, und 10 Minuten lang bei 4 °C und 12,000×g zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und die Pellets mit 75-prozentigem Ethanol gewaschen und 5 Minuten lang bei 4 °C und 7500 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden bei Raumtemperatur getrocknet und in 50 µL DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Um DNA-Spuren zu entfernen, wurden 2,5 µL DNase (RNase-frei) hinzugefügt und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Abschließend wurden die Proben 5 Minuten lang bei 64 °C inkubiert, um die DNase zu inaktivieren.

Anschließend wurden die RNA-Konzentrationen in einem UV-VIS-Spektrophotometer (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Deutschland) bei 260 nm gemessen und die Reinheit unter Berücksichtigung des Absorptionsverhältnisses bei 260 und 280 nm (A260/A280) beurteilt.

Die Bestimmung der RNA-Integrität und -Reinheit erfolgte durch Elektrophorese in einem 1-prozentigen Agarosegel, das mit GelRed gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht wurde. Bei intakter RNA zeigten sich zwei obere Banden, die ribosomaler RNA (28S und 18S) entsprachen, und zwei untere Banden entsprechend Transfer-RNA (tRNA) und 5S-ribosomaler RNA beobachtet werden.

4.9.2. Komplementäre DNA (cDNA)-Synthese

cDNA ist viel stabiler als RNA und ermöglicht daher eine bequemere und sicherere Probenhandhabung. Die cDNA wurde aus mRNA durch Retrotranskription unter Verwendung des First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-qPCR (Fermentas Life Sciences) synthetisiert.

Um die Retrotranskription für die cDNA-Synthese auf 2 µg RNA durchzuführen, wurden 11 µL DEPC-behandeltes Wasser und 1 µL 10X Random Primer hinzugefügt. Anschließend wurde die Mischung 10 Minuten lang bei 65 °C inkubiert, um die RNA zu denaturieren. Nach dieser Zeit wurden die Röhrchen sofort für 5 Minuten auf 4 °C gebracht, um eine Renaturierung der RNA zu vermeiden. Der Reagenzienmix für die cDNA-Synthese ist in Tabelle S1 (Ergänzende Daten) aufgeführt.

Zu jeder Probe wurden acht µL der Reaktionsmischung hinzugefügt. Das gesamte Volumen wurde auf den Boden der Röhrchen gebracht und 60 Minuten lang bei 42 °C inkubiert. Abschließend wurde die Reaktion gestoppt, indem die Reverse Transkriptase durch 10-minütiges Erhitzen auf 70 °C inaktiviert wurde.

4.9.3. Echtzeit-PCR

Das Hauptmerkmal der Echtzeit-PCR besteht darin, dass die Analyse der Produkte während des Amplifikationsprozesses durch Bestimmung der Fluoreszenz erfolgt. Auf diese Weise finden die Amplifikations- und Detektionsprozesse gleichzeitig im selben Röhrchen oder Fläschchen statt, ohne dass weitere Maßnahmen erforderlich sind. Für die Echtzeit-PCR werden Thermocycler eingesetzt, die gleichzeitig Fluoreszenz verstärken und nachweisen können. Wir verwendeten den Echtzeit-Thermocycler LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland).

Tabelle S2 (Ergänzende Daten) listet die für die Echtzeit-PCR erforderlichen Reagenzien auf, wobei sequenzspezifische Primer und DNA-bindender Farbstoff (SYBR Green I, Roche Molecular Systems, Inc., Rotkreuz, Schweiz) als Nachweissystem verwendet werden.

Für das Design der Primer für die verschiedenen quantifizierten Marker wurde das Bioinformatikprogramm Primer3Plus verwendet, für das wir die cDNA-Sequenzen der interessierenden Gene aus der Open-Access-Datenbank Medline entnommen haben. Die Primer wurden von Merck (Sigma-Aldrich) geliefert. Die Hybridisierungstemperatur und die Sequenz der verschiedenen verwendeten Primer sind in Tabelle S3 (Ergänzende Daten) aufgeführt.

Die Reaktionsbedingungen für die Amplifikation der interessierenden Gene sind in Tabelle S4 (Ergänzende Daten) aufgeführt.

Abschließend wurden die Proben einem Schmelzprogramm unterzogen: 95 °C für 15 s, 65 °C für 3 0 s und bis zu 98 °C mit einer Geschwindigkeit von 0,1 °C/s mit kontinuierlicher Fluoreszenzaufzeichnung.

Zur Quantifizierung der cDNA-Spiegel wurde die Vergleichsmethode des Zyklusschwellenwerts (Ct) [75] verwendet, wobei GADPH als Haushälterin verwendet wurde. Die Amplifikation des Housekeepers erfolgte parallel zum analysierten Gen. Die Ct-Werte wurden mit der Software 4.0 von LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) berechnet. Die Software ermöglicht die Unterscheidung zwischen Fluoreszenz aufgrund der Probenverstärkung und Hintergrund. Es wurden auch Schmelzkurven aufgezeichnet. Die Bestimmung der Schmelztemperatur des amplifizierten Fragments ermöglichte die Charakterisierung des amplifizierten Produkts. Die Größe der Banden wurde auf einem 1,5-prozentigen Agarosegel überprüft.

Die Variation der Expression des untersuchten Gens mit der Quercetin- oder Rutin-Behandlung wurde als Funktion des Kontroll-TgAPP (Mäuse ohne Behandlung) und der Normalisierung dieser Expression mit den GADPH-Spiegeln ausgedrückt. Die Änderungsfalte (2−∆∆Ct) gibt an, wie oft das interessierende Gen unter der jeweiligen Behandlung der Kontrollmäuse verändert wird.

4.10. Statistische Analysen

Alle Tests wurden mindestens doppelt und in drei verschiedenen Experimenten durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler ausgedrückt. Eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) wurde durchgeführt, sobald die Daten getestet wurden und gezeigt wurde, dass sie einer Normalverteilung entsprechen. Die Newman-Keuls-Mehrfachvergleichs-Post-hoc-Tests wurden durchgeführt, um mittlere Unterschiede zwischen Gruppen zu untersuchen. Werte von p < 0.05 wurden als signifikant angesehen. Für statistische Analysen wurde die Software SigmaPlot 11.0 verwendet.

5. Schlussfolgerungen

Ernährungsgewohnheiten und Nahrungsergänzung können den zellulären Redoxstatus beeinflussen. Auf dieser Grundlage wollten wir die zelluläre Redox-Homöostase in einem AD-Mausmodell mit einer Flavonoid-Diät, die Quercetin oder Rutin enthält, verbessern, um die Amyloid-Pathologie zu lindern, wobei wir das Zusammenspiel zwischen zellulärem Redox-Status und Proteasom-abhängigen Amyloid-Merkmalen bei asymptomatischer AD berücksichtigten. Unsere Datensätze sind relevant, da die im TgAPP-Mausmodell gezeigten Flavonoidwirkungen mit denen übereinstimmen, die zuvor in unseren In-vitro- und Ex-vivo-Modellen berichtet wurden.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass der Beginn einer Diätbehandlung im asymptomatischen Stadium oder beim Einsetzen AD-ähnlicher Symptome den zellulären Redoxstatus und die physiologische APP-Verarbeitung durch gleichzeitige Regularisierung der APP-Expression und der BACE1-Aktivität wiederherstellen könnte.

Obwohl es schwierig ist, unsere Erkenntnisse auf den menschlichen Zustand zu übertragen, könnten sie weitreichende Auswirkungen auf die Reaktion des Menschen auf zukünftige Therapeutika haben. Von den beiden Flavonoiden scheint Rutin mit insgesamt ausgeprägteren In-vivo-Wirkungen am besten geeignet zu sein, als adjuvante Therapie bei AD in die tägliche Ernährung aufgenommen zu werden, da es auf der Steigerung der intrazellulären Redoxhomöostase des Gehirns basiert.

Zusatzmaterialien:Die folgenden unterstützenden Informationen können auf der Website heruntergeladen werden. Referenz [76] wird in den ergänzenden Materialien zitiert.

Autorenbeiträge:PB-B. und SM-A. konzipierte die Idee und den Versuchsaufbau, half bei den Experimenten, interpretierte die erzielten Ergebnisse und verfasste das Manuskript. KLJ-A. führte die Experimente durch, führte die Datenanalysen durch und interpretierte die erhaltenen Ergebnisse. JB half bei der Datenanalyse und der Überarbeitung des Manuskripts. Alle Daten wurden intern generiert und es wurde keine Papierfabrik genutzt. Alle Autoren erklären sich damit einverstanden, für alle Aspekte der Arbeit Verantwortung zu übernehmen und Integrität und Genauigkeit sicherzustellen. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung:Diese Forschung wurde von der Medizinischen Forschungsstiftung „Mutua Madrileña“ (vierte Ausgabe der Zuschüsse für medizinische Forschungsprojekte), dem spanischen Ministerium für Bildung und Wissenschaft (Ref. AGL2008-04892-C03-02) und dem finanziert Spanisches Ministerium für Wissenschaft und Innovation (Ref. CTQ2010-16170).

Erklärung des Institutional Review Board:Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Complutense-Universität Madrid genehmigt und standen in voller Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, und der spanischen Gesetzgebung zum Tierschutz ( Königlicher Erlass 53/2013, 1. Februar 2013).

Einverständniserklärung:Unzutreffend.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit:Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Danksagungen:Wir danken der Foundation Folch für ein Vordoktorandenstipendium an KLJA.

Interessenskonflikte:Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Abkürzungen

AD, Alzheimer-Krankheit; ADAM-10, ein Disintegrin- und Metalloproteinase-Domänen-enthaltendes Protein 10; APP, Amyloid-Vorläuferprotein; APPswe, schwedische Mutation des Amyloid-Vorläuferproteins; A, Amyloid-; BACE1, APP-spaltendes Enzym 1 an der Stelle; CAT, Katalase; GPx, Glutathionperoxidase; GR, Glutathionreduktase; GSH, reduziertes Glutathion; GSSG, oxidiertes Glutathion; SOD, Superoxiddismutase.

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