Aktivitätsgeleitete Isolierung phenolischer Zusammensetzungen aus der Anneslea-Fragrans-Wand. und ihre zytoprotektive Wirkung gegen durch Wasserstoffperoxid induzierten oxidativen Stress in HepG2-Zellen Teil 2

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2.7. Hemmende Wirkung auf die intrazelluläre ROS-Erzeugung

Oxidativer Stress ist eine Art Ungleichgewicht zwischen Oxidation und Antioxidation im Körper [28]. Eine übermäßige Ansammlung von ROS kann zu oxidativem Stress führen, der Zellen und Gewebe wie Lipide, Membranen und DNA schädigen kann [29]. Antioxidantien wie Polyphenole und Flavonoide können dem Körper helfen, diese durch ROS verursachten Schäden zu reduzieren. Im Allgemeinen wird H, O, häufig verwendet, um eine gestörte intrazelluläre ROS-Produktion zu induzieren und die antioxidative Abwehr von Zellen zu beeinträchtigen [30]. In unserer vorliegenden Studie wurde H2O2 ausgewählt, um die abnormale Akkumulation von intrazellulärem ROS zu induzieren und die antioxidative Abwehr der Zellen zu beeinträchtigen. Um die hemmende Wirkung auf die intrazelluläre ROS-Erzeugung in H, O2--induzierten HepG2-Zellen zu bewerten, wurden die Konzentrationen an intrazellulärem ROS durch Durchflusszytometrie getestet. Kurz gesagt wurden HepG2-Zellen in einer 6--Well-Platte (1 × 10-Grad-Zellen/Well) kultiviert. Nach 24-stündiger Inkubation mit 50 ug/ml verschiedener Extrakte oder 8 ug/ml Vc (positive Gruppe) wurden alle Gruppen außer der Kontrollgruppe 6 h lang mit HO induziert. Die intrazellulären ROS-Spiegel jeder Verbindung wurden getestet (Abbildung 3). Das ROS-Erzeugungsverhältnis stieg signifikant auf 215,64 ± 9,80 Prozent in H2O – die behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (100 Prozent). Verglichen mit der H,O,-behandelten Gruppe unterdrückten die Verbindungen 2,5 und 6 die intrazelluläre ROS-Produktion bemerkenswert (S<0.05), and="" their="" inhibitory="" effect="" was="" equal="" to="" the="" vc="" group="" (figure="" 3).="" many="" phenolics="" have="" been="" proven="" to="" have="" a="" protective="" effect="" against="" intracellular="" ros="" by="" h2o2="" induction[31].="" additionally,="" compound="" 6="" displayed="" the="" strongest="" suppressive="" effect="" on="" intracellular="" ros="" production,="" which="" suggests="" that="" flavonoid="" compounds="" play="" a="" crucial="" role="" in="" inhibiting="" intracellular="" ros="">

2.8. Zytoprotektive Wirkung gegen H2O2--induzierte Zellapoptose

Apoptose ist ein grundlegendes biologisches Phänomen von Zellen, das eine wichtige Rolle im Regulationsmechanismus der Proliferation, des Wachstums und der Mutation von Zellen und der Stabilität der inneren Umgebung spielt. Apoptose ist im Unterschied zur Nekrose eine besondere Art des Zelltods. Die Störung des apoptotischen Prozesses hat negative Auswirkungen auf den Körper und verursacht viele Krankheiten [32]. H2O2 reguliert als wichtiges Signalmolekül den Prozess der Zellproliferation, des Zellwachstums und der Apoptose [5]. Die vorliegende Studie maß die Apoptose von H, O,-induzierten HepG2-Zellen und bewertete die zytoprotektiven Wirkungen der Verbindungen 2, 5 und 6. Nach der Behandlung von HepG2-Zellen mit 1,0 mM H2O2 war das Apoptoseverhältnis bemerkenswert erhöht ( 57,20±1,97 Prozent), verglichen mit dem der Kontrollgruppe (9,10±0,62 Prozent, S<0.05)(figure 4).="" the="" ratios="" of="" apoptotic="" cells="" in="" the="" treated="" groups="" of="" compounds="" 2,="" 5,="" and="" 6="" significantly="" decreased="" compared="" with="" the="" h2o2-treated="" group="" (model="" group,=""><0.05)(figure 4).="" moreover,="" compound="" 6="" had="" significant="" efficiency="" in="" protecting="" hepa-2="" cells="" from="" h2o2="" toxicity,="" and="" the="" cell="" apoptosis="" ratio="" of="" 6(10.56±1.15%)was="" lower="" than="" that="" of="" the="" vc="" group="" (positive="" control),="" which="" was="" equal="" to="" that="" of="" the="" control="" group(figure="" 4).="" meanwhile,="" compounds="" 2="" and="" 5="" showed="" a="" moderate="" cytoprotective="" effect="" with="" cell="" apoptosis="" ratios="" of="" 2(26.76±2.60%)="" and="" 5(27.64±0.83%).="" the="" differences="" in="" antioxidant="" capacity="" may="" be="" attributed="" to="" the="" number="" of="" phenolic="" hydroxyl="" moieties="" and="" the="" link="">

3. Materialien und Methoden

3.1. Chemikalien und Reagenzien

Methanol, Acetonitril und Ameisensäure für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) waren von HPLC-Qualität und wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Lösungsmittel für die Probenextraktion, einschließlich Ethanol, Dichlormethan und n-Butanol, waren von Analysequalität. Deionisiertes Wasser wurde unter Verwendung eines Milli-Q-Reinstwassersystems (Millipore, Bedford, Massachusetts, MA, USA) gereinigt und in allen Experimenten verwendet. Phenolische Standardverbindungen von Gallussäure, Rutin, Trolox und Vitamin C wurden von Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China) bezogen. Methylthiazol-2-yl-25-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Folin-Ciocalteu-Reagenz, 2,2'-und-bis(3-ethylbenzol-thiazolin-6-sulfonsäure)( ABTS),2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazylradikal (DPPH), 1,3,5-tri(2-pyridyl)-2,4,{{23 }}Triazin (TPTZ), 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) und FeSO4-7HO wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen. Die NMR-Spektren wurden unter Verwendung von Bruker-AV-400- und/oder DRX-500-Spektrometern erhalten. ESIMS-Spektren wurden auf einem Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF-Spektrometer aufgezeichnet.

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3.2. Probenvorbereitung

Anneslea fragrans Wand. Blätter wurden am 2. Juli020 in der Stadt Lincang in China gesammelt. Die Blätter wurden in einem schattigen Raum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und dann mit einer elektrischen Mühle pulverisiert. Die Extraktion und Fraktionierung wurden wie unsere zuvor berichtete Methode mit leichter Modifikation durchgeführt [33]. Die pulverisierte Probe (100 g) wurde mit 1000 ml 80-prozentigem wässrigem Ethanol-Lösungsmittel gemischt und in einem Ultraschall-Reinigungsbad bei 200 W dreimal (jeweils 0,5 h) mit Ultraschall behandelt. Dann wurde die beschallte Aufschlämmung gesammelt und bei 1500 × g für 10 min mit einer Eppendorf-Zentrifuge (TGL -20 B, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, Shanghai, China) zentrifugiert. Der vereinigte Überstand wurde bei 50 Grad durch einen Rotationsverdampfer (Hei-VAP, Heidolph, Deutschland) konzentriert und durch einen Vakuumtrocknungslyophilisator (Alpha 1-2 LD plus, Christ, Deutschland) weiter getrocknet. Der rohe Ethanolextrakt (CE, 30 g) wurde mit Wasser resuspendiert und nacheinander dreimal mit den Lösungsmitteln Dichlormethan, Ethylacetat und n-Butanol aufgetrennt. Nach Konzentrieren und Lyophilisieren wurden die Dichlormethanfraktion (DF), Ethylacetatfraktion (EAF), eine n-Butanolfraktion (BF) und Restwasserfraktion (RWF) mit einem Gewicht von 3,2 g, 6,3 g, 7,2 g und 8,2 g erhalten , beziehungsweise. Entsprechend den antioxidativen Aktivitäten verschiedener Fraktionen wurde der BF auf Glassäulen (30 mm x 400 mm) chromatographiert, die mit 20 g (trockenem Harz) des ausgewählten hydratisierten Harzes D101 naß gepackt waren. Das Bettvolumen (BV) des Harzes betrug etwa 40 ml. Nach Erreichen der adsorptiven Sättigung wurde die Säule zunächst mit destilliertem Wasser mit 4xBV gewaschen und dann mit Ethanol-Wasser (0:100,20:80,50:50,80:20,100:0,v/y, jeweils 4x BV), um fünf Unterfraktionen (BF-A bis E) zu ergeben. Jeder Teil der Desorptionslösungen wurde unter Vakuum zur Trockene eingeengt. Das CE, vier Fraktionen (DF, EAF, BF und RWF) und fünf Subfraktionen (BF-A bis E) wurden für weitere Experimente in einem Kühlschrank (-20 Grad) gelagert.

3.3. Biogeführte Isolierung aktiver Bestandteile

Unter der Leitung von Antioxidansassays und HPLC-Analyse wurde die Antioxidansfraktion weiter chromatographiert, um reine Verbindungen zu isolieren. Kurz gesagt wurde der BF einer D101-Säule mit hydratisiertem Harz unterzogen, um fünf Unterfraktionen (BF-A bis E) zu ergeben. Das BF-C (1,5 g) wurde einer Kieselgelsäule unterzogen, wobei mit DCM/MeOH (15:1) eluiert wurde, und wurde dann unter Verwendung von präparativer TLC (DCM/MeOH, 10:1) getrennt, um Verbindungen 6 (118 mg) zu erhalten ) und 7 (10 mg). BF-D (1,1 g) wurde einer Kieselgelsäule (CHCl 3 /MeOH 10:1, 5:1) unterzogen, um die Verbindungen 1 (129 mg) und 4 (15 mg) zu ergeben. BF-E (1,2 g) wurde unterzogen Silicagelsäule (CHCl3/MeOH, 30:1, 10:1, 5:1), um die Verbindungen 1 (216 mg), 2 (135 mg) und ein Gemisch zu ergeben. Letzteres wurde durch eine Silicagelsäule (CHCl3/MeOH ,12:1) zu den Verbindungen 3 (19 mg) und 5 (15 mg) (Abbildung 5).

3.4.Strukturaufklärung von Verbindungen 1-7

Entsprechend den antioxidativen Aktivitäten verschiedener Fraktionen wurden drei Unterfraktionen, BF-C bis E, einer Säulenchromatographie unterzogen. Auf diese Weise führte die Bioaktivitäts-geführte Fraktionierung von BF-C zu E zur Isolierung von sieben einzelnen phenolischen Verbindungen. Ihre Strukturen wurden als Confusosid(1)[34], Vaccinifolin (2)[34],1-[4-( -D-Glucopyranosyloxy)-2-hydroxyphenyl]-3- identifiziert. (4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-Propanon (3) [35], (S)-Naringenin-7-O- -D-Glucopyranosid (4)[ 22],2',3,4,4'-Tetrahydroxydihydrochalcon(5)[26], (epi)-Catechin (6)[26] und Cornosid (7)[36] (Abbildung 1B) durch die Analyse von 1D -NMR- und ESI-MS-Daten und Vergleich mit den zuvor in der Literatur beschriebenen Verbindungen. Darunter wurden die Verbindungen 3,4 und 7 erstmals aus dieser Pflanze isoliert.

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Confusosid (1). Die Summenformel wurde C21H24O zugeordnet, und die Trennung ergab 129 mg blassgelbe Nadeln. 'IH-NMR- (500 MHz, DMSO-d6) und ESI-MS-Daten (m/z 421 [M plus H]) waren identisch mit denen der zuvor in der Literatur beschriebenen Verbindung [34]. Die Identifizierung wurde weiter unterstützt durch 13C-NMR (125 MHz, DMSO-dg)∶δ204,4 （s,C=O),163,5(s,C-2'),163,3(s,C). -4'),155,5(s,C-4),132,6(d,C-6'),130,9(s,C-1),129,2(d,C -2, 6),115,0(d,C-3/C-5),114,4(s, C-1'),108,3(d, C{{45} }'),103.4(d,C-1"),99.6(d,C-3'),77.1(d, C-5"),76.4(d, C{{ 57}}"),73,1(d,C-2"),69,5(d,C4'),60,5(t,C-6'),39,8(t,C-),28,9( t, C-6).

Vacciniifolin (2) wurde als gelbes amorphes Pulver (153 mg) erhalten und erhielt die Summenformel C2H24O10.'H NMR (500 MHz, DMSO-dg) und ESI-MS (m/z 437 [M plus H]) Daten waren die gleichen wie die zuvor berichteten Daten [34]. Die Identifizierung wurde weiter unterstützt durch 13CNMR（125 MHz, DMSO-de）∶δ204.4 （s, C=O）,163.5（s, C-2'）,163.3 (s, C{ {21}}),145,0(s, C-3),143,3(s, C-4),132,6(d, C-6),131,7(s, C{{33 }}),118,9(d, C-6),115,8(d, C-2),115,4(d, C-5),114,4(s, C-1 '), 108.3(d, C-5'),103.4(d, C-1'),99.6(d,C-3'),77.1(d, C{{57 }}"),76,4(d,C-3'),73,1(d,C-2"),69,5(d,C-4'),60,5(t,C{ {69}}'), 39,4 (t, Ca), 29,1 (t, C-6).

{{0}}[4-( -D-Glucopyranosyloxy)-2-hydroxyphenyl]-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl){{8 }}Propanon (3). Die Verbindung wurde als farblose Nadeln (19 mg) erhalten, und die Summenformel wurde C22H2O10 zugeordnet.'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) und ESI-MS (m/z451 [M plus H]* ) Daten stimmten mit der Literatur überein [35]. Die Identifizierung wurde weiter unterstützt durch 13CNMR（100 MHz, DMSO-d）∶δ204.5（s,C=O）,163.5（s,C-2'）,163.3（s,C{ {31}}'）,147,4（s,C-3),144,6(s,C-4),132,6(d,C-6),131,6(s,C{{ 43}}),120,4(d,C-6),115,2 (d,C-5),114,5(s,C-1'), 112,6(d,C{{55 }}),108,3(d,C-5'), 103,3 (d,C-1"),99,5 (d,C-3'),77,0(d,C{{ 67}}'),76.3(d, C-3"), 73.0(d,C-2"),69.5(d,C-4'),60.5(t,C -6'),55,5(q,C-OCH3),39,5(t,C-),29,4(t,C-6).

(S)-Naringenin-7-O- -D-Glucopyranosid (4) hatte die Summenformel C21H2.O10, das als 15 mg weißes Pulver erhalten wurde. IH-NMR- (500 MHz, DMSO-dg) und ESI-MS-Daten (m/z 435 [M plus H] plus ) stimmten mit der vorherigen Arbeit überein[22]. Die Identifizierung wurde weiter unterstützt durch 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d) ∶δ197,2 （s, C-4）, 165,3 （s, C-7）, 165,2 (s, C{{25 }}), 162,9 (s, C-9), 157,9 (s, C-4'), 128,6 (s, C-1'), 128,4 (d, C{{37 }}',6'),115,2 (d, C-3'/C-5'),1{{110}}3,2 (s,C-10 ),99,6(d,C-1'),96,5(d,C-6),95,4(d,C-8),78,7(d,C-2) ,77.0(d, C{{6{{240}}}}"),76.3 (d,C-3'),73.0(d,C{{ 66}}"), 69,5 (d,C-4'),60,5(t,C-6'),42,0(t,C-3). 2'3,4,A'-Tetrahydroxydihydrochalcon (5) besaß die Summenformel C15H4O5 und wurde als weißes Pulver (15 mg) abgetrennt. M plus H] plus )-Daten stimmten mit den Angaben in der Literatur überein [26]. Die Identifizierung wurde weiter unterstützt durch 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)∶δ203,9 （s, C=O）,164,7(s,C-2'),164,2(s,C). -4'),144,9(s, C-3),143,3(s, C-4),133,0(d,C-6),131,8(s,C{ {114}}),118,9 (d,C-6),115,7(d,C-2),115,4(d,C-5),112,5 (s,C{{126 }}),108,2(d,C-5'),102,4(d,C-3'),39,5(t, C-a2),29,2(t, CB). (Epi)-Catechin(6) wurde als weißes Pulver (118 mg) isoliert und die Molekularformel als CHO4.1H NMR (400 MHz, DMSO-dg) und ESI-MS (m/z 291 [M plus H] plus ) Daten stimmten gut mit den Angaben in der Literatur überein [26]. Die Identifizierung wurde weiter unterstützt durch 13C-NMR （125 MHz, DMSO-d6）∶δ156,4（s,C-7）,156,1（s, C-5）,155,3（s,C{{162 }}）,144,8(s,C-3'),144,8(s,C-4'),130,5(s,C-1'),118,4(d,C{{ 174}}'),115,0(d,C-5'),114,4(d,C-2'), 99,0(s,C-10),95,1(d,C{ {186}}),93,8(d, C-8),80,9(d, C-2),66,2 (d,C-3),27,8(t, C{{198 }}). Cornosid (7) wurde als amorpher Feststoff (10 mg) erhalten und die Molekularformel als C1H20O8 bestimmt veröffentlichte Daten [36]. Die Identifizierung wurde weiter unterstützt durch 13CNMR (100 MHz, DMSO-dg)∶δ185,3（s, C-4）,153,3（d,C-2）,153,2 （d,C{{220 }}）,126,4（d, C-3）,126,4(d,C-5),102,8(d,C-1'),76,8(d,C{{232} }'),76.6(d,C-3'),73.3(d,C-2'),70.0(d,C-4),67.3(s, C{{244 }}), 63,8(t, C{-8), 61,0(t, C-6'), 39,7(t, C-7).

3.5.Bestimmung des Gesamtphenolgehalts (TPC) und des Gesamtflavonoidgehalts (TFC)

Die TPC und TFC von vier Fraktionen (DF, EAE, BF und RWF) und fünf Unterfraktionen (BF-A bis E) wurden gemäß unserer zuvor beschriebenen Methode gemessen [37]. Für TFC wurden 1,0 ml jeder Probe (mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml), gelöst in Methanol, mit 0,5 ml Folin-Ciocalteu-Reagenz gemischt einem Zentrifugenröhrchen und 1 min inkubiert. Dann wurden 20-prozentige Na2CO3-Lösung (m/o) (1,5 ml) und entionisiertes Wasser (7,0 ml) in das Röhrchen gegeben und 10 min lang in einem Wasserbad bei 70 Grad gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 200 ul der Lösung auf eine 96--Well-Mikroplatte überführt und die Extinktion bei 765 nm mit einem SpectraMax M5-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bestimmt.

Für TFC wurden 1,2 ml Probenlösungen (mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml) mit 0,3 ml NaNO (5 % m/o) und 3,8 ml 7 gemischt 0-prozentigem wässrigem Ethanol und 8 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden 0,3 ml 10-prozentiges wässriges Al(NO3), 4 ml 4-prozentiges wässriges NaOH und 0,4 ml 70-prozentiges wässriges Ethanol zu der Mischung gegeben und 30 min bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Dann wurden 200 ul der Lösung auf eine 96--Well-Mikroplatte übertragen, für die die Extinktion bei 510 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen wurde. TFC und TPC wurden als Milligramm Gallussäure-Äquivalente (mg GAE/Extrakt) und Rutin-Äquivalente pro Gramm Extrakt (mg RE/g Extrakt) ausgedrückt.

3.6. Bestimmung der antioxidativen Aktivität

Die antioxidative Aktivität von vier Fraktionen (DF, EAF, BF und RWF) und fünf Unterfraktionen (BF-A bis E) wurde in einer Kombination aus DPPH- und ABTS-Radikalfänger-Assays und FRAP-Assays basierend auf der in unserer vorherigen Studie beschriebenen Methode bewertet [33]. Für den DPPH-Assay wurden 50μl der Probenlösung (50,100,200ug/ml) mit 0,2 ml DPPH-Lösung (0,1 mmol/l) gemischt. L) in eine 96-Wellplatte geben und 30 min inkubieren lassen. Die Extinktion wurde bei 517 nm mit dem SpectraMax M5-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) gemessen. Für ABTS wurden 25 μl der Probenlösung (50, 100, 200 ug/ml) zu 0,2 ml LABTS-Lösung (7 mmol) gegeben /L).Die Mischung wurde 6 Minuten lang im Dunkeln gehalten und dann wurde die Extinktion bei 734 nm aufgezeichnet. Für FRAP wurden 20 μl Probenlösung (50.100.200 ug/ml) mit 0,18 ml FRAP-Reagenz (7 mmol/l) gemischt. L) Nach 10-minütiger Inkubation im Dunkeln bei 37 Grad wurde die Extinktion bei 593 nm bestimmt. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse der DPPH-, ABTS- und FRAP-Werte wurden als umol Trolox-Äquivalente pro Gramm ausgedrückt Extrakt （μmol TE/g Extrakt）.

3.7. HPLC-Analyse

Der BF und die Verbindungen {{0}} wurden auf einem Agilent 1260 HPLC-System, gekoppelt mit einem Diodenarray-Detektor, analysiert. Vor der Analyse wurde die frisch hergestellte Probenlösung durch eine 0.45-um-Nylonmembran filtriert. Die Trennung wurde unter Verwendung einer Reprosil-Pur Basic C18-Säule (5 μm, 4,6 × 25 0 mm, Deutschland) durchgeführt, die bei 35 Grad gehalten wurde. Das Injektionsvolumen betrug 5,0 μl, die Flussrate 1,0 ml/min und die Detektionswellenlänge wurde auf 280 nm eingestellt. Die mobilen Phasen waren angesäuertes Wasser mit 0,1 Prozent Ameisensäure (Phase A) und Acetonitril (Phase B), die lineare Gradientenelution wurde wie folgt durchgeführt: 0-3 min, 20 Prozent B; 3-10 min, 40 Prozent B; 10-15 min. 60 Prozent B; 15-20 min. 100 Prozent B.

3.8. Zellkultur und Zelllebensfähigkeit

Menschliche Leberkrebs-HepG2-Zellen wurden von der Kunming Cell Bank (Kunming, China) gekauft. HepG2-Zellen wurden in DME, ergänzt mit 1 Prozent Penicillin-Streptomycin und 10 Prozent fötalem Rinderserum, in einer Atmosphäre von 5 Prozent CO/95 Prozent Luft bei 37 Grad gezüchtet. Wenn die Zellen bis zu einer geeigneten Dichte (ungefähr 80 Prozent) inkubiert wurden, sie wurden für weitere Experimente mit der Positivkontrolle (Vc) und den isolierten Verbindungen behandelt.

Die Zelllebensfähigkeit wurde durch MTT-Assay zur Bewertung der Zytotoxizität jeder Probe bestimmt [29]. Die Zellen mit einer Dichte von 1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung wurden in eine Platte mit 96- Vertiefungen ausgesät und 24 h lang inkubiert. Jede Verbindung (hergestellt als vier Dosen von 50 bis 200 ug/ml) wurde 20 h lang in jede Vertiefung gegeben. Dann wurden die Zellen unter Verwendung von MTT-Lösung mit einer Endkonzentration von 4 h behandelt. Das Medium mit MTT wurde entfernt und 200 &mgr;l des DMSO wurden hinzugefügt, um das Formazan aufzulösen.Die Extinktion wurde bei 570 nm durch ein Mikroplattenlesegerät aufgezeichnet.Die Ergebnisse zeigten, dass jede Verbindung für HepG2-Zellen bei den getestetenKonzentrationen nicht toxisch war.

3.9. Hemmung der ROS-Erzeugung in H2O2--induzierten HepG2-Zellen

H,O,-induzierte HepG2-Zellen wurden verwendet, um die hemmende Wirkung auf die ROS-Produktion zu bestimmen [3]. HepG2-Zellen (1,0×10 Grad-Zellen pro Well) wurden in eine 6-Well-Platte gesät und mit isolierten Verbindungen mit 50 ug/ml und Vc (8 ug/ ml）. Nach 20-stündiger Inkubation wurde das Medium entfernt und für weitere 6 h 2 μl H, O, (0,5 mM) zu jeder Vertiefung gegeben. Am Ende des Experiments wurden die Zellen mit 2 μL DCFH-DA (10 mM) im Dunkeln bei 37 Grad für 20 Minuten markiert. Die Extinktion wurde durch Durchflusszytometrie aufgezeichnet (Guava easy yet 6-2L, Millipore, Billerica, Massachusetts, MA, USA).

3.10. Bestimmung der Zellapoptose

Die schützende Wirkung jeder Verbindung auf die H2O2--induzierte Apoptose von HepG2-Zellen wurde unter Verwendung eines Human-Annexin-VFITC/PI-Apoptose-Kits bestimmt [38]. HepG2-Zellen wurden mit oder ohne isolierte Verbindungen für 48 h vorbehandelt. Nach der Inkubation wurden den Zellen 100 μL des Bindungspuffers zugesetzt, und die Zellen reagierten im Dunkeln mit 10 μL Annexin V-FITC für 5 min bei Raumtemperatur und mit 10 μL Propidiumiodid (PI) in einem Eisbad für 5 min, nacheinander. Die Zellapoptose wurde sofort unter Verwendung von Durchflusszytometrie analysiert.

3.11.Statistische Analyse

Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die Unterschiede innerhalb und zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukey-Test, analysiert. Der Unterschied wurde bei p als statistisch signifikant angesehen<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" origin="" 2019b="" software="" (originlab,="" northampton,="" ma,="">

4. Schlussfolgerung

In dieser Studie wurden verschiedene Fraktionen aus Blättern von A. fragrans fraktioniert und deren TPC und TFC analysiert. Im Rahmen der antioxidativen Aktivität wurden die Verbindungen 1-7, darunter vier Flavonoidglykoside (1-4) und zwei Flavonoide (5 und 6), aus A. fragrans-Blättern isoliert und identifiziert, was darauf hindeutet, dass diese Art reich ist in Flavonoidverbindungen. Die Verbindungen 2, 5 und 6 zeigten eine signifikante antioxidative Aktivität in DPPH-, ABTS-Radikalfänger- und FRAP-Assays. Darüber hinaus verhinderten sie sichtbar Schäden durch oxidativen Stress durch eine Verringerung des ROS-Gehalts und Zellapoptose in H2O2--induzierten HepG2-Zellen. Nach diesen Ergebnissen haben Polyphenolverbindungen, insbesondere Flavonoide, aufgrund ihrer phenolischen Hydroxylgruppen eine beträchtliche antioxidative Kapazität. Darüber hinaus war Verbindung 2, die die Glycosideinheit und drei phenolische Hydroxylgruppen besitzt, die wichtigste antioxidative Komponente mit dem höchsten Gehalt aus den Blättern von A. fragrans. Verbindung 6 zeigte die beste antioxidative Aktivität, was möglicherweise einen wesentlichen Beitrag zur Aktivität von A. fragrans leistet. Darüber hinaus könnten die Extrakte von A. fragrans als praktikable natürliche Quelle für Antioxidantien in vielversprechenden Gesundheitsgetränken dienen. Die Studie über die Verbindungen aus den Blättern von A. fragrans legt nahe, dass diese als antioxidativer gesunder Tee zur Behandlung von durch oxidativen Stress verursachten Zellschäden serviert und als Nahrungsergänzungsmittel in der Lebensmittel- und Gesundheitsindustrie eingesetzt werden könnten.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Molecules 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules