Ein neuartiges, ataktisches Mausmodell von Ataxia Teleangiektasie, verursacht durch eine klinisch relevante Nonsense-Mutation (Teil 2)

Um mehr zu erfahren, wenden Sie sich bitte an unsdavid.wan@wecistanche.com

3.0 Diskussion

Durch die Erhöhung des genotoxischen Stresses durch Hinzufügen eines sekundären Hits zum DDR-Weg haben wir ein neuartiges Mausmodell generiert, das die umfassendste Reihe von AT-Symptomen aller bisherigen Modelle aufweist. Dazu gehören schwere und fortschreitende Ataxie in Verbindung mit zerebellärer Atrophie und Störungen der PN-Eigenschaften zusammen mit einer hohen Inzidenz von Krebs und Defekten in der Entwicklung von Immunzellen. Zusammen umfassen diese Komorbiditäten die drei Hauptursachen für vorzeitigen Tod inAT – jeder trägt beiauf etwa ein Drittel der Todesfälle. Von diesen ist die handlungsunfähige Wirkung der Ataxie die penetranteste und wird von Patienten und Pflegekräften als die größte Auswirkung auf ihre Lebensqualität beschrieben. Aus diesem Grund ist das Vorhandensein von Ataxie und zerebellärer Atrophie in diesem neuen Mausmodell von großer Bedeutung, da es zum allerersten Mal eine Ressource bietet, um nicht nur die Mechanismen neurologischer Dysfunktion aufzuklären, sondern auch ein dringend benötigtes In-vivo-Modell dazu Testen Sie dringend benötigte AT-Therapeutika, wie die hier beschriebenen Read-Through-Verbindungen. Wir fanden mehrere Ähnlichkeiten zwischen dem Gesamtverlauf der Ataxie im Atm3535; Aptx-Mäuse undAT-Patienten. Bei der klinischen AT sind motorische Defizite im Alter von etwa 2 Jahren beobachtbar, wenn Eltern und Ärzte eine verringerte Fähigkeit feststellen, vom Kleinkind zu einem sanften, reflexartig koordinierten Tor überzugehen – leider ist wenig über motorische Defekte in früheren Stadien aufgrund der Krankheiten bekannt geringe Prävalenz und derzeit fehlende Frühdiagnostik (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Die Patienten lernen in der Regel, ohne Hilfe zu gehen, und die neurologischen Symptome bleiben in der Regel in den ersten 4 bis 5 Lebensjahren stabil (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Wir fanden eine ähnliche frühe Progression motorischer Defizite bei Atm735×R3x; Aptx^'-Mäuse, die frühe leichte motorische Defizite bei P8 (Aufrichtreflexdefizit) erkennen, gefolgt von einer Periode relativer Stabilität, vor dem Einsetzen einer progressiven und schweren Ataxie, die sich nach p210 entwickelt, einschließlich Veränderungen im Gang, Schreckreflex, Tremor und Bewegungsapparat Aktivität. Aus diesen Befunden ergeben sich mehrere wichtige Fragen, einschließlich der Frage, ob ATM und/oder APTX eine Rolle bei der Entwicklung des Nervensystems spielen

Kleinhirn. Zukünftige Studien, die sich auf die frühe Phase der Erkrankung konzentrieren, werden entscheidend sein, um zu verstehen, ob sich das Kleinhirn vor einer Dysfunktion normal entwickelt oder ob Entwicklungsstörungen eine anfängliche Ursache sind. Wir fanden auch, ähnlich wie bei AT-Patienten, dass der Schweregrad der sich spät entwickelnden Ataxie variabel war, wobei einige Mäuse mit einer ungeschickten, hochtretenden hinteren Klappe gingen (Video 3) und andere sich fast ausschließlich durch Verrenkung des hinteren Rumpfes bewegten ( Abb.1E und Video 4)(Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy und Lang 2018; Boder und Sedgwick 1958). Insgesamt fanden wir, dass Atm?35×xR35×; Aptx-Mäuse entwickelten einen visuell tiefgreifenden und messbaren fortschreitenden Verlust der motorischen Koordination, ähnlich dem, der bei AT-Patienten beobachtet wurde, der durch die Expression von mindestens einer Kopie des Atm- oder Aptx-Get-He gerettet wurde. Der Verlust der motorischen Koordination bei AT wurde aufgrund seiner relativ selektiven Neuropathologie im gesamten Gehirn und seiner kausalen Rolle bei mehreren verschiedenen Formen der Ataxie der Kleinhirndegeneration zugeschrieben (Hoche et al. 2012). Im Einklang mitAT-PatientNeuroimaging-Studien (Wallis et al. 2007; Sahama et al. 2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al. 2013) finden wir diese Kleinhirngröße in Atm735×R3× ; Die Mäuse von Aptx sind anfangs normal, verkümmern jedoch zunehmend zusammen mit Veränderungen der neurologischen Funktion. Während der Verlust von Kleinhirngewebe als Hauptursache für Ataxie beim Menschen angesehen wird, ist anhand klinischer Daten unklar, ob der Schweregrad der Ataxie ein guter Prädiktor für das Ausmaß der postmortal festgestellten Kleinhirndegeneration ist (Aguilar et al. 1968b; Crawford et al, 2006 : Dineen et al.2020). In der Atm?35×R35×; Aptx^-Mäusen finden wir eine deutliche Atrophie, die mit einer Ausdünnung der Purkinje-Neuronen-Dendritenschicht verbunden ist, die den späten, schweren Verhaltensdefiziten vorausgeht. Unsere histologischen Beobachtungen im Atm?35xR35×; Aptx'-Mäuse deuten darauf hin, dass Veränderungen in der Kleinhirnfunktion selbst und nicht ein tiefgreifender Verlust von Kleinhirnzellen ausreichen, um den ataktischen Phänotyp zu verursachen, was mit der Beobachtung von Verhaltensfehlern vor einem signifikanten PN-Verlust bei mehreren SCAs übereinstimmt (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti ua 2000; Clark ua 1997; Jayabal ua 2016). Der Grund, warum ein ATM- und APTX-Mangel erforderlich ist, um bei Mäusen Ataxie zu erzeugen, wenn der Verlust von beiden ausreicht, um beim Menschen Ataxie zu verursachen, bleibt unklar. Eine Möglichkeit besteht darin, dass das Gehirn von Nagetieren kompensatorische Wege oder überflüssige Proteine ​​flexibler nutzt, während es auf die 10-20k-DNA-Läsionen reagiert, die sich jeden Tag auf die Zellen auswirken (Lindahl und Barnes 2000). Es gibt mehrere Formen der DNA-Reparatur, um diese Herausforderung möglicherweise zu meistern, einschließlich Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidexzisionsreparatur (NER),

Klicken Sie hier, um mehr über Cistanche zu erfahren

sowie homologe und nicht-homologe Endverbindungen (HEJ und NHEJ, jeweils), an denen ATM und APTX beteiligt waren (Chou et al. 2015; Caglayan et al. 2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee und Walker 2017). für den Fall, dass ein Mangel an ATM oder APTX allein die Zellgesundheit während der vergleichsweise kurzen Lebensdauer der Maus nicht ausreichend beeinflusst und daher beide Proteine ​​eliminiert werden müssen, um eine ausreichende Akkumulation von DNA-Schäden zu erreichen, die sich über diesen Zeitraum manifestieren. Diese Möglichkeit wird durch die Tatsache verstärkt, dass ATM und APTX unterschiedliche biochemische Eigenschaften und funktionelle Rollen bei der DNA-Schadensantwort haben, und daher würde vorhergesagt, dass ein Mangel an beiden einen breiteren Einfluss auf die Genomstabilität (dh erhöhten genotoxischen Stress) verursachen würde. Unser Befund, dass zwei Proteine ​​des Genomstabilitätspfads erforderlich sind, um neurologische Defekte bei Mäusen zu induzieren, legt stark nahe, dass es eher der Verlust von ATMs Oriole bei der DNA-Reparatur ist als potenzielle Funktionen bei der oxidativen Stresssignalisierung, Mitophagie oder Mitochondrienfunktion, die die Kleinhirndefekte verursachen ( Schiloh 2020). Alternativen können jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden, da APTX ebenso wie ATM in den Mitochondrien von Gehirnzellen beobachtet wurde, wo es vermutlich die Verarbeitung von mitochondrialer DNA unterstützt (Meagher und Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Dieses neue Mausmodell bietet ein neues Werkzeug, um diese Möglichkeiten zu untersuchen und mechanistisch zu definieren, wie der Verlust von ATM und APTX letztendlich zu einer Funktionsstörung des Kleinhirns führt. Die in PNs beobachteten biophysikalischen Störungen, die vom AtmR35XR35X aufgezeichnet wurden; Aptx-Mäuse werden in ähnlicher Weise in mehreren anderen Mausmodellen von Ataxie gefunden. Dazu gehören Änderungen, die wir beim PN-Eingangswiderstand, der Membrankapazität und der AP-Schwelle und -Breite beobachtet haben, die auch in Mausmodellen von SCA wie 1, 3 und 7 beschrieben wurden (Stoyas et al. 2020; Shakkottai et al. 2011; Dell 'Orco et al.2015). Darüber hinaus korreliert die von uns berichtete fortschreitende Verringerung der PN-Aktionspotential-Auslösefrequenz positiv mit der Entwicklung von Ataxie beim AtrnR35XR35X; Über Aptx-Mäuse wird in einer großen Anzahl ataktischer Mausmodelle berichtet, darunter SCAs 1, 2, 3, 5, 6 und 13 sowie einige episodische Formen (siehe Übersicht (Cook, Fields und Watt 2021)). Angesichts der signifikanten Überlappung der PN-Störungen, die bei vielen verschiedenen Ataxien beobachtet werden, die durch bestimmte Zelldefekte verursacht werden, wurde die Wiederherstellung der PN-AP-Feuerfrequenzen als breit angelegter therapeutischer Ansatz angesehen. Es bleibt jedoch unklar, ob ein reduziertes PN-Feuern ein ursächlicher Faktor für Ataxie ist. Darüber hinaus deuten experimentelle Beweise darauf hin, dass Änderungen der PN-Aktivität tatsächlich eine allgemeine Reaktion zur Aufrechterhaltung der Homöostase während einer anhaltenden krankheitsbedingten Beeinträchtigung der PN-Physiologie sein könnten (Dell'Orco et al. 2015). Daher sind kontinuierliche Anstrengungen über alle zerebellären Ataxien hinweg erforderlich, um die genetischen, molekularen und zellulären Störungen, die durch Krankheiten verursacht werden, mit den spezifischen Veränderungen in der neuralen Signalübertragung des Kleinhirns zu verknüpfen, die letztendlich die Ataxie erzeugen. Von erheblicher Bedeutung bei diesen Bemühungen wird die Bestimmung sein, ob krankheitsverursachende Kleinhirndefekte allgemein oder differenziell Ataxie durch einen Verlust der Kleinhirnfunktion (z. B. Verlust von koordinierenden Signalen während der Bewegung) oder durch einen dominant-negativen Effekt (z. B. Störung nachgeschalteter neuraler Nerven) verursachen Schaltkreise mit anormalen neuronalen Ausgabemustern). Obwohl eine gemeinsame therapeutische Strategie zur Behandlung von zerebellären Ataxien die größte Wirkung hätte, könnte letztendlich ein gezielter Ansatz notwendig sein, der die unterschiedlichen genetischen und molekularen Ursachen der zellulären Dysfunktion angeht, um erfolgreich ein wirksames Therapeutikum zu entwickeln. Die mechanistische Verbindung zwischen einem Mangel an DNA Stabilitätsproteine ​​wie ATM und APTX und eine PN-Dysfunktion sind alles andere als klar. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wirkung von ATM- und APTX-Verlust auf PNs intrinsisch ist, da wir keine Änderungen in den präsynaptischen Eigenschaften von Körnerzellen oder Hinweise auf deren Zellverlust finden (keine Änderung der GCL-Dicke). Darüber hinaus beobachteten wir zwar Unterschiede in der kurzfristigen Plastizität von minderwertigen Oliveneinträgen bei ATM- und APTX-defizienten PNs und beim Wildtyp, diese Ergebnisse deuten jedoch wahrscheinlich auf eine Störung der Ca2*-Homöostase hin, möglicherweise durch Verringerungen von Inositol 1,4,5- Triphosphatrezeptor 1(ltpr1)-Expression, ähnlich denen, die in SCAs 1,2 und 3-Mausmodellen sowie ATM-defizienten Mäusen beobachtet wurden (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al.2011). Während dies einen vielversprechenden Weg für zukünftige Untersuchungen und Vergleiche bietet, ist es selbst für die SCAs noch unklar, ob Veränderungen in der Ca²*-Homöostase der ursächliche Faktor oder nur ein weiteres Symptom oder sogar eine kompensatorische Reaktion von erkrankten oder gestörten PNs sind (Dell 'Orco et al.2015). Im Immunsystem ist ATM an der Reparatur von DNA-Brüchen beteiligt, die natürlicherweise während der Genumlagerung von Antigenrezeptorgenen in B- und T-Zellvorläufern auftreten, ein Phänomen, das für die Vielfalt der Antigenrezeptoren (LG und TCR) dieser Zellen entscheidend ist das zu findenT-ZelleAnteile im Blut sind signifikant reduziert, was mit früheren Studien an Menschen und AT-Knockout-Mäusen übereinstimmt (Schubert, Reichenbach und Zielen 2002; Hathcock et al. 2013; Chao, Yang und Xu 2000; Barlow et al. 1996). Diese Reduktion von T-Zellen in der Peripherie korreliert wahrscheinlich mit einem Defekt sowohl der zellulären als auch der humoralen Immunität. Wichtig ist, dass wir herausfanden, dass die Expression einer Kopie des ATM-Gens ausreicht, um CD4-Plus-Defizite im Blut wiederherzustellen, was darauf hindeutet, dass Therapien, die in der Lage sind, eine teilweise ATM-Expression wiederherzustellen, therapeutisch wirksam wären. Obwohl wir die B-Zell-Entwicklung in diesem Artikel nicht bewertet haben, ist es wahrscheinlich, dass ähnliche Schlussfolgerungen aufgrund ihrer mechanistischen Ähnlichkeiten für diesen Prozess gelten würden (Marshall et al. 2018). Erwartungsgemäß korreliert die Reduktion von T-Zellen im peripheren Blut mit einer gestörten Thymozytenentwicklung. In der Thymusdrüse fanden wir zwei Hauptdefekte. Einer, der hauptsächlich durch APTX-Mangel induziert wird, manifestiert sich als ein Defekt im DN3-zu-DN4-Übergang, der mit einer frühen Umlagerung des TCR-Locus zusammenfällt. Der andere Defekt, der hauptsächlich durch ATM-Mangel verursacht wird, korreliert mit einer verringerten Progression von doppelt positiven CD4*CD8- zu einfach positiven Zellen, hauptsächlich CD4'-Thymozyten. Während der APTX-Befund überraschend war, da sein Mangel (AOA 1) nicht mit Immundefiziten assoziiert ist, ist bekannt, dass APTX mit TCR-Genumlagerungsproteinen, einschließlich XRCC4, interagiert (Clements et al. 2004). Zukünftige Studien, die darauf abzielen, die Rolle von APTX bei Endverbindungsmechanismen während der TCR-Genumordnung zu definieren, werden sein

wichtig, und die Möglichkeit, dass alternative Endverbindungsmechanismen, wie die Verwendung von Mikrohomologien, das Fehlen eines Immundefizits in dessen Abwesenheit erklären, bedarf weiterer Untersuchung (Bogue et al. 1997). Die Überlebensfähigkeit von Atm?35×/R35×; Aptx-Mäuse sind erheblich länger als frühere AT-Mausmodelle. Im Vergleich die ersteBEI KOMausmodell, berichtet von Barlow et al. starben normalerweise innerhalb von 2-4 Monaten nach der Geburt an Thymomen (Barlow et al. 1996). Die verringerte Krebsüberlebensfähigkeit in diesem und vielen anderen Knockout-AT-Mausmodellen ist wahrscheinlich genetisch bedingt, da gezeigt wurde, dass der Hintergrundstamm, der die Mutation beherbergt, mit A/J und C57BL/6 signifikante Auswirkungen auf die Krebsprävalenz und Überlebensfähigkeit hat

Hintergrund mit deutlich erhöhter Überlebensfähigkeit gegenüber den BALBC- und 129S-Stämmen (Genik et al. 2014). Die Tatsache, dass unsere ATM-defizienten Mäuse auf einem C57BL/6-Hintergrund erstellt wurden, liegt wahrscheinlich zugrunde; dass die Aptx*t-Mäuse keine Ataxie entwickeln, liegt an ihrer vergleichsweise langen Lebensdauer. Da der Atm35xR35×; unwahrscheinlich, dass der frühe Tod bei AT KO-Mäusen die Beobachtung eines ataktischen Phänotyps verhindert, der sich andernfalls bei diesen Mäusen entwickeln würde. Es ist jedoch nicht bekannt, ob der C57BL/6-Hintergrund Resilienz gegenüber der Entwicklung von Ataxie verleiht, wie dies bei Krebs der Fall ist. Die Bestimmung der genetischen oder möglicherweise epigenetischen Faktoren, die den Schweregrad der Erkrankung beeinflussen, könnte Wege für die zukünftige therapeutische Entwicklung eröffnen. Angesichts der globalen Natur der ATM- und APTX-Nullmutation in unserem Mausmodell können wir nicht vollständig ausschließen, dass auch extrazerebelläre Defekte zum schweren ataktischen Phänotyp und damit zu zukünftigen Untersuchungen außerhalb des Kleinhirns im Vorderhirn, Hirnstamm und Rückenmark beitragen können , und sogar Muskeln müssen durchgeführt werden. Innerhalb des Kleinhirns fanden wir zwar einige anatomische Unterschiede in den PN-Feuereigenschaften in verschiedenen Regionen des Kleinhirns, aber keine regionalen Unterschiede in der ML-Breite oder PN-Dichte. Es gibt jedoch Herausforderungen bei der Verwendung der regionalen Anatomie als Gruppierungsfaktor im Kleinhirn, da die physischen Falten des Gewebes nicht unbedingt mit den Grenzen der beschriebenen funktionellen, molekularen Ausdrucks- oder physiologischen Eigenschaftsdomänen korrelieren (Apps und Hawkes 2009 ; Tsutsumi et al. 2015; Gao, van Beugen und De Zeeuw 2012; Zhou et al. 2014). Experimente, die sich auf die Untersuchung des Ausmaßes von Kleinhirndefekten innerhalb dieser Domänen konzentrieren, werden in zukünftigen Studien wichtig sein und mit den anekdotischen Berichten über anatomische Unterschiede bei AT-Patienten verglichen werden (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover und Huff 1976; Amromin, Boder, und Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan und Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare und Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Während wir beim Atm735wR35x zwei potenzielle Stadien im Fortschreiten der Ataxie erkennen; Aptx-Mäuse entwickelt sich das spätere Stadium der schweren Ataxie bei Mäusen im Erwachsenenalter, im Vergleich zum Beginn in der Kindheit beim Menschen. Dies kann seine Verwendung in einigen neurologischen Entwicklungsstudien einschränken. Außerdem muss bei der Interpretation zukünftiger Experimente sorgfältig berücksichtigt werden, dass dieses neue Modell gleichzeitig Nullmutationen in zwei Genomstabilitätsgenen exprimiert, eine Situation, die bei menschlichen Patienten mit AT oder AOA1 nicht festgestellt wurde. Schließlich war es eine Herausforderung festzustellen, wo, wann und wie ein ATM-Mangel zerebelläre Pathologien und Ataxie verursacht, da früheren ATM-defizienten Mäusen im Allgemeinen die charakteristischen Merkmale fehlen, die erforderlich sind, um zelluläre und molekulare Defizite ursächlich mit dem ataktischen Phänotyp zu verknüpfen. Es wurden mehrere vielversprechende Untersuchungswege definiert, einschließlich solcher, die sich auf die neuronale Ebene konzentrieren, wo ATM an der oxidativen Stresssignalisierung (Chen et al. 2003) und der synaptischen Funktion (Li et al. 2009; Vail et al. 2016) beteiligt ist sowie die Gliafunktion, wo neuere Erkenntnisse darauf hindeuten, dass die Gliapathologie ein führender Faktor in der Kleinhirnpathologie sein könnte (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al. 2016; Petersen, Rimkus und Wassarman 2012; Weyemi et al. 2015). Dieses neuartige Tiermodell bietet ein neues Werkzeug, um mechanistische Hypothesen darüber zu testen, wie ein ATM-Mangel zerebelläre Pathologien und Ataxie verursacht. Darüber hinaus kann dieses Modell vor allem als entscheidendes vorklinisches Werkzeug zum Testen von zuvor vorgeschlagenen therapeutischen Kandidaten (Browne et al. 2004; Chen et al. 2003) und unseren eigenen SMRT-Verbindungen (Du et al. 2013) dienen. Die schwerwiegenden Einschränkungen, die dadurch entstehen, dass es kein geeignetes präklinisches Modell für therapeutische Tests gibt, insbesondere für seltene Erkrankungen wie AT und AOA1, können nicht genug betont werden.

4.0 Materialien und Methoden

4.1 Ethik-Erklärung

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Guide for the Care and Use of Laboratory Animals der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tiere wurden gemäß den genehmigten Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Lundquist Institute (31374-03, 31773-02) und der UCLA (ARC-2007-082, ARC{{3}) behandelt. }). Das Protokoll wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen des Lundquist Institute genehmigt (Assurance Number: D16-00213). Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um Schmerzen und Leiden zu minimieren, indem bei Bedarf Unterstützung bereitgestellt und ethische Endpunkte ausgewählt wurden.

4.2Mäuse

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>T-Mutation in einer großen Population von Nordafrikanern gefundenBEIPatienten using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), die das menschliche AT PTC repliziert). Die genomischen Allele wurden dann mithilfe einer 3--Wege-Gateway-Reaktion (Bradley et al. 2012) in eine modifizierte Version des NorCOMM-Targeting-Vektors für Säugetiere kloniert. Die resultierenden Targeting-Vektoren wurden in C2 ES-Zellen (C57BI/6N, abgeleitet von A. Nagy Lab, Toronto, Kanada) elektroporiert und erfolgreich zielgerichtete Klone wurden durch Selektion mit G418 identifiziert (Gertsenstein et al. 2010). Die Integration der mutierten Targeting-Kassette in den Atm-Genlocus wurde durch Southern Blot und durch Sequenzierung von PCR-Produkten bestätigt, um das Vorhandensein der Atm-PTC-Mutation, fehlerfreies Targeting in den Atm-Locus und fehlerfreie funktionelle Komponenten des zu bestätigen

Vektor (Daten nicht gezeigt). Positive ES-Klone wurden für die Blastozysteninjektion verwendet, um die transgenen Linien zu erhalten. Das transgene Allel enthielt ein gefloxtes menschliches Beta-Aktin-Promotor-DeltaTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc; (Abb. 1A). Die Genotypisierung der beiden Atm-Linien wurde unter Verwendung der folgenden Primer bei Tm 62 Grad durchgeführt: Atm-Gen-Vorwärtsprimer (F): 5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; und Atm-Gen-Reverse(R)-Primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', was ein Wildtyp-Allelprodukt von 151 bp oder ein Ziel-Allelprodukt von 241 bp erzeugt (Fig. 1A, 1B). Atmn35~ und Atm035×v waren mit C57BI/6J-Mäusen für 9 Generationen rückgekreuzt (zu 99,2 Prozent isogen) vor der Kryokonservierung und anschließenden Rederivation unter Verwendung von C57BI/6J-Leihmüttern. Atm735x und Atm35x und Atm35x/Q35x waren Brüter, die von den F1-Geschwistermäusen Atm35 und Atm835X plus erhalten wurden. AtmR35×k35×: Beide wurden als fruchtbar befunden. Aptx-Knockout-Mäuse (Aptx) wurden gezüchtet und Dr. Mathews als Embryonen von Dr. McKinnon (Ahel et al. 2006) zur Verfügung gestellt und anschließend über C57Bl/6J-Leihmütter wiedergewonnen. Die Mäuse von Aptx befinden sich auf einem gemischten Hintergrund aus C57Bl/6 und 129. Atm35k35; Aptx-Mäuse verschiedener Wildtyp-, heterozygoter und homozygoter Kombinationen wurden aus Atm35X erzeugt; Aptxt-Brüter wurden durch Kreuzen von Atm?35×R35- und Aptx^-Mäusen erzeugt. Eine Kohorte von Doppelmutanten und entsprechenden Kontrollmäusen wurde in der longitudinalen Verhaltensstudie für Ganganalysen und SHERPA-Tests verwendet (Abb. 2, 3). Mehrere zusätzliche Kohorten von altersangepassten Doppelmutanten- und Kontrollmäusen wurden für elektrophysiologische, immunhistologische und Vertikalpol-Testexperimente verwendet (Fig. 4, 7). Immunologische und Proteinexpressionsexperimente wurden unter Verwendung von Mäusen durchgeführt, die aus den ursprünglichen AtmR35x- und Atm35x-abgeleiteten Mäusen gezüchtet wurden (Fig. 5, 6 und 8). Die Genotypisierung wurde anhand von Ohrgewebeproben von P8-11-Mäusen durchgeführt. Von Transnetyx Inc. durchgeführte Echtzeit-PCR-Methoden wurden verwendet, um den Genotyp jedes Tieres zu bestimmen. Die Tiere wurden über Zehentattoos identifizierbar gemacht, die gleichzeitig mit der Ohrbiopsie durchgeführt wurden. Einzigartige Primer für Atm35× und Atm35× wurden quantifiziert und verwendet, um Wildtyp-, heterozygote und homozygote Mäuse (oben aufgeführt) zu identifizieren. Aptx'- und Aptx*"-Primer wurden verwendet, um ihre Genotypen zu bestimmen.

4.3 Tiergesundheit

Die Tiere wurden über eine digitale Waage bei P8, 45, 120.210.400 gewogen. Der Tod des Tieres wurde als der Tag, an dem es tot aufgefunden wurde, oder am Tag der Euthanisierung, an dem die Tiere einen humanen Endpunkt erreichten (Tier, das sich innerhalb der 60er Jahre nicht mehr selbst aufrichten konnte, signifikante Haarverfilzung, die auf mangelnde Selbstpflege oder übermäßigen Stress hindeutet, wie vom Tierarzt festgestellt), aufgezeichnet Mitarbeiter). Tierkadaver wurden sofort nach dem Tod eingefroren, und Autopsien wurden in Chargen durchgeführt. Die wahrscheinliche Todesursache wurde nach bestem Wissen und Gewissen in Zusammenarbeit mit der Betriebstierärztin (Dr. Catalina Guerra) durch Sichtprüfung der inneren Organe ermittelt. Einige Mäuse wurden vom Vivariumpersonal ausgeschlachtet oder versehentlich entsorgt und wurden

daher als „vermisst“ gekennzeichnet. Mäuse ohne erkennbare visuelle Todesursache wurden als „unbestimmbar“ gekennzeichnet Wahrscheinliche Todesursachen (z. B. Lebervergrößerung, Harnverschluss) wurden als „andere“ bezeichnet.

4.4 Verhalten

Vor der Durchführung eines Verhaltenstests wurden die Mäuse etwa 20 Minuten lang an die Verhaltenssuite gewöhnt. Die Mäuse wurden zu unterschiedlichen Tageszeiten entsprechend ihrem Tagesrhythmus getestet. Eine Reihe von Verhaltenstests wurde an naiven Doppelmutantenmäusen der angegebenen Genotypen zu verschiedenen Zeitpunkten in Abhängigkeit vom Verhalten, aber in derselben Mäusekohorte durchgeführt. Die Testbatterie umfasste die Catwalk Gait Assessment (P45, 120,210, 400) und eine Teilmenge der SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College und Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) Tests (P30 und 400). Diese Tests wurden vom UCLA Behavioral Core durchgeführt. Doppelmutante und Kontrollmäuse wurden zusätzlich im Vertical Pole Test untersucht. Alle Verhaltensapparate wurden zwischen jedem Testsubjekt mit Ethanol (70 Prozent) abgewischt.

Ganganalyse

Wir verwendeten ein Noldus Catwalk Gait-Analysesystem, das entwickelt wurde, um den Gang von Mäusen während des normalen Gehens halbautomatisch zu messen und zu analysieren. Kurz gesagt, die Bewegung von Mäusen über einen Korridor mit Glasboden wird von einer zentralen Position aus per Video aufgezeichnet. Pfotenabdrücke werden im Video durch Lichtbeleuchtung über der gläsernen Gehplattform hervorgehoben. Jeder Mausschritt innerhalb eines Videos wird anschließend halbautomatisch mit Catwalk XT (Noldus) erkannt. Ein Lauf für jede Maus besteht aus 3 Versuchen mit konsistenter Bewegung über die überwachte Plattform. Nur konsistente Versuche werden akzeptiert, und Mäuse können bis zu 10 Versuche benötigen, um 3 konforme Versuche in jeder Richtung über den Korridor abzuschließen. Konforme Versuche wurden definiert als solche mit einer Bewegung über die Plattform von weniger als 5 s Länge und mit nicht mehr als 60 Prozent Geschwindigkeitsvariation. Einmal auf der Plattform platziert, liefen die Mäuse im Allgemeinen hin und her, ohne dass der Experimentator dazu aufgefordert werden musste.

Vertikaler Pol

Die Mäuse werden mit der Nase nach unten und den Hinterpfoten so nah wie möglich an der Spitze oben auf einen 80 cm hohen Bolzen gesetzt. Die Mäuse werden sofort freigelassen und die Zeit beginnt sofort nach dem Platzieren.

Die Zeit wird gestoppt, wenn die erste Vorderpfote die Oberfläche unter der Stange berührt. Die natürliche Vorliebe einer Maus besteht darin, sofort die Stange herunterzuklettern, und sie haben bis zu 60 Sekunden Zeit, um die Stange zu überqueren, andernfalls wird ihnen von der Stange geholfen. Einem nicht abgeschlossenen Versuch wird automatisch eine Zeit von 30 s zugeordnet, da 95 Prozent der Mäuse, die nicht innerhalb von 30 s abgestiegen sind, bei der 60-s-Marke noch auf der Stange waren. SHIRPA-Verhaltenstests wurden von der University of California, Los Angeles Behavioral Core bei P30 durchgeführt

und P400. Alle Parameter werden bewertet, um eine quantitative Bewertung zu ermöglichen. was den Vergleich der Ergebnisse sowohl über die Zeit als auch zwischen verschiedenen Labors ermöglicht. Jede Maus wurde sequentiell auf alle Verhaltensweisen innerhalb einer Zeitspanne von ~20- Minuten getestet, bevor zur nächsten Maus übergegangen wurde. Der Experimentator war gegenüber dem Tiergenotyp verblindet. Der Screen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Rogers et al. 1997).

Verhaltensbeobachtung

Der primäre Bildschirm liefert ein Verhaltensbeobachtungsprofil, und die Bewertung jedes Tieres beginnt mit der Beobachtung des ungestörten Verhaltens in einem Beobachtungsglas (10 cm Durchmesser) für 5 Minuten. Zusätzlich zu den bewerteten Verhaltensweisen von Körperposition, spontaner Aktivität, Atemfrequenz und Zittern protokolliert der Beobachter alle Fälle von bizarrem oder stereotypem Verhalten und Krämpfen, zwanghaftes Lecken, selbstzerstörerisches Beißen und Retropulsion (Rückwärtsgehen) und räumliche Hinweise Orientierungslosigkeit.

Arena-Verhalten

Danach wird die Maus in die Arena (30 cm x 50 cm) überführt, um die Transfererregung zu testen und normales Verhalten zu beobachten. Die Arena ist in einem Raster von 10 x 10 cm² großen Quadraten markiert, um die Bewegungsaktivität innerhalb einer 30-s-Periode zu messen. Während die Maus in der Arena aktiv ist, werden Messungen der Schreckreaktion, des Gangs, der Beckenhebung und der Schwanzhebung aufgezeichnet.

Zurückhaltung in Rückenlage

Das Tier wird in Rückenlage gehalten, um autonomes Verhalten aufzuzeichnen. Während dieser Bewertung wurden Griffstärke, Körpertonus, Ohrmuschelreflex, Hornhautreflex, Zehenklemmung, Drahtmanöver und Herzfrequenz bewertet.

Gleichgewicht und Orientierung

Schließlich wurden mehrere Messungen der vestibulären Systemfunktion durchgeführt. Es wurden der Aufrichtungsreflex, der Kontaktaufrichtungsreflex und negative Geotaxis-Tests durchgeführt. Während dieses Verfahrens wurden Lautäußerungen, Wasserlassen und allgemeine Angst, Reizbarkeit oder Aggression aufgezeichnet.

Gebrauchte Ausrüstung

1. Klare Plexiglas-Arena (ungefähre Innenmaße 55 x 33 x 18 cm). Auf dem Boden der Arena befindet sich eine Plexiglasplatte, die mit 15 Quadraten (11 cm) markiert ist. Ein starrer horizontaler Draht (3 mm Durchmesser) wird über die hintere rechte Ecke befestigt, so dass die Tiere die Seiten während des Drahtmanövers nicht berühren können. Ein Gitter (40x 20 cm) mit einer Maschenweite von 12 mm (ungefähr) ist über die Breite der Box angebracht, um das Verhalten der Heckaufhängung und der Griffstärke zu messen. 2. Als Sichtglas wurde ein durchsichtiger Plexiglaszylinder (15 x 11 cm) verwendet. 3. Ein Gitterboden (40x 20 cm) mit 12mm Maschen, auf dem Sichtgläser stehen.4. Vier zylindrische Edelstahlstützen (3 cm Länge x 2,5 cm Durchmesser) zum Anheben der Gitter von der Bank. 5. Eine quadratische (13 cm) Edelstahlplatte für den Transfer von Tieren in die Arena. 6. Schneiden Sie Längen von 3/0 Mersilk ab, die in der Pinzette für Hornhaut- und Ohrmuschelreflextests gehalten werden. Eine Präparierzange, gebogen mit feinen Spitzen (125-mm-Zange, Philip Harris Scientific, Kat.-Nr. D46-174), für die Zehenklemmung. 9.Eine Stoppuhr.10. Eine IHR-Klickbox wird zum Testen der Schreckreaktionen verwendet. Die Click Box erzeugt einen kurzen 20-kHz-Ton mit 90 dB SPL, wenn sie 30 cm über der Maus gehalten wird. Wenden Sie sich an Prof. KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11. Ein Lineal. 12. Ein 30 cm langes, durchsichtiges Plexiglasrohr mit einem Innendurchmesser von 2,5 cm für den Kontaktaufrichtungsreflex. 4.5 Elektrophysiologie Präparation eines akuten Kleinhirnschnitts Aus dem Kleinhirn von Versuchs- und Kontrollmäusen wurden niedliche parasagittale Schnitte mit einer Dicke von 300 μm präpariert durch folgende veröffentlichte Methoden (Hansen et al., 2013). Kurz gesagt, Kleinhirn wurden schnell entfernt und in eine eiskalte extrazelluläre Lösung mit der Zusammensetzung (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 Glucose, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla und 1 NaHzPOa, pH 7,4, getaucht begast mit 5 Prozent CO-/95 Prozent O2. Kleinhirn wurden unter Verwendung eines Vibratoms (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Deutschland) parasagittal geschnitten und anfänglich bei 35 Grad für -30 min inkubiert und dann äquilibriert und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. Extrazelluläre Elektrophysiologie Extrazelluläre und intrazelluläre Aufzeichnungen wurden von Purkinje-Neuronen (PNs) in Scheiben erhalten, die ständig mit einer Carbogen-geblähten extrazellulären Lösung perfundiert und entweder bei 37 Grad C (extrazellulär) oder 32 Grad (intrazellulär) ± 1 Grad (siehe oben) gehalten wurden. Die Zellen wurden mit DIC-Optik und einem Wasserimmersions-40x-Objektiv (NA 0,75) unter Verwendung eines Zeiss-Examiner-Mikroskops sichtbar gemacht. Glaspipetten mit ~3 MQ Widerstand (Modell P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) wurden mit extrazellulärer Lösung gefüllt und in der Nähe von PN-Axon-Hügeln positioniert, um mit Aktionspotential verbundene kapazitive Stromtransienten im Voltage-Clamp-Modus zu messen wobei das Pipettenpotential auf 0 mV gehalten wird. Für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen wurden Pipetten mit einer intrazellulären Lösung (mM) gefüllt: 140 Monate (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 Phosphokreatin (Trissalz), 1 EGTA, 4 Mg -ATP, 0,4 Na-GTP. 100 μM Picrotoxin (Sigma) wurde hinzugefügt, um inhibitorische GABAegerische synaptische Eingaben zu blockieren. Die Daten wurden mit erfasst

ein MultiClamp 700B-Verstärker bei 20 oder 100 kHz im Spannungs- oder Stromklemmmodus, Digidata 1440 mit pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) und gefiltert bei 2 bis 4 kHz. Der Serienwiderstand lag üblicherweise zwischen 10 und 15 MΩ. Der Serienwiderstand wurde nur für Kurzzeitplastizitätsexperimente zu 80 Prozent kompensiert. Für extrazelluläre Aufzeichnungen wurden insgesamt 20 bis 45 PNs von jedem Tier über alle Genotypen, Geschlechter und Altersgruppen aufgezeichnet. Die Aufzeichnungen wurden sowohl über die medial-laterale als auch über die rostrokaudale Achse des Kleinhirns verteilt. Es wurden nur Zellen mit "gesundem" Aussehen (geringer Kontrast der Zellgrenzen) und regelmäßiger, ununterbrochener Feuerrate untersucht. Während der Analyse wurde festgestellt, dass einige Zellen Brennlücken von mehr als 2 Sekunden aufwiesen, und diese Zellen wurden aus der Analyse ausgeschlossen, da diese Art des Brennens mit „ungesund“ assoziiert wird. Doppelmutantengewebe unterschied sich qualitativ nicht Erscheinungsbild unter DIC-Mikroskopie vor den Aufzeichnungen, noch war die Zahl der "ungesunden" Zellen größer als die anderer Genotypen (7 Prozent gegenüber 4 bis 11 Prozent aller Zellen über die Kontrollgenotypen bei P400). Ein räumlicher Vergleich der neuralen Aktivität wurde durch Aufzeichnung von Reihenschnitten in den Flocculus-, lateralen (2"d oder 3'), mittleren (6" oder 7.) und medialen (11" oder 12t) Scheiben erhalten. Scheiben mit niedrigerer Nummer wurden verwendet den jüngeren Altersgruppen (P45 und 110), um ungefähr der relativen Positionierung der Aufzeichnungen über die Altersgruppen hinweg zu entsprechen. 0-3 Aufzeichnungen wurden von jedem Läppchen innerhalb jeder Scheibe gemacht, abhängig von Gewebequalität und Gesundheit. Jede Aufzeichnung dauerte {{29} } Minute. 3 bis 5 Mäuse wurden für jede Altersgruppe verwendet, und der Experimentator wurde bezüglich des Genotyps, Alters und Geschlechts verblindet.

Intrazelluläre Aufzeichnungen wurden von PNs entweder in Läppchen IIl oder VIl des medialen Kleinhirns (dh Vermis) erhalten; zwischen den Läppchen wurden keine statistischen Unterschiede in den Eigenschaften beobachtet.

Analysen

Spontane Aktionspotential-Interstimulus-Intervalle wurden unter Verwendung von Standard- und benutzerdefinierten Routinen in ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) und Excel (Microsoft) erkannt und analysiert. Insbesondere wurden Aktionspotentiale anhand von Schwellenwerten erkannt und Spiking-Statistiken (d. h. Häufigkeit und Intervalllänge) wurden unter Verwendung von angepassten lg-Pro-Routinen (TaroTools; https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/) ermittelt. Der Variationskoeffizient des mittleren Inter-Spike-Intervalls (CV) und des Median-Inter-Spike-Intervalls (CV2=2 ISIn plus 1-ISInl/(ISIn plus 1 plus ISIn)) wurden in Excel berechnet benutzerdefinierte Makros. Standardmembraneigenschaften wurden unter Verwendung von lgorPro analysiert. RM wurde bestimmt, indem 3 Spannungskurvenantworten auf einen -5 mV-Stufenimpuls von einem -80 mV-Haltepotential gemittelt wurden und die resultierende Stromablenkung zwischen 900 und 1000 ms nach dem Einsetzen gemessen wurde. Die Membranzeitkonstante wurde durch Anpassen einer einzelnen Exponentialfunktion an die anfängliche Abklingphase von 90 Prozent bis 10 Prozent des Peaks gemessen. CM wurde berechnet, indem die Membranzeitkonstante durch RM dividiert wurde. sEPSC-Ereignisse wurden über einen Zeitraum von 1- Minuten aufgezeichnet und mit Neuroexpress (v21.1.13) erkannt und gemessen. Parallele und kletternde Faseraxone wurden mit Theta-Glas-Elektroden (WPI) und einem TTL-gesteuerten Reizisolator (ISO-Flex, AMPI) stimuliert. Evozierte EPSC-Amplituden und Abklingzeitkonstanten (1 exp. für parallele und 2 exp. für Kletterfasern) wurden unter Verwendung von benutzerdefinierten Routinen in lgorPro analysiert. Aktionspotentiale wurden als Teil einer Reihe von Strominjektionen von 1 s zwischen -500 und 2250 pA (250-pA-Schritte) mit einem Haltestrom untersucht, der angepasst wurde, um ein Potential von ~70 mV aufrechtzuerhalten. Aktionspotential-Wellenformen wurden mit benutzerdefinierten gemessen

Routinen in lgorPro. Die Aktionspotentialschwelle wurde als die erste Membranspannung definiert, bei der die erste Ableitung 30 mV/ms überstieg (Zhu et al. 2006).

4.6 Untersuchung der zerebellären Atrophie

Größe des Kleinhirns Unmittelbar nach der Entfernung des Gehirns aus dem Schädel wurde ein dorsales Gesamtbild erhalten. Die Bilder wurden dann mit Fidschi (NIH) verarbeitet. Die Größen von Vorderhirn und Kleinhirn wurden bewertet, indem ihr 2-dimensionaler Raum umrissen und dann die Fläche berechnet wurde. Wir haben mögliche Unterschiede in der Gesamthirngröße normalisiert, indem wir die Ergebnisse des Kleinhirns durch die Vorderhirngröße dividiert haben, um ein relatives Kleinhirn-zu-Vorderhirn-Verhältnis zu erhalten. Die Experimentatoren waren blind gegenüber dem Genotyp des Tieres. Immunhistochemie An den jeweiligen Studienendpunkten (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), männliche und weibliche Mäuse aller Genotypen in dieser Studie vertreten war, wurde mit Isofluran anästhesiert und einer transkardialen Perfusion mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von 4 Prozent (w/v) gepuffertem Paraformaldehyd (PFA) unterzogen und dann seziert, um das Gehirn zu extrahieren. Unmittelbar nach der Entnahme des Gehirns aus dem Schädel wurden Bilder des gesamten Gehirns aufgenommen, und die Gehirne wurden dann 24 Stunden lang in 4 Prozent PFA getaucht und dann in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 0,05 Prozent Azid und 30 Prozent Saccharose für 72 kryogeschützt Stunden und bis zur weiteren Verwendung bei 4 Grad gelagert. Das Cerebellum wurde vom Vorderhirn getrennt und parasagittal unter Verwendung eines Gleitmikrotoms (Microm HM 430, Thermo Scientific) geschnitten, das auf eine Schnittdicke von 40 &mgr;m eingestellt war. Kleinhirnschnitte wurden in einer Reihe von sechs entnommen und bis zur weiteren Verwendung in TBS-AF (TBS mit 30 % Saccharose, 0,05 % Natriumazid und 30 % Ethylenglycol) bei 4 Grad oder -20 Grad gelagert. Zur Immunfluoreszenz-Visualisierung von Purkinje-Neuronen, Kleinhirnschnitten beider Atm*; Aptx*t und Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 pro Genotyp) wurden dreimal 5 min lang in TBS gewaschen und dann 30 min lang in 15 % normalem Ziegenserum bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer frei schwebenden Inkubation in Kaninchen- oder Maus-Anti-Calbindin D -28k (1:1000) für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Kreisschüttler. Die Schnitte wurden dann dreimal für 5 min mit TBS gewaschen, gefolgt von einer freischwimmenden Inkubation in Ziegen-Anti-Kaninchen- oder Maus-Alexa Fluor 488 (1:1000) für 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler. Nach der sekundären Antikörperinkubation wurden die Schnitte dreimal 5 min in TBS gewaschen, dann montiert und mit Fluoromount-G mit DAPI eingedeckt. Bei einigen Schnitten wurden Anti-Cleaved-Caspase-3(1:200)- und Anti-CD68(1:400)-Antikörper zusätzlich parallel zu Calbindin unter Verwendung eines Alexa Fluor 647 (1:500)-Sekundärantikörpers sondiert. Objektträger wurden mit Stereo Investigator (MBF Bioscience, ver.2020) auf einem Zeiss-Mikroskop, das mit einem ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) ausgestattet war, mit einem 2,5-, 10-, 20-, 40- oder 63-fachen Objektiv und Bildern gescannt aufgenommen mit einer Hamamatsu CMOS-Kamera (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus). Um die Anzahl der Calbindin-reaktiven Zellen in jedem Läppchen in den resultierenden Bildern zu quantifizieren, verwendeten wir Stereo Investigator, um zufällig zwei Linien zwischen 300 und 500 μm lang zu zeichnen jedes Läppchen und zählte manuell die Gesamtzahl der PNs entlang der Länge innerhalb der 40 um Dicke der Gewebescheibe unter 40-facher Vergrößerung. Die 2D-Dichte (Anzahl der PNs/(lineare Länge * 40 um Dicke)) der zwei Proben pro Läppchen wurde dann bestimmt gemittelt für den weiteren Vergleich zwischen Läppchen und Tieren. Calbindin-positive PN-Dendritenbreiten wurden an einer vordefinierten Stelle im Läppchen VI von jedem Tier in 25 oder 40 um dicken Gewebeschnitten unter 20-facher Vergrößerung gemessen. Dendritische Breiten der primären und sekundären Äste wurden an der Mittellinie zwischen den PN-Zellkörpern und dem Rand der Molekularschicht gemessen. Zwischen 7 und 13 Dendriten wurden pro Abschnitt gemessen, ein Abschnitt pro Tier. Für somatische PN-Messungen wurde Stereo Investigator verwendet, um zufällig PNs auszuwählen, die über den gesamten medialen Abschnitt unter 20-facher Vergrößerung verteilt waren. Die durchschnittliche PN-Breite pro Tier wurde durch Mittelung der Ergebnisse über 3 Serienschnitte (16 bis 37 PNs pro Schnitt) bestimmt. Die PN-Breiten wurden senkrecht zur PN-Schicht oder zum austretenden Dendriten gemessen, wenn er um mehr als ein paar Grad schief war. Die Breiten der Molekularschicht und der Körnerzellschicht (dargestellt mit Calbindin- bzw. DAPI-Färbung) wurden in Stereo Investigator durch Mittelung zweier Breitenmessungen an vordefinierten Stellen für jedes Läppchen bestimmt, ungefähr auf halber Strecke entlang der langen Ausdehnung jedes Läppchens unter 2,5-facher Vergrößerung.CD68 Positivität in den Kleinhirnschnitten wurde quantifiziert, indem die prozentuale Gesamtfläche von CD68 plus positive Färbung über den gesamten medialen Kleinhirnschnitt gemessen wurde. 10x zusammengefügte Bilder wurden mit der Negativkontrolle verglichen und mit ImageJ quantifiziert, ein Schnitt pro Tier. Um den Prozentsatz Calbindin-positiver PNs zu quantifizieren, die positiv für gespaltene Caspase-3 waren, zählten wir PNs über das gesamte Kleinhirn hinweg mit Stereo Investigator. Drei zusammengesetzte Bilder mit 20-facher Vergrößerung pro Tier wurden untersucht und die Ergebnisse gemittelt. Der Schwellenwert für Caspase-3-Positivität wurde anhand von Kontrollschnitten ermittelt, die nur mit den sekundären Antikörpern gefärbt wurden. Für nicht fluoreszierende histologische Analysen 25- um dicke, frei schwebende Gewebeschnitte auf positiv geladene Objektträger legen und über Nacht lufttrocknen. Das Gewebe wurde zweimal 5 Minuten lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, dann nacheinander mit 0,1 Prozent Hämatoxylin in 95 Prozent Ethanol für etwa 25 Sekunden und 0,5 Prozent Eosin in 95 Prozent Ethanol für etwa 3 Sekunden gefärbt und danach in bidestilliertem Wasser gewaschen jeder Fleck. Das Gewebe wurde anschließend für 1 Minute in Waschungen mit 95 Prozent Ethanol, 100 Prozent Ethanol und 100 Prozent Xylol dehydriert und dann mit Permount eingedeckt. Die Objektträger wurden unter Verwendung einer Farbkamera (Q Imaging, MBF Biosciences) auf demselben Zeiss-Mikroskop und derselben MBF-Erfassungssoftware abgebildet. Die Experimentatoren waren gegenüber dem Maus-Genotyp, in dem Schnitte untersucht wurden, blind, und die Untersuchungsreihenfolge wurde für alle histologischen Messungen verschachtelt.

4.7 Durchflusszytometrie-Messungen

Die durchflusszytometrische Analyse von Blut und Thymuszellen wurde durch Färben mit spezifischen Anti-Maus-Antikörpern CD4, CD8, CD3, CD44 und CD25 durchgeführt. Kurz gesagt, Vollblutproben (50 μ) wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt, dann wurden rote Blutkörperchen mit BD-Lyselösung lysiert, während lebende weiße Blutkörperchen mit einer Lebensfähigkeitsfärbung gefärbt wurden. Thymi wurden mechanisch dissoziiert. 1 bis 2 Millionen Thymuszellen wurden in ähnlicher Weise unter Verwendung spezifischer Antikörper für CD4, CD8, CD44 und CD25 gefärbt. Die Analyse von immungefärbten weißen Blutkörperchen oder Thymusproben wurde mit FACS ARIA l durchgeführt und die Daten wurden mit der FlowJo-Software analysiert, wie zuvor berichtet (Sanghez et al. 2017).

4.8 Westliche BIOts

Proteinextrakte (Zellen/Gewebe) wurden in Radioimmunopräzipitationsassay (RIPA)-Lysepuffer (150 mM NaCl, 1 Prozent Nonidet P-40 [NP-40],0) homogenisiert 0,5 % Deoxycholat, 0 0,1 % SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) mit Protease-Inhibitoren (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml Leupeptin, 5 ug/ml Pepstatin, 5 ug/ml Chymotrypsin, 10 ug/ml Aprotinin). Die Proteinextrakte wurden beschallt und dann durch Zentrifugation bei 13 000 U/min für 15 min bei 4°C pelletiert. Der BCA-Proteinassay wurde verwendet, um die Proteinkonzentrationen zu quantifizieren. Proben, die gleiche Proteinmengen von 50 bis 100 ug pro Spur enthielten, wurden unter Verwendung von vorgefertigten TGX-Gelen mit einem Gradienten von 4 bis 12 Prozent von BioRad getrennt und dann durch das TransBlot Semi-Dry BioRad-System unter Verwendung eines Nitrozellulose-Transferpakets übertragen. Übertragene Blots wurden mit Ponceau S-Färbung für eine gleiche Proteinbeladung gefärbt, dann gewaschen und mit 5 % fettfreier Trockenmilch in TBST für 60 min bei Raumtemperatur blockiert. Primäre Antikörper wurden unter Schütteln über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Die Blots wurden auf die folgenden Antikörper untersucht: ATM (D2E2)Kaninchen-mAb-Zellsignalisierung, bei einer Verdünnung von 1:1000, -Actin (D6A8)Kaninchen-mAb-Zellsignalisierung, GAPDH (D16H11)Kaninchen-mAb-Zellsignalisierung, gefolgt von der entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten ( HRP)sekundär Anti-Kaninchen, Anti-Maus für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nach mehrfachem Waschen mit TBST wurde die Proteinexpression durch das Radiance Plus-Chemilumineszenzsubstrat unter Verwendung des Azure c400 und der BioRad ChemiDoc-Bildgebungssysteme nachgewiesen. Densitometrische Analyse des ATM wurde mit ImageJ durchgeführt. Experimente wurden mit 2 technischen und 2-3 biologischen Wiederholungen wie angegeben durchgeführt.

4.9 Statistische Auswertung

Die Anzahl der für jede Gruppe ausgewählten Tiere basierte auf A-priori-Power-Analysen unter Verwendung von GPower v3.1 basierend auf einer Größe von 0,5, einer Power von 0,8 und aus vorläufigen Daten geschätzten Effektgrößen oder Vorstudium. Wir haben sowohl parametrische (1-- als auch 2--Wege-ANOVA) für normalverteilte und nicht-parametrische (Kruskal Wallace) statistische Methoden für Intervalldaten verwendet, um auf Unterschiede zwischen Gruppen zu testen, gefolgt von paarweisen Mehrfachvergleichstests, wie in angegeben der Text. Ausreißer für Immundaten in Abb. 6 und 7 wurden über die ROUT-Methode ausgeschlossen (Q=2 Prozent). Die spezifischen Analysen, die für jeden Datensatz verwendet wurden, sind in jeder Abbildungslegende angegeben. Für alle Abbildungen: ns nicht signifikant,*p Kleiner als oder gleich 0,05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">