Ein homozygoter Dab1−// ist eine potenzielle neue Ursache für autosomal-rezessive angeborene Anomalien der Niere und des Harntrakts von Mäusen

edmund.chen@wecistanche.com

Einführung

Mutierte Yotari-Mäuse, die durch spontanen Erwerb einer Mutation im Dab1-Gen erhalten wurden, weisen histologische Anomalien im zentralen Nervensystem auf [1,2], die denen von Reeler-Mäusen (Reelin//) sehr ähnlich sind, was darauf hindeutet, dass Reelin und DAB1 dazu gehören denselben Signalweg [1–4]. Es wurde berichtet, dass die Aberrationen im Reelin/DAB1-Signalweg mit verschiedenen psychiatrischen Störungen assoziiert sind [5–7]. Interessanterweise wurde das Vorhandensein von DAB1- und Reelin-Proteinen neben dem Zentralnervensystem auch im peripheren Nervensystem und einigen extraneuralen Geweben bestätigt. Das Vorhandensein von DAB1 wurde in Maus-Podozyten [8] und menschlichen Föten gefundenNieren[9] während Reelin-Expression während der fötalen Entwicklung von Mäusen und Menschen sowie in einigen Endothelzellen entlang von Blutgefäßen bei erwachsenen Mäusen berichtet wurde [9–11]. Der kanonische Reelin/DAB1-Weg kann bestimmte nachgeschaltete Proteine ​​auslösen, einschließlich NOTCH2-Rezeptoren, die eine entscheidende Rolle bei Entscheidungen über das Schicksal von Zellen und deren Differenzierung spielenNiereEntwicklung [12–14]. NOTCH2-Rezeptoren werden benötigt, um proximale Tubuli und Podozyten zu bilden [13], aber sobald die Nephronreifung erreicht ist, wird dieser Weg größtenteils zum Schweigen gebracht [15]. Bei akuten ZuständenNierenerkrankungen,eine erhöhte Expression von NOTCH2 kann möglicherweise zur Regeneration beitragen, während eine anhaltende Expression kausal mit interstitieller Fibrose und Glomerulosklerose assoziiert ist [15]. Die Herunterregulierung der NOTCH-Signalgebung kann die Autophagie stark verringern und eine Beeinträchtigung der Podozytendifferenzierung während der Entwicklung verursachen [16].

Folglich spielen dysfunktionale Podozyten eine entscheidende Rolle bei glomerulären Erkrankungen, insbesondere beim humanen idiopathischen nephrotischen Syndrom [17,18] und beim nephrotischen Syndrom mit minimaler Veränderung (MCNS) [19]. Daher hält die Autophagie die zelluläre Homöostase unter normalen physiologischen Bedingungen aufrecht, während sie unter pathologischen Bedingungen zum autophagischen Tod fortschreiten kann [20]. Ein weit verbreiteter Autophagie-Biomarker ist LC3B, ein Strukturprotein autophagosomaler Membranen [21]. Die komplexe Wechselwirkung zwischen Autophagie und Apoptose trägt auch zur Aufrechterhaltung des homöostatischen Gleichgewichts als Reaktion auf die Mikroumgebung der Zelle bei. Es ist bekannt, dass apoptotische Ereignisse währenddessen an Zahl zunehmenNiereEntwicklung [22] und nimmt stark ab, sobald die Reifung vorbei ist, außer unter Bedingungen vonNierenverletzung[23]. Apoptose ist unbestreitbar ein komplexer Mechanismus, der durch das Zusammenspiel mehrerer Wege reguliert wird, aber meistens mit der Aktivierung von Caspase3 (CASP3) endet, deren Aktivierung einer der am häufigsten verwendeten Marker für den Nachweis von Apoptose ist [23].

In diesem Bericht wollten wir analysieren, wie die funktionelle Stummschaltung des Dab1-Gens einen Einfluss hatNiereMorphologie und die Expression und Lokalisierung von Reelin, NOTCH2, LC3B und gespaltenen CASP3-Proteinen in postnatalen MäusenNieren. Wir nehmen an, dass diese Proteine ​​in der postnatalen Maus exprimiert werdenNiere,und ihr funktionelles Zusammenspiel trägt zur Erhaltung ihrer Struktur und Funktion bei. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von DAB1 während des fötalen Menschen bestätigtNiereEntwicklung [9], könnte vermutet werden, dass seine Inaktivierung Störungen bei einem breiten Spektrum angeborener Anomalien des M. hervorrufen kannNiereund Harnwege (CAKUT).

Schlüsselwörter:Yotari; Nierenfunktion; postnatale Nierenentwicklung; Immunfluoreszenzfärbung; Transmissionselektronenmikroskopie

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN

Materialen und Methoden

BeispielsammlungAls konventionelle Dab1-Null-Mutanten verwendeten wir Yotari (Dab1/)-Mäuse, die zuvor von Howell et al. [24]. Die für die Genotypisierung der Mäuse verwendeten PCR-Primer waren Yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT und CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, Wildtyp des Dab1-Locus: GCCCTTCAGCATCACCATGCT und CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. C57BL/6 N-Mäuse wurden in Standard-Polycarbonatkäfigen (einschließlich mindestens einer von jedem Genotyp) mit unbegrenztem Zugang zu Nahrung und Wasser in einem temperaturgeregelten (23 ± 2 °C) Raum mit 12 h Licht/ dunkler Kreislauf. An den postnatalen Tagen 4, 11 und 14 (P4, P11 und P14) wurden die Mäuse tief mit Pentobarbital anästhesiert und für 10 min transkardial mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) und 4 Prozent Paraformaldehyd (PFA) perfundiert ) in 0,1 M PBS.Nierenwurden entfernt und mit 4 % PFA in 0,1 M PBS über Nacht für herkömmliche histologische Analysen (Hämatoxylin-Eosin (H&E), immunhistochemische und Immunfluoreszenzfärbung) und in einer Mischung aus 2 % PFA plus 2,5 % Glutaraldehyd (GA) fixiert zur elektronenmikroskopischen Untersuchung. Nach der Fixierung wurde das Gewebe für die weitere histologische Untersuchung präpariert, wie wir zuvor beschrieben haben [25,26].

Immunfluoreszenz und Immunperoxidase-FärbungNach der Entparaffinierung und Rehydrierung wurden die Schnitte für 20 min in 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) in einem Wasserdampfer erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Blockierungspuffer (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) wurde für 30 min aufgetragen, um eine unspezifische Färbung auszuschließen. Die Schnitte wurden dann über Nacht in einer Feuchtigkeitskammer mit primären Antikörpern inkubiert (Tabelle 1). Nach dem Waschen in PBS wurden Sekundärantikörper (Tabelle 1) für eine Stunde aufgebracht und erneut in PBS gewaschen. Dann wurden die Zellkerne mit 4060 -Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 2 Minuten gefärbt, in PBS gewaschen und mit einem Deckglas versehen. Wir haben den Präadsorptionstest so durchgeführt, dass jeder primäre Antikörper mit dem entsprechenden Peptid verwendet wurde, und ihre Kombination auf die Schnitte aufgetragen. Die Ergebnisse zeigten keine Antikörperfärbung. Zusätzlich wurden Kontrollen unter Weglassen des primären Antikörpers durchgeführt, um die Grade der unspezifischen Bindung von sekundären Antikörpern zu bestimmen.

Für die Immunperoxidase-Färbung wurde polyklonales Kaninchen-Anti-CASP3 (1:100-Verdünnungen, ab13847, Abcam, Cambridge, UK) als primärer Antikörper für eine Stunde in einer Feuchtigkeitskammer nach der Behandlung des Schnitts mit 0,1 aufgetragen Prozent H2O2. Nach dem Waschen in PBS wurde ein sekundärer Nachweis unter Verwendung des Link und Streptavidinperoxidase jeweils für fünfzehn Minuten (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) und Diaminobenzidin (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369) durchgeführt, sorgfältig kontrolliert, um eine Überfärbung des Hintergrunds zu vermeiden. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin gefärbt, 10 min in Leitungswasser gespült, in aufsteigenden Reihen von Ethanollösungen kurz dehydriert und eingedeckt.

Gewebepräparation für das Transmissionselektronenmikroskop (TEM)Nach Fixierung mit einer Mischung aus 2 % PFA und 2,5 % GA in 0,1 M PBS für 2 h wurden die Proben mit PBS gewaschen und in einer wässrigen Lösung von 2 % Osmiumtetroxid für 2 h nachfixiert. Alle Proben wurden zweimal in PBS gewaschen, in aufsteigenden Ethanolgraden dehydriert und in Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK) eingebettet. Serienschnitte (70 nm dick) wurden auf einem Ultracut UCT-Ultramikrotom (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) geschnitten und mit 1 Prozent Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt.

Datenerfassung und AnalyseDie Analyse wurde mit einem Auflichtfluoreszenzmikroskop (Olympus BX51, Tokio, Japan), ausgestattet mit einer DP71 Digitalkamera (Olympus), einem JEM 1400 Transmissionselektronenmikroskop (JEOL, Tokio, Japan), betrieben bei 80 kV, durchgeführt und mit einem JEOL Ladungsmikroskop fotografiert. Coupled Device (CCD) Kamerasystem (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, USA) und schließlich ein Hellfeldmikroskop (BX40, Olympus, Tokio, Japan). Alle analysierten Bilder wurden mit ImageJ-Software und Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA) verarbeitet. Pro untersuchter Gruppe verwendeten wir drei bis vier Tiere. Alle gesammeltNierenwurden bei 5 &mgr;m dicken Abschnitten und maximal geschnittenNiere length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, was auf eine hervorragende Übereinstimmung hinweist [27].

Statistische AnalyseEin zweiseitiger t-Test wurde durchgeführt, um die Unterschiede im durchschnittlichen Durchmesser zwischen PCT, DCT und G von Wildtyp- und Yotari-Tieren zu analysieren. Der Durchmesser wurde als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0="" festgelegt.05.="" ein="" zweifacher="" anova-test,="" gefolgt="" von="" tukeys="" multiplem="" vergleichstest,="" wurde="" verwendet,="" um="" die="" unterschiede="" im="" prozentsatz="" positiver="" zellen="" zwischen="" pct,="" dct="" und="" glomeruli="" zu="" allen="" zeitpunkten="" zu="" untersuchen.="" der="" prozentsatz="" positiver="" zellen="" wurde="" als="" mittelwert="" ±="" standardfehler="" des="" mittelwerts="" (sem)="" ausgedrückt.="" das="" signifikanzniveau="" wurde="" auf="" p="">< 0,05="" festgelegt.="" die="" analyse="" wurde="" in="" der="" graphpad-software="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="" usa)="">

Ergebnisse

Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E) und Messung des NierendurchmessersH&E-Färbung von Mittelsagittalschnitten desNierenZu allen untersuchten Zeitpunkten hebt sich das Kleine hervorNierePhänotyp von Yotari-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp (Abbildung 1a). Bei 4P bedeutenNiereDurchmesser von Yotari-Tieren war etwa 55 µm als etwa 75 µm. Außerdem machte sich dieser Unterschied zu späteren Zeitpunkten aufgrund des langsameren Wachstums bemerkbarNierenin yotari im Vergleich zum fortschreitenden Wachstum derNierenbei Wildtyptieren. Um festzustellen, ob die Reduzierung insgesamtNiereGröße durch eine Abnahme der Nephronsegmentgröße verursacht wurde, haben wir den Durchmesser von PCT, DCT und G pro Gruppe gemittelt. Tatsächlich gab es eine Abnahme des mittleren Durchmessers G, PCT und DCT in der Yotari-Gruppe im Vergleich zum Wildtyp (Abbildung 1b, p < 0,05).="" zusätzlich="" zeigte="" die="" h&e-färbung="" eine="" dünnere="" kortikalis="">Nieren-Beckenverlängerung bei Yotari-Tieren und leicht diffus dilatierte DCT bei 14P. Die Grundstruktur und das Muster der glomerulären Reifung sind in beiden untersuchten Tiergruppen gleich.

Beschreibende histologische Analyse basierend auf TEM-MikrofotografienAuf Mikrofotografien Die durch TEM erhaltenen Glomeruli von Wildtyp-Mäusen zeigten das typische Erscheinungsbild aller Teile der Fifiltrationsbarriere, die normal entwickelt und erkennbar waren (Abbildung 2a). Podozyten, Podozytenfußfortsätze und -stiele, Fifiltrationsschlitze, glomeruläre Basalmembranen und das Kapillarlumen mit dem gefensterten Endothel waren leicht zu unterscheiden (Abbildung 2a). Andererseits konnten in den Glomeruli von Yotari-Mäusen fortschreitende Podozytenschäden mit Auslöschung des Fußfortsatzes und fehlenden Fifiltrationsschlitzen beobachtet werden (Abbildung 2b–d). Diese ultrastrukturellen Veränderungen wurden insgesamt beobachtetNierenuntersucht und betraf die meisten der untersuchten Glomeruli. Bei der PCT oder DCT von Yotari-Mäusen wurden keine Anomalien festgestellt als bei Wildtyp-Tieren (Abbildung 2e – h). In der PCT waren die Zellgrenzflächen aufgrund der Unregelmäßigkeit der Zellmembranen und der Zellverzahnung mit ihren Nachbarn schlecht definiert. Das Zytoplasma war reichlich vorhanden und enthielt gut ausgeprägte Kerne, längliche Mitochondrien, basale Einfaltungen und viele röhrenförmige Gruben zwischen Mikrovilli, die einen Bürstensaum an der apikalen Membran bildeten. Eine stärkere Vergrößerung zeigte die apikale Oberfläche von PCT-Epithelzellen, die lange Mikrovilli enthielten, um den Bürstenrand und enge Verbindungen zwischen den luminalen Zellrändern benachbarter tubulärer Epithelzellen zu bilden (Abbildung 2e,f). Andererseits enthielt die apikale Oberfläche von DCT-Epithelzellen wenige kurze Mikrovilli und zahlreiche Vesikel (Abbildung 2g,h).

Abbildung 2. Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Mikrofotografien von Wildtyp und YotariNierenGlomeruli von Wildtyp-Tieren (a) zeigten eine normal entwickelte Fifiltrationsbarriere mit gefenstertem Endothel (E) der Kapillare (C), Basalmembran (BM), Podozyten (P) mit Pedikeln (PE) und Fifiltrationsschlitzen (FS). ). In demNierenBei den Yotari-Tieren war das Auslöschen der Stiele und das Fehlen von Fifiltrationsschlitzen zu bemerken (Sternchen, b–d). In den proximalen gewundenen Tubuli (PCT) oder distalen gewundenen Tubuli (DCT) von Yotari-Mäusen wurden im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren keine Anomalien festgestellt (e–h). In der PCT war das Zytoplasma reichlich vorhanden und enthielt gut ausgeprägte Kerne (N), längliche Mitochondrien (M), basale Einfaltungen (BI) und viele röhrenförmige Vertiefungen (TP) zwischen Mikrovilli, die einen Bürstensaum (BB) bildeten apikale Membran (e, f). Eine stärkere Vergrößerung zeigte die apikale Oberfläche von PCT-Epithelzellen, die lange Mikrovilli enthielten, um den Bürstensaum und die Tight Junctions (TJ) zwischen den luminalen Zellrändern benachbarter tubulärer Epithelzellen zu bilden (e, f). Andererseits enthält die apikale Oberfläche von DCT-Epithelzellen wenige kurze Mikrovilli und zahlreiche Vesikel (g, h). Der Maßstabsbalken in Bildern (a–d) und Einsätzen (e–h) beträgt 1 µm; Der Maßstabsbalken in den Bildern (e–h) beträgt 2 µm.

Lokalisierung und Kolokalisierung von Reelin und DAB1Reelin wurde zu allen beobachteten Zeitpunkten in den Glomeruli und DCT aller untersuchten Tiere schwach mit leichter bis mäßiger Reaktivität (Tabelle 2) exprimiert (p < 0.05,="" abbildung="" 3a).="" nur="" in="" der="" pct="" von="" yotari-mäusen="" war="" der="" prozentsatz="" positiver="" zellen="" signifikant="" höher="" als="" bei="" wildtyp-tieren="" (p="">< 0,05,="" abbildung="" 3a).="" in="" den="" glomerulären="" zellen="" war="" die="" lokalisierung="" der="" färbung="" perinukleär,="" während="" sie="" in="" pct="" und="" dct="" über="" das="" gesamte="" zytoplasma="" verstreut="" war="" (abbildung="" a,="">

Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung von postnatalen YotariNierenmit Reelin-Marker (a) und doppelter Immunfluoreszenzfärbung des postnatalen WildtypsNierenmit DAB1- und Reelin-Markern (b). (a,b) Kern-DNA-DAPI-Färbung fusioniert mit DAB1 und Reelin-Immunfluoreszenz wird parallel gezeigt (Merge). Beobachtete Zeitpunkte waren P4, P11, P14. Die Expression der untersuchten Marker in den Glomeruli (G), proximalen gewundenen Tubuli (PCT) und distalen gewundenen Tubuli (DCT) ist mit den Pfeilen markiert, während Sternchen die Expression des Reelin in der extrazellulären Matrix (a) anzeigen. Einfügungen zeigen den markantesten Ausdruck im Bild. Die DAPI-Kernfärbung zeigte eine schlechte Kolokalisation von DAB1 und Reelin, hauptsächlich in der DCT (Pfeilspitze). Der Maßstabsbalken beträgt 20 µm und bezieht sich auf alle Bilder.

Es gab fast keine Immunreaktivität von DAB1 in Glomeruli und PCT von Wildtyp-Tieren bei P4, während der Prozentsatz positiver Zellen mit leichter Reaktivität (Tabelle 2) bei P11 und P14 signifikant anstieg (p < 0,05,="" abbildung="" 3b).="" in="" der="" dct="" wurde="" dab1="" hauptsächlich="" an="" den="" apikalen="" und="" lateralen="" teilen="" der="" zellmembranen="" (abbildung="" 4b)="" mit="" starker="" reaktivität="" (tabelle="" 2)="" exprimiert.="" der="" anteil="" positiver="" zellen="" war="" deutlich="" höher="" als="" bei="" früheren="" strukturen,="" etwa="" 60="" prozent="" (abbildung="" 3b),="" insbesondere="" in="" der="" macula="" densa="" (abbildung="" 4b).="" es="" gab="" fast="" keine="" kolokalisation="" von="" dab1="" und="" reelin,="" außer="" in="" der="" dct="" von="" wildtyp-tieren="" bei="" p14="" (pfeilspitze,="" fig.="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" von="" 14="" abbildung="" 4.="" immunfluoreszenzfärbung="" von="" postnatalen="">Nierenmit Reelin-Marker (a) und doppelter Immunfluoreszenzfärbung des postnatalen WildtypsNierenmit DAB1- und Reelin-Markern (b). (a,b) Kern-DNA-DAPI-Färbung fusioniert mit DAB1, und Reelin-Immunfluoreszenz wird parallel gezeigt (Merge). Beobachtete Zeitpunkte waren P4, P11, P14. Die Expression der untersuchten Marker in den Glomeruli (G), proximalen gewundenen Tubuli (PCT) und distalen gewundenen Tubuli (DCT) ist mit den Pfeilen markiert, während Sternchen die Expression des Reelin in der extrazellulären Matrix (a) anzeigen. Einfügungen zeigen den markantesten Ausdruck im Bild. Die DAPI-Kernfärbung zeigte eine schlechte Kolokalisation von DAB1 und Reelin, hauptsächlich in der DCT (Pfeilspitze). Maßstabsbalken ist 20 µm und bezieht sich auf alle Bilder. Es gab fast keine Immunreaktivität von DAB1 in Glomeruli und PCT von Wildtyp-Tieren bei P4, während der Prozentsatz positiver Zellen mit leichter Reaktivität (Tabelle 2) bei P11 und P14 signifikant anstieg (p < 0,05,="" abbildung="" 3b).="" in="" der="" dct="" wurde="" dab1="" hauptsächlich="" an="" den="" apikalen="" und="" lateralen="" teilen="" der="" zellmembranen="" (abbildung="" 4b)="" mit="" starker="" reaktivität="" (tabelle="" 2)="" exprimiert.="" der="" anteil="" positiver="" zellen="" war="" deutlich="" höher="" als="" bei="" früheren="" strukturen,="" rund="" 60="" prozent="" (abbildung="" 3b),="" insbesondere="" in="" der="" macula="" densa="" (abbildung="" 4b).="" es="" gab="" fast="" keine="" kolokalisation="" von="" dab1="" und="" reelin,="" außer="" in="" der="" dct="" von="" wildtyp-tieren="" bei="" p14="" (pfeilspitze,="" abbildung="">

Räumliche und zeitliche Ausdrucksmuster von NOTCH2 und LC3BDer Prozentsatz an NOTCH{0}}-positiven Zellen war zu allen beobachteten Zeitpunkten weniger als 20 Prozent in den Glomeruli beider tierischer Genotypen. Nur bei P14 war der Prozentsatz positiver Zellen in den Glomeruli von Yotari-Tieren signifikant höher als bei Wildtyp-Tieren (p < 0,05,="" fig.="" 3c).="" die="" färbungsintensität="" war="" leicht="" bis="" mäßig="" (tabelle="" 2),="" meist="" perinukleär="" lokalisiert="" (abbildung="" 5a–f).="" in="" der="" pct="" und="" dct="" beider="" tierischer="" genotypen="" nahm="" der="" prozentsatz="" positiver="" zellen="" mit="" der="" zeit="" zu.="" bei="" p14="" war="" der="" prozentsatz="" positiver="" zellen="" bei="" pct="" und="" dct="" von="" yotari-tieren="" signifikant="" höher="" als="" bei="" pct="" und="" dct="" von="" wildtyp-tieren="" (p="">< 0,05,="" abbildung="" 3c).="" die="" signalintensität="" war="" zu="" allen="" beobachteten="" zeitpunkten="" leicht="" bis="" mäßig="" (tabelle="" 2)="" und="" im="" gesamten="" zytoplasma="" verstreut="" (abbildung="" 5a–f).="" abbildung="" 5.="" immunfluoreszenzfärbung="" von="" postnatalem="" wildtyp="" und="">Nierenmit NOTCH2- und LC3B-Markern und Immunoperoxidase-Färbung mit gespaltenem Caspase3 (CASP3)-Marker. (a–f) Kern-DNA-DAPI-Färbung wird mit NOTCH2 und LC3B zusammengeführt. Beobachtete Zeitpunkte waren P4, P11, P14. Die Expression der NOTCH2- und LC3B-Marker in den Glomeruli (G), den proximalen gewundenen Tubuli (PCT) und den distalen gewundenen Tubuli (DCT) ist mit den Pfeilen markiert. Eine besonders starke LC3B-Reaktivität ist in der Bowman-Kapsel zerfallender Glomeruli zu beobachten (Sternchen, e). Einfügungen zeigen den markantesten Ausdruck im Bild. CASP3 wurde zu allen beobachteten Zeitpunkten schwach exprimiert. Die einzige signifikante Expression war in den Glomeruli von Yotari-Mäusen auf P14 (Pfeile). Maßstabsbalken ist 20 µm und bezieht sich auf alle Bilder. Biomoleküle 2021, 11, 609 9 von 14 3.4. Räumliche und zeitliche Expressionsmuster von NOTCH2 und LC3B Der Prozentsatz von NOTCH2--positiven Zellen war zu allen beobachteten Zeitpunkten weniger als 20 Prozent in den Glomeruli beider tierischer Genotypen. Nur bei P14 war der Prozentsatz positiver Zellen in den Glomeruli von Yotari-Tieren signifikant höher als bei Wildtyp-Tieren (p < 0,05,="" fig.="" 3c).="" die="" färbungsintensität="" war="" leicht="" bis="" mäßig="" (tabelle="" 2),="" meist="" perinukleär="" lokalisiert="" (abbildung="" 5a–f).="" in="" der="" pct="" und="" dct="" beider="" tierischer="" genotypen="" nahm="" der="" prozentsatz="" positiver="" zellen="" mit="" der="" zeit="" zu.="" bei="" p14="" war="" der="" prozentsatz="" positiver="" zellen="" bei="" pct="" und="" dct="" von="" yotari-tieren="" signifikant="" höher="" als="" bei="" pct="" und="" dct="" von="" wildtyp-tieren="" (p="">< 0,05,="" abbildung="" 3c).="" die="" signalintensität="" war="" zu="" allen="" beobachteten="" zeitpunkten="" leicht="" bis="" mäßig="" (tabelle="" 2)="" und="" im="" gesamten="" zytoplasma="" verstreut="" (abbildung="">

Abbildung 5. Immunfluoreszenzfärbung von postnatalem Wildtyp und YotariNierenmit NOTCH2- und LC3B-Markern und Immunoperoxidase-Färbung mit gespaltenem Caspase3 (CASP3)-Marker. (a–f) Kern-DNA-DAPI-Färbung wird mit NOTCH2 und LC3B zusammengeführt. Beobachtete Zeitpunkte waren P4, P11, P14. Die Expression der NOTCH2- und LC3B-Marker in den Glomeruli (G), den proximalen gewundenen Tubuli (PCT) und den distalen gewundenen Tubuli (DCT) ist mit den Pfeilen markiert. Eine besonders starke LC3B-Reaktivität ist in der Bowman-Kapsel zerfallender Glomeruli zu beobachten (Sternchen, e). Einfügungen zeigen den markantesten Ausdruck im Bild. CASP3 wurde zu allen beobachteten Zeitpunkten schwach exprimiert. Die einzige signifikante Expression war in den Glomeruli von Yotari-Mäusen auf P14 (Pfeile). Der Maßstabsbalken beträgt 20 µm und bezieht sich auf alle Bilder.

In den Glomeruli und DCT beider tierischer Genotypen nahm der Prozentsatz LC3B-positiver Zellen mit der Zeit zu (p < 0.05,="" abbildung="" 3d).="" bei="" p11="" und="" p14="" war="" der="" prozentsatz="" positiver="" zellen="" in="" den="" glomeruli="" von="" yotari-tieren="" signifikant="" höher="" als="" in="" den="" glomeruli="" von="" wildtyp-tieren="" (p="">< 0,05,="" abbildung="" 3d).="" in="" den="" glomeruli="" von="" yotari-tieren="" war="" die="" färbungsintensität="" zu="" allen="" beobachteten="" zeitpunkten="" meist="" mäßig="" bis="" stark="" (tabelle="" 2),="" die="" sich="" im="" perinukleären="" und="" nuklearen="" raum="" befand="" (abbildung="" 5a–f),="" während="" in="" den="" glomeruli="" von="" wildtyp-mäusen="" die="" intensität="" war="" meist="" moderat="" (tabelle="" 2).="" pct="" von="" yotari-="" und="" wildtyp-tieren="" enthielt="" zu="" allen="" beobachteten="" zeitpunkten="" etwa="" 20="" prozent="" positiver="" zellen="" (p="">< 0,05,="" abbildung="">

Gespaltener CASP-3-AusdruckEs gab fast keinen Ausdruck des aktivierten CASP-3 in derNierenvon Wildtyptieren zu allen beobachteten Zeitpunkten. In der PCT und DCT von Yotari-Mäusen waren mehrere einzelne Zellen CASP-3--positiv (Abbildung 3e). Nur in den Glomeruli der Yotari-Nieren bei P14 (Abbildung 5e) stieg der Prozentsatz positiver Zellen im Vergleich zu signifikant anNierenvon Wildtyp-Mäusen (p <0.05, Abbildung 3e).

Diskussion

NiereMorphogenese und Entwicklung sind komplexe Prozesse, die durch das Zusammenspiel einer Vielzahl von Genen genau aufeinander abgestimmt sind. Angeborene Anomalien derNiereund Harnwege (CAKUT) sind die häufigsten Geburtsfehler, die 23 Prozent aller dieser Fehler ausmachen und die Hauptursache für das Endstadium darstellenNierenkrankheitbei Kindern [28,29]. Störungen einzelner Gene können die Hauptquelle von CAKUT sein, und bis jetzt wurde eine Mutation in mehr als 20 Genen als Ursache von CAKUT identifiziert [30]. Wie unsere vorherige Arbeit zeigte, zeigte sich eine große DAB1-Expression während eines normalen fötalen MenschenNiereEntwicklung [9] gingen wir davon aus, dass DAB1 bei Säugetieren eine bedeutende Rolle spielen könnteNiereEntwicklung. Um unsere Hypothese zu beweisen, untersuchten wir dieNiereMorphologie und Expressionsmuster von Reelin, NOTCH2, LC3B und aktivierten CASP3-Proteinen in Dab1-Knockout-Mäusen.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN

Schnitt durch die Yotari-MäuseNierenzeigte einen dünneren Kortex und einen signifikant kleineren MittelwertNiereund PCT-, DCT- und G-Durchmesser im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Die Abnahme anNiereGröße, die durch unzureichende Nephronausstattung verursacht wird, ist als bekanntNieren-Hypoplasie, eine der häufigsten CAKUT-Erkrankungen, die zu Bluthochdruck im Erwachsenenalter und chronischer Nierenerkrankung prädisponiert [31]. Darüber hinaus zeigten die mit dem TEM aufgenommenen Mikrofotografien, dass Yotari-Mäuse deutliche Podozytenschäden mit Auslöschung des Fußfortsatzes und fehlenden Fifiltrationsschlitzen aufwiesen. Nach der Verletzung durchlaufen Podozyten den Prozess der Auslöschung, bei dem sie ihre Struktur verlieren, was zu einer Verringerung ihrer Fifiltrationsbarrierefunktion führt [32]. Alle Formen des nephrotischen Syndroms sowie die fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) sind durch Defekte in der Podozytenstruktur oder -funktion gekennzeichnet [33].

Unsere aktuelle Studie zeigte die höchste Expression von DAB1 an den apikalen und lateralen Teilen der Zellmembranen der DCT, während REELIN hauptsächlich im Zytoplasma der PCT verstreut war. Zu den untersuchten Zeitpunkten wurden keine morphologischen Veränderungen in Tubuli von Yotari-Mäusen beobachtet, aber weitere Untersuchungen sind notwendig, um die Rolle von DAB1 in tubulointerstitiellen Kompartimenten aufzuklären. Gelegentlich kam es zu einer Kolokalisation der DAB1- und REELIN-Proteine, hauptsächlich im DCT. Diese Erkenntnisse folgen unseren früheren Arbeiten zur Expression dieser beiden Proteine ​​während des fötalen MenschenNiereEntwicklung [9]. Dies könnte darauf hindeuten, dass DAB1 und Reelin bei Mensch und Maus ähnliche Rollen spielenNierendurch Aktivierung einiger der nachgeschalteten Signalwege, wie Crk-, MAPK- und PI3K/Akt/mTOR-Signalkaskaden [34–36]. Unsere Daten zeigten auch eine erhöhte Reelin-Expression in den Glomeruli von Yotari-Mäusen. Interessanterweise hat eine frühere Studie gezeigt, dass die DAB1-Phosphorylierung und eine erhöhte Reelin-Expression in den Glomeruli von Bluthochdruck, Proteinurie und Podozytenschädigung bei den mit Ang II infundierten Ratten begleitet werden [10].

Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzfärbung eine erhöhte Expression von NOTCH2-Rezeptoren in den Glomeruli von P14-Yotari-Mäusen. Es ist bekannt, dass die NOTCH2-Expression herunterreguliert wird, sobald die Nephronreifung erreicht ist, außer unter den Bedingungen vonNierenverletzungen,wie diabetische Nephropathie und FSGS [15,37]. Mäuse mit dem Adriamycin-induzierten nephrotischen Syndrom zeigten auch eine erhöhte Expression von aktiviertem NOTCH2, was die Fifibrose verbessert [38]. Zu den untersuchten Zeitpunkten bemerkten wir keine erhöhte Fibrose, aber es bleibt die genaue Rolle des exprimierten NOTCH2 im postnatalen Yotari aufzuklärenNieren.Eine weitere Beobachtung, ob in späteren Stadien fifibrotische Veränderungen auftreten, wäre notwendig. Es gibt jedoch bereits einige Erkenntnisse, die darauf hindeuten, dass der kurzfristige Effekt einer erhöhten NOTCH2-Aktivierung mit einem starken Überlebensvorteil für verletzte Podozyten verbunden ist, der in Langzeitmodellen wie der diabetischen Nephropathie verloren geht [39].

Eine höhere LC3B-Expression in den Glomeruli von P11- und P14-Yotari-Mäusen spiegelte wahrscheinlich eine Akkumulation der Autophagosomen in den Podozyten wider. Um deutlich zu zeigen, dass die Autophagie beschleunigt wurde. Es ist notwendig, das Verhältnis der LC3-II- und LC3-I-Proteinexpressionen zu analysieren. Unter normalen Bedingungen ist die Autophagie für den Normalzustand notwendigNierenfunktion[40], insbesondere in Podozyten. Aufgrund ihrer begrenzten Fähigkeit zur Zellteilung und Zellerneuerung weisen sie eine hohe basale Autophagie auf [41]. Trotz dieser Befunde wurde bei mehreren glomerulären Erkrankungen über eine Erhöhung der LC3B-Expression berichtet [42–44], hauptsächlich in Verbindung mit der Auslöschung des Fußfortsatzes und der Entwicklung eines nephrotischen Syndroms, wie es bei Prorenin-Rezeptor-konditionierten Knockout-Mäusen beobachtet wurde [45,46]. Alle diese Studien deuten auf eine schützende Rolle der verstärkten Autophagie bei pathologischen Zuständen hin, die weiter durch die Befunde der Adriamycin-induzierten Nephropathie gestützt werden, bei der die Autophagie aktiviert wird, um vor Podozytenverletzungen zu schützen [43], sowie bei altersabhängiger glomerulärer Erkrankung, wo sie verzögert wird der fortschreitende funktionelle Rückgang derNierenfunktion[40]. Analyse des MenschenNiereBiopsien zeigten auch Hinweise auf eine erhöhte Autophagie in Verbindung mit der Auslöschung des Fußfortsatzes bei mehreren glomerulären Erkrankungen, einschließlich des nephrotischen Syndroms mit minimaler Veränderung (MCNS), das eine der häufigsten Ursachen des idiopathischen nephrotischen Syndroms ist [19]. Bei diabetischer Nephropathie und Lipopolysaccharid-induzierter AkuterkrankungNierenverletzung,Die Verbesserung der Autophagie mit einigen Therapeutika durch Hemmung des PI3K/AKT/mTOR-Signalwegs verbessert die Nierenfunktion [47,48]. All diese Erkenntnisse implizieren, dass die Autophagie eine unverzichtbare zytoprotektive Rolle für die Stressadaption spieltNierenverletzung, und seine Modulation könnte eine vielversprechende therapeutische Strategie sein, obwohl die Autophagie unter bestimmten Umständen auch schädlich sein und zum Zelltod führen kann.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENVERSAGEN VERBESSERN

Abgesehen von der Erhöhung der Autophagie konnte auch eine erhöhte Apoptose in den Glomeruli von P14-Yotari-Mäusen beobachtet werden. Autophagie verhindert normalerweise die Apoptose, kann aber unter bestimmten pathologischen Umständen auch einen gegenteiligen Effekt auf das Zellüberleben haben, indem sie die Apoptose verstärkt und fördert [42]. Nach der Geburt Apoptose in derNierenist stark vermindert, außer unter den Bedingungen vonNierenverletzung,wie das idiopathische nephrotische Syndrom, wo zur Entwicklung der Krankheit beiträgt [23]. potenzielle neue Ursache für autosomal-rezessive angeborene Anomalien derNiereund Harnwege. Allerdings ist die Hauptrolle von DAB1 währendNiereEntwicklung bleibt unklar. Darüber hinaus zeigten diese Mäuse Anomalien des Fußfortsatzes und einen erhöhten Spiegel an Reelin-, NOTCH2-, LC3B- und gespaltenen CASP3-Proteinen in den Glomeruli, was zu glomerulären Verletzungen wie dem nephrotischen Syndrom führen kann, das in Korrelation mit Hypoplasie eine potenzielle Todesursache sein kann dieser Tiere während der Entwöhnungszeit. Um diese Hypothese zu bestätigen, ist es notwendig, zusätzliche Informationen über den Blutdruck und andere klinische Laborparameter, wie Serumkreatinin, Albumin und Proteine, bereitzustellen.