Eine netzwerkpharmakologische Studie über die molekularen Mechanismen von Hypericum japonicum bei der Behandlung von cholestatischer Hepatitis mit Validierung in einem Alpha-Naphthylisothiocyanat (ANIT)-Hepatotoxizitäts-Rattenmodell

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Hintergrund: Diese netzwerkpharmakologische Studie zielte darauf ab, die Wirkstoffe und molekularen Mechanismen zu identifizieren, die an den Wirkungen von Hypericum japonicum auf cholestatische Hepatitis beteiligt sind. Wir haben die Ergebnisse in einem Alpha-Naphthyl-Isothiocyanat (ANIT)-Rattenmodell der Hepatotoxizität validiert.

Material/Methoden: Die chemischen Bestandteile und Ziele von H. japonicum und Zielgene, die zuvor mit cholestatischer Hepatitis in Verbindung gebracht wurden, wurden aus öffentlichen Datenbanken abgerufen. Unter Verwendung der Cytoscape 3.7.2-Software und der STRING-Datenbank wurde ein Netzwerk aufgebaut, und potenzielle Proteinfunktionen wurden basierend auf der öffentlichen Plattform der Bioinformatik analysiert. ANIT wurde verwendet, um cholestatische Hepatitis in einem Rattenmodell unter Verwendung von 36 Sprague-Dawley-Ratten zu induzieren, und dieses Modell wurde verwendet, um die Intervention mit 3 Dosen von zu untersuchenQuercetin(niedrig dosiert, 50 mg/kg; mittel dosiert, 100 mg/kg; und hoch dosiert, 200 mg/kg), der Hauptwirkstoff von H. japonicum. und die Boten-RNA (mRNA)-Spiegel von Markern der Leber- und Mitochondrienfunktion undoxidativen Stresswurden durch Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) nachgewiesen.

Ergebnisse: Die Hauptwirkstoffe von H. japonicum waren Quercetin, Kämpferol und Tetramethoxyluteolin. und ihre Hauptziele umfassten Prostaglandin-G/H-Synthase 2 (PTGS2), B-Zell-Lymphom-2 (BCL2), Cholesterin7-alpha-Hydroxylase (CYP7A1) und Farnesoid-X-Rezeptor (FXR). Die Quercetin-Intervention förderte die Genesung von einer cholestatischen Hepatitis.

Die Ergebnisse dieser Forschung unterstützen zukünftige Forschungen zu den Rollen von Quercetin, Kaempferol und

Schlussfolgerungen: Tetramethoxyluteolin bei Lebererkrankungen beim Menschen und die Rolle der Gene PTGS2, BCL2, CYP7A1 und FXR bei cholestatischer Hepatitis.

Schlüsselwörter: Cholestase, Intrahepatische· Genregulatorische Netzwerke ·Hypericum·Medizin, Traditionelle Chinesische·Pharmakologie· Quercetin

Hintergrund

Cholestaseist ein klinisches Syndrom mit Leberläsionen, die durch abnormale Gallenbildung, -sekretion und -ausscheidung verursacht werden. Cholestatische Lebererkrankungen sind eng mit Störungen der Gallensäuresynthese und des Gallensäuretransports verbunden und verursachen häufig eine cholestatische Leberschädigung, die letztendlich zu Leberfibrose, Zirrhose und Leberversagen führen kann [1,2].

Cholestase ist eine der Hauptursachen für cholestatische Hepatitis und Alpha-Naphthylisothiocyanat (ANIT)-induzierte Cholestase und kann letztendlich zu cholestatischer Hepatitis führen. ANIT ist ein chemisches Toxin, das verwendet wird, um hepatozelluläre Nekrose, Gallengangshyperplasie und Leberfibrose zu induzieren, das verwendet wird, um eine Leberschädigung oder cholestatische Hepatitis in experimentellen Tiermodellen hervorzurufen. In Forschungsstudien wird Ratten intraperitoneal ANIT injiziert, um eine cholestatische Hepatitis zu replizieren [3-5]. Die histopathologischen Merkmale einer Leberschädigung während einer Cholestase umfassen eine Nekrose des Lebergewebes, eine Proliferation der Gallenwege, hydropische Veränderungen,Entzündung, und Fibrose. ANIT-induzierte Cholestase bei Tieren zeigt eine signifikante Erhöhung der Plasma-Biomarker für Leberschäden, wie Alanin-Aminotransferase (ALD), Aspartat-Aminotransferase (AST), alkalische Phosphatase und y-Glutaminsäure-yltranspeptidase (y-GGT).Oxidativen Stressist ebenfalls signifikant erhöht, wie durch hohe Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies, Lipidperoxidation, erschöpfte Glutathion-Reservoire und beeinträchtigte antioxidative Kapazität des Gewebes in der Leber belegt wird. Noch wichtiger ist, dass ANIT-induzierte Tiere eine Hemmung der mitochondrialen Dehydrogenaseaktivität, einen Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials und eine mitochondriale Schwellung zeigen. Mitochondrien von ANIT-induzierten cholestatischen Ratten weisen eine erhöhte Anfälligkeit für die Porenöffnung des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs und eine verringerte Repolarisation der ATPase-Aktivität auf. Folglich ist die cholestatische Hepatitis eng mit der Leberfunktion, oxidativem Stress und der Struktur und Funktion der Mitochondrien verbunden [6,7].

Derzeit werden nur wenige Medikamente wie Ursodeoxycholsäure (UCDA) zur Behandlung von eingesetztCholestase[8,9]; aber diese Medikamente haben Nachteile, einschließlich schlechter Reaktion, Nebenwirkungen und geringer Compliance. Die traditionelle chinesische Medizin hat jedoch eine lange Geschichte und reiche klinische Erfahrung bei der Behandlung von Lebererkrankungen, wie z. B. intrahepatischer Cholestase. Hypericum japonicum ist das getrocknete ganze Gras von Hypericum japonicum Thunb. ex Murray, auch bekannt als Di-er-Cao oder Tian-ji-Huang, wird seit der Qing-Dynastie zur Behandlung von Gelbsucht eingesetzt. H. japonicum hat die Funktion, Hitze zu beseitigen, Feuchtigkeit zu entfernen, die Leber zu beruhigen und die Gallenblase zu stärken und wird häufig in der klinischen Behandlung von Gelbsucht bei feuchter Hitze eingesetzt [10]. Die chemische Zusammensetzung von H. japonicum umfasst Flavonoide, Lanthanoide, Chromonglykoside, Phloroglucinderivate und Lactone. Unter den Flavonoiden sind Quercitrin, Isoquercitrin und Quercetin-7-O- -l-rhamnosid die Inhaltsstoffe mit hepatoprotektiver Wirkung [11]. Ning Wang et al. zeigten, dass die wässrigen Extrakte von H. japonicum, einschließlich Quercetin, Iso-Quercetin und Quercetin, eine antihepatotoxische und Anti-Cholestase-Wirkung bei Versuchstieren mit Tetrachlorkohlenstoff-induzierter Hepatitis und ANIT-induzierter Cholestase besitzen [12]. Die Mechanismen und Angriffspunkte von H. japonicum bei der Behandlung der intrahepatischen Cholestase sind jedoch noch unklar.

In dieser Studie wurden Netzwerkpharmakologie und pharmakologische Experimente kombiniert. Zunächst wurden die wichtigsten aktiven Komponenten und Targets von H.japonicum in silico identifiziert und zum Aufbau eines Komponenten-Target-Netzwerks verwendet[13,14]. Es wurden funktionelle Anreicherungsanalysen von Zielgenen durchgeführt, um mögliche therapeutische Mechanismen in der Behandlung der cholestatischen Hepatitis zu erforschen. Dann wurde ein Rattenmodell einer durch ANIT induzierten cholestatischen Hepatitis verwendet, um die Mechanismen aufzudecken, die den Wirkungen von H. japonicum bei der Behandlung von cholestatischer Hepatitis und seinen schützenden Wirkungen auf die Leber zugrunde liegen. Insbesondere untersuchten wir das mitochondriale Membranpotential, die Hepatozytenapoptose, die Regulation der intrahepatischen Gallensäurehomöostase und andere Signalwege.

Material und Methoden

Chemikalien und Reagenzien

H. japonicum Thunb. ex Murray wurde von Kangmei Pharmaceutical Co., Ltd. (Puning, China) gekauft; -Naphthylisothiocyanat (ANIT, 98 Prozent) wurde von Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft;Quercetin(>98.0%)and ursodeoxycholic acid (UCDA,>98 Prozent) wurden von Dalian Melone Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, China) gekauft. Olivenöl wurde von Sigma Aldrich Trading Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD), direktes Bilirubin (DBI), Gesamtbilirubin (TBIL), Gesamtgallensäure (TBA), ALT- und AST-Assay-Kits und Glutathionperoxidase (GSH-Px)-Kits wurden von der erworben Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). Das Bio-Rad DC-Proteinassay-Reagenzienpaket wurde von Bio-Rad Laboratories (CA, USA) erworben. HyPure-Wasser in molekularbiologischer Qualität, FastStart Universal SYBR Green Master-Mix (Rox) und RevertAid First Strand cDNA-Synthesekit wurden von Thermo Fisher erworben Scientific Co., Ltd. (Shanghai, China). Die Primer gegen PTGS2, B-Zell-Lymphom-2(BCL2), Cholesterin 7-alpha-Hydroxylase (CYP7A1), Farnesoid-X-Rezeptor (FXR), Interleukin-1 beta(L{{ 13}}B) und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-o) wurden von Service Bio Technology Co., Ltd. (Wuhan, China) bezogen. Alle anderen Chemikalien und Reagenzien waren von analytischer Qualität oder höher und wurden von kommerziellen Quellen bezogen.

Tiere

Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 180 g bis 220 g wurden vom Center for Experimental Animals der Southam Medical University (SCXK(YUE)2018-0085) gekauft. Die Ratten wurden in Käfigen gehalten, denen Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung gestellt wurden, und vor jedem Experiment eine Woche lang an das Labor gewöhnt. Alle Verfahren, die Tiere und Pflege betreffen, wurden vom Ausschuss für die Verwendung menschlicher und tierischer Subjekte in der Lehr- und Forschungsabteilung der Guangzhou University of Medicine genehmigt. Die Tierzertifizierungsnummer war 44002100016560.

Screening von Komponenten und Targets von H. japonicum

Unter Verwendung von „Di-er-cao“ als Suchschlüssel suchten wir nach den chemischen Inhaltsstoffen und verwandten Targets von H. japonicum in der Datenbank für Systempharmakologie der traditionellen chinesischen Medizin, die eine wertvolle Plattform für die systempharmakologische Forschung chinesischer Kräutermedizin und a Datenbank der Netzwerkbeziehungen zwischen Medikamenten, Targets und Krankheiten [15]. Die den Targets entsprechenden Gennamen wurden mithilfe der UniPort Knowledgebase erhalten, einem zentralen Knotenpunkt für die Sammlung funktioneller Informationen über Proteine[16]. Der Organismus wurde als "Mensch" ausgewählt.

Therapeutische Zielvorhersage und Netzwerkkonstruktion

„Cholestatische Hepatitis“ wurde als Schlüsselwort verwendet, um Protein-Targets und entsprechende Gennamen für cholestatische Hepatitis in der GeneCards-Datenbank zu erhalten, die automatisch humane genzentrische Informationen aus unzähligen Datenquellen durchsucht und integriert [17]. Targets mit "gifts 230" wurden als therapeutische Targets für cholestatische Hepatitis ausgewählt. Um die potenziellen Ziele von H. japonicum für die Behandlung von cholestatischer Hepatitis zu erhalten, wurden die Arzneimittelziele und die Krankheitsziele gemäß dem "Gennamen" geschnitten. Cytoscape 3.7.2 Software [18] wurde verwendet, um das Komponenten-Target-Netzwerk zu konstruieren, und die Netzwerkanalysatorfunktion wurde verwendet, um die Parameter der Netzwerktopologie zu analysieren.

Zielprotein-Interaktionsanalyse

Die Kreuzungsziele von H. japonicum und cholestatischer Hepatitis wurden in die String-Datenbank importiert, die direkte (physikalische) und indirekte (funktionelle) Protein-Protein-Interaktionen (PPI) aufzeigen kann [19]. Mit hoher Konfidenz (0.9) als Screening-Bedingung, Entfernung der isolierten Ziele und Definition der Spezies als Mensch wurde ein PPI-Netzwerk erstellt. Nach dem Import der oben genannten Daten in Cytoscape wurde die Analysemethode Maximal Clique Centrality (MCC) im cytoHubba-Plug-in verwendet, um die wichtigsten regulatorischen Ziele des PPI-Netzwerks zu analysieren

Zielfunktions- und Signalweg-Anreicherungsanalyse

Um die biologischen Prozesse und Signalwege von Zielproteingenen besser zu verstehen, wurden die Ziele für die Behandlung von cholestatischer Hepatitis durch H. japonicum in Metascape, ein leistungsstarkes Tool zur Genannotationsanalyse, eingegeben[20]. Die Art war auf den Menschen beschränkt, und P<0.01 was="" set="" as="" the="" significance="" threshold.="" gene="" ontology="" (go)="" functional="" annotation="" and="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" (kegg)pathway="" enrichment="" analyses="" were="" carried="" out,="" and="" the="" first="" 20="" cluster="" analysis="" results="" were="" drawn="" into="" a="" bar="" chart="" for="" visual="" processing="" using="" the="" omicshare="" tools,="" a="" free="" online="" platform="" for="" data="" analysis="" and="" detailed="" implementation="" process,="" as="" shown="" in="" figure="">

Therapeutische Wirkungen von Quercetin auf ANIT-induzierte cholestatische Hepatitis bei Ratten

Sechsunddreißig männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in 6 Gruppen eingeteilt (n=6 pro Gruppe): Die Gruppe erhielt 7 Tage lang lokal ein leeres Vehikel und am Tag 5 eine ip-Injektion von Olivenöl (2 ml/kg Körpergewicht). ; Gruppe II erhielt 7 Tage lang oral ein leeres Vehikel; Gruppe II wurde 7 Tage lang oral mit UCDA (50 mg/kg Körpergewicht) behandelt; Gruppe V wurde 7 Tage lang oral mit hochdosiertem Quercetin (Que H; 200 mg/kg Körpergewicht) behandelt; Gruppe V wurde 7 Tage lang oral mit Quercetin in mittlerer Dosis (QueM; 100 mg/kg Körpergewicht) behandelt; und Gruppe VI wurde 7 Tage lang oral mit niedrig dosiertem Quercetin (Quel, 50 mg/kg Körpergewicht) behandelt. Den Ratten in den Gruppen II–VIl wurde ANIT-Olivenöllösung (100 mg/kg, ip, 2 ml/kg Körpergewicht) 2 h nach der Verabreichung von UCDA oder Quercetin am Tag 5 verabreicht. Die Modell- und Kontrollgruppen wurden oral damit behandelt ein leeres Lösungsmittel täglich [21,22].

Achtundvierzig Stunden nach der letzten Verabreichung von ANIT wurden die Tiere durch Anästhesie mittels ip-Injektion (100 mg/kg Pentobarbital) eingeschläfert. Blut wurde aus der abdominalen Aorta zur biochemischen Bewertung entnommen. Die Leber wurde sofort entnommen und gewogen. Ein großer Teil der Leber wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren, und das verbleibende Gewebe wurde in 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert, verarbeitet und nach Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung zur histologischen Untersuchung in Paraffin eingebettet. Die Leberschädigung wurde basierend auf den Niveaus von ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA und andy-GGT unter Verwendung eines Chemray 240 Automatic Biochemical Analyzer (Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, China) bewertet. Die Konzentrationen von MDA, GSH-Px und SOD wurden unter Verwendung handelsüblicher Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet, und die histologische Bewertung und Bewertung wurde gemäß standardisierten Kriterien von einem Pathologen durchgeführt, der für die Studie verblindet war. Für die Echtzeit-Analyse der reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) wurde Lebergewebe schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Analyse bei -80 Grad gelagert.

Analyse von PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, Il-1 und TNF-mRNAs durch RT-PCR

Gesamt-RNA wurde aus Lebergeweben unter Verwendung von TRlzol gemäß den Anweisungen des Herstellers (Service bio, Wuhan, China) extrahiert. Gesamt-RNA (1 0 μLl) wurde in cDNA revers transkribiert. PCR-Reaktionen (20 ul) für GAPDH, PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, TNF- und IL -1 enthielten 2 μl cDNA ,2 μL 2,5 μM Primer, 10 μL gPCR-Mix und 6 μL ddH,O. Die Reaktionen wurden bei 65 Grad für 10 Minuten, dann bei 42 Grad für 60 Minuten inkubiert und bei 72 Grad für 15 Minuten beendet. Die PCR-Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. RT-PCR-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: eine Vorzyklusphase bei 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s und Annealing bei 60 °C für 60 Sek. Die Schmelzkurve war von 65 Grad bis 95 Grad mit einer Rampenrate von 0,3 Grad C/15 s. Die Fluoreszenz wurde am Ende jedes Annealing-Schritts gemessen, und die Schmelzkurven wurden überwacht, um die Spezifität der PCR-Produkte zu bestätigen. Die 2-一CT-Methode wurde verwendet, um die mRNA-Expressionsniveaus von PTGS2-, BCL2-, CYP7A1-, FXR-, IL-1B- und TNF-mRNAs relativ zum Kontrollgen GAPDH zu bestimmen.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 8 durchgeführt.

3.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Die Daten wurden durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von dem Dunnett-Test, analysiert<0.05 was="" considered="" statistically="">

Ergebnisse

Komponenten und Ziele von H. japonicum

Um die Bestandteile von H. japonicum vollständig zu untersuchen, haben wir die pharmakokinetischen Parameter wie orale Bioverfügbarkeit und Arzneimittelähnlichkeit nicht als Screening-Kriterien festgelegt. Durch die TCMSP-Datenbank wurden 49 aktive Komponenten und 499 entsprechende Ziele von H. japonicum erhalten. Nach Entfernung von Duplikaten und Korrektur von Namen durch Uniprot wurden 269 Ziele beibehalten. Die aktiven Komponenten von H. japonicum und die Parameterinformationen sind in Tabelle 2 gezeigt.

Ziele von H. japonicum bei der Behandlung von cholestatischer Hepatitis

In der GeneCards-Datenbank wurden 682 Ziele der cholestatischen Hepatitis gescreent. Schließlich wurden 93 Ziele, die mit der Behandlung von cholestatischer Hepatitis durch H. japonicum zusammenhängen könnten, durch Kreuzen der Ziele von aktiven Komponenten und Krankheit erhalten (Abbildung 2).

Compound-Target-Netzwerk

Das Komponenten-Ziel-Netzwerk von H. japonicum bei der Behandlung von cholestatischer Hepatitis bestand aus 115 Knoten und 175 Kanten, wobei 22 sechseckige Knoten aktive Komponenten und 93 V-förmige Knoten repräsentierende Ziele darstellen (Abbildung 3).

Die Größe und Transparenz der Knoten wurden nach Grad eingestellt. Je höher der Gradwert, desto größer der Knoten und je dunkler die Farbe, desto größer die Konnektivität und Bedeutung. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, hatte H. japonicum eine Mehrkomponenten- und Mehrzielwirkung; das heißt, 1 Verbindung, die mit mehreren Zielen interagiert, und verschiedene Verbindungen, die mit demselben Ziel interagieren. Gemäß den Parametern der Netzwerktopologie, wie Grad, Betweenness und Closeness, waren die Hauptwirkstoffe Quercetin, Kaempferol und Tetramethoxyluteolin (Tabelle 3), und die Kernziele waren PTGS2, Stickoxidsynthase (NOS3), Peroxisom proliferativer aktivierter Rezeptor-Gamma (PPARG), Dipeptidylpeptidase V (DPP4), BCL2 und TNF (Tabelle 4).

PPI-Netzwerk

Mithilfe der STRING-Datenbank wurde die Wechselwirkung von 93 Kreuzungszielen zwischen Arzneimitteln und Krankheiten analysiert. Hohes Vertrauen (0.9) wurde eingestellt, isolierte Ziele wurden ausgeblendet und ein PPI-Netzwerk mit 81 Zielen und 299 Interaktionslinks wurde erhalten (Abbildung 4A). Unter Anwendung des MCC-Algorithmus von cytoHubba waren die 10 wichtigsten regulatorischen Kernziele im PPI-Netzwerk TNF, IL6, IL1B, CXCL8, IL10, CCL2, ICAM1, NFKB1, NFKBIA und MYC (Abbildung 4B).

Zielfunktion und Pathway-Anreicherung

Die Analysen der funktionellen GO-Annotation und der KEGG-Pathway-Anreicherung von therapeutischen Zielen wurden mit Metascape durchgeführt. Insgesamt wurden 1899 GO-Items erhalten, darunter 41 Items für die Zellzusammensetzung, 105 Items für die molekulare Funktion und 1753 Items für den biologischen Prozess. Die wichtigsten biologischen Prozesse und zellulären Komponenten, an denen H. japonicum beteiligt war, umfassten Reaktionen auf Lipopolysaccharide, Zytokin-vermittelte Signalübertragung, apoptotische Signalübertragung, Membranfloß (Abbildung 5A, 5B) und molekulare Funktionen, einschließlich Zytokinrezeptorbindung, Transkriptionsfaktorbindung und Serin -Typ-Endopeptidase-Aktivität (Abbildung 5C). Insgesamt wurden 146 KEGG-Signalwege analysiert, wobei die bemerkenswertesten die AGE-RAGE- und TNF-Signalwege und Hepatitis B, Arginin-Biosynthese und Gallensekretion waren. (Abbildung 5D).

Quercetin schützte vor ANIT-induzierter cholestatischer Hepatitis bei Ratten

Im intrahepatischen Cholestase-Rattenmodell stellte Quercetin das Leber/Körpergewichtsverhältnis bei Leberschädigung mit Cholestase wieder her (Abbildung 6). Die ALT-, AST-, DBIL-, TBIL-, TBA- und Y-GGT-Werte im Serum, die zur Bewertung der intrahepatischen Gallengangsproliferation und Cholestase in Verbindung mit Leberzellschädigung verwendet wurden, waren bei den Modellratten drastisch erhöht. Im Gegensatz dazu verringerte Quercetin dosisabhängig die ALT-, AST-, DBIL-, TBIL-, TBA- und GGT-Spiegel im Serum. In ähnlicher Weise verbesserte die Behandlung mit Quercetin den ANIT-induzierten oxidativen Stress in der Leber, erhöhte die SOD- und GSH-Px-Spiegel im Serum und verringerte die MDA-Spiegel (Abbildung 7).

Histologische Auswertungen durch H&E-Färbung lieferten einen direkten Beweis für die präventive und therapeutische Wirkung von Quercetin auf die ANIT-induzierte intrahepatische Cholestase. Die H&E-Färbung zeigte, dass das Lebergewebe der Kontrollgruppe eine normale Mikrostruktur aufwies, die Leberläppchen klar waren und das Leberzellkabel sauber und ordentlich war, ohne abnormale morphologische Veränderungen. Im Gegensatz dazu zeigten mit ANIT behandelte Leberschnitte undeutliche Leberläppchenstruktur, Lebermarksstörung, Leberschwellung, Hyperämie und Nekrose (Abbildung 8A). Quercetin schwächte jedoch den Grad der Leberfäulnis und der Infiltration von Entzündungszellen signifikant ab, was eine Dosis-Wirkungs-Beziehung zeigt. Diese Ergebnisse zeigten, dass Quercetin vor ANIT-induzierter Leberschädigung schützte, die von intrahepatischer Cholestase bei Ratten herrührte.

Quercetin-geschützte PTGS2-, BCL2-, CYP7A1-, FXR I-1B- und TNF-mRNA-Expression

Zur weiteren Bewertung der Schutzwirkung von Quercetin auf Hepatozyten bei Ratten mit ANIT-induzierter intrahepatischer cholestatischer Leberschädigung wurden die mRNA-Spiegel von PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, IL-1 und TNF- mittels RT-PCR gemessen. Wie in Abbildung 8B gezeigt, waren PTGS2, CYP7A1, IL-1 und TNF- verglichen mit denen von Kontrollmäusen in der ANIT-Modellgruppe hochreguliert, aber BCL2 und FXR waren herunterreguliert. Jedoch Verabreichung von Quercetin (in Dosen von 50.100 und 200 mg/kg) und UCDA

verringerte signifikant die Expression von PTGS2, CYP7A1, IL-1 und TNF-mRNA um 44,4 Prozent (P<><><0.05), and=""><0.05), respectively,="" and="" increased="" the="" expression="" of="" bcl2="" and="" fxr="" mrna="" by="" 92.9%="" and=""><0.01), respectively,="" was="" the="" anit="" model="" group.="" these="" results="" showed="" that="" quercetin="" could="" protect="" hepatocytes="" by="" accelerating="" the="" excretion="" and="" transport="" of="" bile="" acids,="" maintaining="" the="" mitochondrial="" membrane="" potential="" of="" hepatocytes,="" and="" inhibiting="">

Diskussion

Gemeinsam verwendeten wir ein ANIT-induziertes Rattenmodell, das zeigte, dass H. japonicum eine Behandlung von cholestatischer Hepatitis sein kann. Experimente zur Netzwerkpharmakologie und Pharmakodynamik klärten die Wirkung und den molekularen Mechanismus von H. japonicum bei der Behandlung von cholestatischer Hepatitis auf und lieferten eine theoretische Grundlage für die weitere Forschung und klinische Anwendung des Krauts.

Die chemischen Hauptbestandteile von H. japonicum sind unter anderem Flavonoide [23], Phloroglucinderivate und Dipeptide [11]. Puthur et al. bestimmten, dass die IC50 von acetonischen H. japonicum-Extrakten auf Asziteszellen 29,30 ug/ml beträgt, wobei ihre Ergebnisse eine gute Anti-Tumor-Aktivität in vitro zeigen und dass die methanolischen Extrakte von H. japonicum eine synergistische Wirkung haben Schädlinge durch Hemmung einiger Schlüsselenzyme. Ihre Experimente zeigten, dass H. japonicum verschiedene biologische Aktivitäten hat, die weiterer Untersuchungen bedürfen [24,25]. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass der Extrakt von H. ja-ponicum eine Vielzahl von biologischen Aktivitäten hat, einschließlich hepatoprotektiver, antioxidativer,Antiphlogistikumund Antitumorwirkungen. H. japonicum und seine Hauptbestandteile schützen vor Tetrachlorkohlenstoff-induzierter Hepatitis, ANIT-induzierter Cholestase und Anti-Enten-Hepatitis-A-Virusaktivität und verbessern die Leberfunktion und oxidative Schäden [12,26]. Isoquercitrin und Quercetin 7-rhamnosid sind die wichtigsten hepatoprotektiven Wirkstoffe [11,27]. Die vorliegende Studie zeigte, dass Quercetin, der Hauptbestandteil von H. japonicum, die ANIT-induzierte Hepatozytendegeneration und -nekrose verringern und das Ausmaß der Leberschädigung verringern kann. H&E-Ergebnisse bestätigten weiterhin die Schutzwirkung von Quercetin bei cholestatischer Hepatitis.

In der vorliegenden Studie haben wir netzwerkpharmakologische Forschung mit pharmakologischen Tierversuchen kombiniert. Zunächst untersuchten wir die wichtigsten aktiven Komponenten und Ziele von H. japonicum bei der Behandlung von cholestatischer Hepatitis. Wir konstruierten dann ein "Komponente-Target"-Netzwerk und analysierten die funktionelle Anreicherung der Targets, um den möglichen Mechanismus seiner therapeutischen Wirkung gegen cholestatische Hepatitis zu erforschen. Schließlich haben wir diese Ziele und molekularen Mechanismen durch Tierversuche verifiziert. Die von uns beobachteten biochemischen Indizes und pathologischen Merkmale der intrahepatischen Cholestase stimmten mit Erkrankungen des Menschen überein, was die klinische Relevanz unseres Rattenmodells der cholestatischen Hepatitis unterstützt.

Der Gallensäurespiegel im Serum gilt als entscheidender Hinweis für die klinische Diagnose von Störungen der intrahepatischen Cholestase und der daraus resultierenden Leberschädigung. Die intrahepatische Cholestase führt zur Behinderung der normalen Ausscheidung von Galle und Leberfunktion

Enzyme, was zu einem Anstieg von TBIL, DBIL und TBA im Serum führte, und wir zeigten, dass Quercetin die ANIT-induzierte Dysregulation der Gallensäuren umkehrte. Darüber hinaus reduzierte Quercetin signifikant die Serumspiegel von AST, ALT und γ-GGT, die aufgrund der Degeneration und Nekrose von Hepatozyten und der Schädigung der Hepatozytenmembran dramatisch angestiegen waren.

Die Lipidperoxidation ist einer der wichtigen pathologischen Mechanismen der ANIT-induzierten cholestatischen Hepatitis, die Leberzellschäden verursacht |28-30]. Das Ausmaß des oxidativen Stresses im Körper spiegelt den Schweregrad einer cholestatischen Hepatitis wider, weshalb GSH-Px, SOD und MDA, die zur Bestimmung des Lipidperoxidspiegels verwendet werden, wichtige Indikatoren sind. In der vorliegenden Studie zeigte jede Quercetin-Dosierungsgruppe signifikant reduzierte MDA, mit erhöhten SOD- und GSH-Px-Aktivitäten. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Linderung von Leberzellschäden durch Quercetin mit dem Abfangen freier Radikale, der Hemmung der Lipidperoxidation und der Verringerung der Produktion von Lipidperoxiden verbunden war.

Die Ergebnisse der Netzwerkpharmakologie zeigten, dass die wichtigsten relevanten Ziele für die Behandlung von cholestatischer Hepatitis durch H. japonicum PTGS2, NOS3, PPARG, DPP4, BCL2 und TNF umfassen. In der vorliegenden Studie 5 Ziele, PTGS2, BCL2, TNF-, FXR und CYP7A1. die mit cholestatischer Hepatitis, Leberfibrose und Leberschäden assoziiert sind, wurden für die Forschung auf molekularer Ebene ausgewählt. PTGS2, auch als Cyclooxygenase 2 bekannt, ist ein nachgeschaltetes Molekül des NF-KB-Signalwegs [31,32]. PTGS2 ist am Auftreten von Entzündungen beteiligt, indem es die Zellproliferation fördert, die Zellapoptose hemmt, die Angiogenese fördert und die Immunfunktion hemmt. TNF- ist ein wichtiger Entzündungsmediator, der am Prozess der Cholestase beteiligt ist. In unserer Studie waren die Expressionsniveaus von PTGS2, TNF-Protein und mRNA in den Lebergeweben der Modellratten mit ANIT-induzierter cholestatischer Leberschädigung hochreguliert, was darauf hindeutet, dass eine Überexpression von PTGS2 eine akute Leberschädigung und die Entwicklung von Leberschäden fördern kann Cholestase.

BCL2 ist ein Protein, das die Zellapoptose hemmt. Es verhindert oxidative Schäden und DNA-Fragmentierung von Zellbestandteilen und reguliert antioxidative Signalwege [33]. Es verbessert auch das mitochondriale Membranpotential und hemmt die mitochondriale Freisetzung von Cytochrom C und Apoptose-induzierenden Faktoren, indem es den Zellmembrantransport beeinflusst, wodurch die Apoptose der Leberzellen und andere Effekte gehemmt werden [34,35].

FXR ist ein Gallensäurerezeptor, der die Homöostase der Gallensäure in der Leber reguliert [36]. Es hemmt die Aktivität des die Gallensäuresyntheserate limitierenden Enzyms CYP7A1 durch negative Rückkopplungsregulierung, die durch ein kleines Heterodimer-Chaperon vermittelt wird, und reduziert die Synthese von Gallensäure. Gleichzeitig kann FXR die Expression der Transporter BSEP und MRP2 auf der Seitenmembran des Hepatozyten-Gallengangs hochregulieren, wodurch die Ausscheidung und der Transport von Gallensäuren beschleunigt werden, um die Leberzellen zu schützen [37,38].

Unsere Ergebnisse zeigten, dass Modellratten unter der Wirkung von ANIT eine große Cholsäure-Stase aufweisen, was zu einer Herunterregulierung der FXR-Expression und einer daraus resultierenden Erhöhung der CYP7A1-Expression führt. Außerdem verursachte die herunterregulierte Expression von FXR eine Abnahme der Expression der nachgeschalteten Gene BSEP und MRP2, die es reguliert. Die Quercetin-Intervention stellte das Expressionsniveau von FXR in Rattenlebergeweben signifikant wieder her und regulierte die Expression seiner nachgeschalteten Gene CYP7A1, BSEP und MRP2 in die entgegengesetzte Richtung der Modellgruppe. Die Ergebnisse dieser Studie stimmen mit früheren Forschungsergebnissen überein.

Die ANIT-induzierte cholestatische Hepatitis weist biochemische und pathologische Veränderungen auf, die denen des Menschen ähnlich sind. Allerdings war der pathologische Prozess der einzelnen ANIT-Behandlung in der vorliegenden Studie kurz, was die Forschung einschränkte, die normalerweise eine längere Versuchsdauer von 48 bis 72 h erfordert. Durch mehrfache intermittierende Verabreichung von ANIT wird dieser Nachteil überwunden. Die Netzwerkpharmakologie der Traditionellen Chinesischen Medizin nimmt als Forschungsgegenstand die in Arzneistoffen gefundenen chemischen Zusammensetzungen; Die an der Arzneimittelwirksamkeit der traditionellen chinesischen Medizin beteiligten chemischen Substanzen sind jedoch nicht unbedingt eine einzelne Komponente, da die wirksame Substanz eine Gruppe pharmakodynamischer Komponenten sein kann. Da die Angriffspunkte und Wirkungswege von Substanzen in der traditionellen chinesischen Medizin in der Regel bekannt sind, sind der Entdeckung neuer Mechanismen Grenzen gesetzt. In Zukunft können Algorithmen der künstlichen Intelligenz mit der Netzwerkpharmakologie kombiniert werden, um umfassendere und objektivere Informationen zu erhalten.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend kann H. japonicum mit Hilfe von Wirkstoffen wie Quercetin FXR aktivieren, CYP7A1 hemmen, die Synthese von Gallensäure in Hepatozyten reduzieren und die extrahepatische Ausscheidung von Gallensäure erhöhen. Außerdem kann es BCL2 regulieren, um das mitochondriale Membranpotential zu verbessern, Hepatozytenapoptose zu hemmen und die Homöostase der Gallensäure in der Leber zu regulieren. Außerdem kann es durch Hemmung der Expression von PTGS2, IL-1 und TNF- die Entzündungsreaktion stören. Kurz gesagt, gemäß der netzwerkpharmakologischen Analyse sind Quercetin, Kaempferol und Tetramethoxyluteolin die Hauptwirkstoffe von H. japonicum zur Verbesserung der cholestatischen Hepatitis. Die Ergebnisse dieser Studie können zukünftige Forschungen zur Rolle von Quercetin, Kaempferol und Tetramethoxyluteolin bei Lebererkrankungen beim Menschen und zur Rolle der Gene PTGS2, BCL2, CYP7A1 und FXR bei cholestatischer Hepatitis unterstützen.