Anhaftende und suspendierte Nierenzellen von Babyhamstern haben ein unterschiedliches Zytoskelett- und Oberflächenrezeptor-Repertoire

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Veronika Dill¹, Florian Paff¹, Aline ZimmerID², Martin Beer¹, Michael EschbaumerID^1*

Abstrakt

Tierische Zellkultur, in die einzelne Zellen einwachsenSuspension, idealerweise in einer chemisch definierten Umgebung, ist eine tragende Säule der biopharmazeutischen Produktion. Der synthetischen Umgebung fehlen exogene Wachstumsfaktoren und erfordert normalerweise einen zeitaufwändigen Anpassungsprozess, um Zellklone auszuwählen, die sich vermehrenSuspensionzu hohen Zellzahlen. Die molekularen Mechanismen, die die Anpassung ermöglichen und innerhalb der Zelle ablaufen, sind weitgehend unbekannt. Insbesondere bei Zelllinien, die zur Produktion von Virusantigenen verwendet werden, wie z. B. Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK), ist die Einschränkung des Viruswachstums durch die Entwicklung unerwünschter Zelleigenschaften höchst unerwünscht. Der Vergleich zwischen adhärent wachsenden BHK-Zellen und Suspensionszellen mit unterschiedlichenAnfälligkeitzum Maul- und Klauenseuche-Virus zeigten Unterschiede in der Expression von zellulären Rezeptoren wie Integrinen und Heparansulfaten und in der Organisation des Aktin-Zytoskeletts. Transkriptomanalysen und WachstumKinetikdemonstrierten die Vielfalt der BHK-Zelllinien und bestätigten die Bedeutung gut charakterisierter elterlicher Zellklone und eines sorgfältigen Screenings, um sicherzustellen, dass wesentliche Zellmerkmale während der Anpassung nicht verloren gehen.

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1. Einleitung

Tierische Zellkulturtechnologie wurde zuerst für die Produktion von Virusantigenen in der Impfstoffproduktion verwendet, aber in jüngerer Zeit werden Bakterien- oder Hefeproduktionsplattformen für rekombinante Proteine ​​auch auf Säugerzellsysteme umgestellt [1, 2]. Wichtig in beiden Zusammenhängen sind Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK), die vom syrischen Goldhamster (Mesocricetus auratus) stammen. Ursprünglich waren BHK-Zellen eine adhärent wachsende, ankerabhängige Säugerzelllinie mit einem Fibroblasten-Wachstumsmuster unter Standard-Zellkulturbedingungen, einschließlich fötalem Rinderserum (FBS) [3, 4]. Die Anpassung adhärenter BHK-Zellen anSuspensionWachstum in serumfreien Medien kombiniert mit groß angelegten Kulturbedingungen ist eine Erfolgsgeschichte für die Produktion von rekombinanten Proteinen (z. B. Faktor VIII) mit hohen Ausbeuten [1, 2]. Darüber hinaus sind BHK-Zellen anfällig für eine Vielzahl von Viren, darunter das Virus der Maul- und Klauenseuche (MKS) [5]. Um die steigende Nachfrage nach MKS-Impfstoffen in vielen Teilen der Welt zu befriedigen, müssen große Antigenmengen so billig wie möglich hergestellt werden, was durch eine Erhöhung der Dichte lebensfähiger Zellen auf der zellulären Seite und eine Senkung der Kosten durch Vereinfachung der vor- und nachgelagerten Verarbeitung erreicht werden kann des Antigens auf der Produktionsseite [6]. Tierkomponentenfreie Medien (ACFM) reduzieren das Kontaminationsrisiko durch zufällige Agenzien und vereinfachen zusätzlich den Prozess, wenn kein Serum ergänzt werden muss [6, 7]. Allerdings ist die Anpassung von Zellen an das Wachstum in Suspension ohne Serum und in ACFM ein zeitaufwändiger und schrittweiser Prozess [6, 8]. BHK-Zellen erreichen leicht Zelldichten von 3,5×106 Zellen/mL in Suspension, aber die Anpassung birgt immer das Risiko, dass sich im Vergleich zur Ausgangspopulation unerwünschte Zelleigenschaften entwickeln, die zu einer schlechten Wachstumsleistung, unzureichenden zellspezifischen Ausbeuten oder tumorerzeugenden Eigenschaften führen können [5, 7]. Veränderungen an den Zellen wiederum können während des kulturellen Anpassungsprozesses zu unerwarteten Virusvarianten führen. Insbesondere für die Herstellung von Impfstoffantigenen ist eine Veränderung der Viruseigenschaften und der Antigenität höchst unerwünscht. BHK-Zellen unterscheiden sich bereits in ihrer Anfälligkeit und ihrer Möglichkeit, bestimmte Virusstämme von MKS zu vermehren [9]. Offensichtlich wird der Wechsel vom verankerungsabhängigen Fibroblastenwachstum über Aggregation und Bildung von Sphäroiden zu Zellen, die unabhängig in Suspension wachsen, von signifikanten Veränderungen der Zelle selbst begleitet [4, 6]. Der Verlust der Integrin-Signalübertragung aufgrund der Unterbrechung des Kontakts zwischen extrazellulärer Matrix und Zelle führt zu Veränderungen in der Membranproteinexpression und in der Organisation des Aktin-Zytoskeletts, das ein wichtiger Empfänger der Integrin-vermittelten Signalübertragung ist [6, 10]. Gleichzeitig spielen diese Integrine eine wichtige Rolle bei der MKS-Infektion, da sie der Rezeptor für MKS im natürlichen Wirt und der primäre Rezeptor in der Zellkultur sind [11].

Ein tieferes Verständnis der zellulären Unterschiede zwischen adhärent wachsenden HK-Zellen und Zellen inSuspensionwird neue Möglichkeiten für das Zell-Engineering eröffnen und die Auswahl geeigneter Zellklone für die Herstellung von Impfstoff-Antigenen vereinfachen.

In dieser Studie wurden adhärent wachsende BHK-Zellen und ACFM-angepasstSuspensionBHK-Zellen wurden hinsichtlich der Expression von zellulären Rezeptoren wie Integrinen und Heparansulfaten (HS), ihrer Fähigkeit, Proteine ​​auf der Zelloberfläche zu präsentieren, und der Organisation des zellulären Aktinskeletts untersucht. Transkriptomanalysen und Wachstumskinetik geben Aufschluss über die Diversität der getesteten BHK-Zelllinien.

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2. Materialien und Methoden

2.1 Zelllinien und Zellkultur

Die hauptsächlich verwendeten Zelllinien waren zwei adhärente BHK-21-Klon-13-Derivate (aus der American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10, gehalten als CCLV-RIE 164 und 179 in der Collection of Cell Lines in Veterinary Medicine , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Deutschland; kurz: BHK164 oder BHK179) und derSuspensionZelllinien BHK21C13-2P (BHK-2P), bereitgestellt von der European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC; 84111301) und BHK-InVitrus (BHK-InV, auch bezeichnet als "Linie #8" wie in unserer früheren Publikation [12], Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

Für die Wachstumskinetik wurden zusätzlich die folgenden Zelllinien verwendet: BHK-2P, gehalten entweder in Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) mit 10 Prozent FBS ("Linie #2") oder angepasst an das ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) in zwei verschiedenen Prozessen (Linien Nr. 4 und Nr. 5) plus vier weitereSuspensionZelllinien: BHK21C13 angepasst an Wachstum inSuspensiondurch den allmählichen Entzug von Serum (Linie #3), BHK21-C (Linie #6), BHK21-Hektor (Linie #7) und Produktions-BHK (Linie #9) [12]. Alle diese Zellen wurden von Merck KGaA bereitgestellt.

Alle in der Studie verwendeten BHK-21-Zellen stammen letztlich von der BHK-21-Klon-13-Zelllinie von Macpherson und Stoker [13]. Der Begriff "Zelllinie" wird lose verwendet; nicht alle der elf in der vorliegenden Studie beschriebenen BHK-21-Linien sind wirklich unterschiedliche Zelllinien und keine Derivate, die unter unterschiedlichen Bedingungen kultiviert wurden. Zur leichteren Bezugnahme wird die Nummerierung der Zeilen mit der Nummerierung in unserer vorherigen Veröffentlichung [12] konsistent gehalten.

Die Zelllinie Nr. 1 aus der vorherigen Veröffentlichung wurde nicht in die vorliegende Studie aufgenommen und diese Nummer wird daher nicht verwendet. Stattdessen bezieht sich jeder Verweis auf BHK-2P-Zellen, der die Zeilennummern #2, #4 oder #5 nicht erwähnt, auf den AuftraggeberSuspensionZelllinie BHK21C13-2P (ECACC84111301), die zu Beginn dieses Abschnitts eingeführt wurde.

Die adhärenten Eierstockzelllinien (CHO) des chinesischen Hamsters (Cricetulus griseus) CHO-K1 (ATCCCCL-61, gehalten als CCLV-RIE 134) und CHO677 (CRL 2244, gehalten als CCLV-RIE 1524) sowie IB-RS Es wurden -2-Zellen (Instituto Biolo´gico-Rim Suı´no-2, gehalten als CCLV-RIE 103) und Madin-Darby-Rindernierenzellen (kurz: MDBK, gehalten als CCLV-RIE261) verwendet als Kontrollen in durchflusszytometrischen Experimenten.

Die Kulturbedingungen waren 37 °C, 5 % CO2 und zSuspensionZellen 320 U/min in TubeSpin-Bioreaktoren (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz) bei 80 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit. Alle adhärenten Zelllinien wurden in Minimal Essential Medium Eagle (MEM) kultiviert, das mit Hanks- und Earle-Salzen (Sigma-Aldrich) mit 10 Prozent FBS ergänzt war. Alle Suspensionszelllinien wurden angepasst, um in Cellvento TM BHK200-Medium (Merck KGaA) zu wachsen, mit Ausnahme der Zelllinie Nr. 2, die wie oben beschrieben kultiviert wurde.

Messungen der Zelldichte und Lebensfähigkeit wurden unter Verwendung von Trypanblau (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) und einem automatischen Zellzähler (Modell TC20, Bio-Rad) durchgeführt.

2.2 Wachstumskurvenanalyse von Suspensionszellen

Wachstumskurvenanalysen wurden als Batch-Experimente durchgeführt, durchgeführt in Duplikaten, zweimal einzeln, mit einer Impfdichte von 0,6 × 10 6 Zellen/ml. Die Dichte lebensfähiger Zellen (VCD) und die Lebensfähigkeit in Prozent wurden täglich bis zu sechs Tage nach der Zellinokulation gemessen.

Die zellspezifischen Berechnungen wurden nach den Gleichungen von [14] durchgeführt:

X: VCD (pro ml); t: Zeitpunkte der Probenahme (Stunde); n und n-1: zwei aufeinanderfolgende Abtastpunkte.

Zellteilungsnummer (cd):

2.3 Durchflusszytometrie

Durchflusszytometrische Analysen wurden unter Verwendung des Durchflusszytometrieinstruments FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, UK) durchgeführt. Zelltrümmer wurden basierend auf den Vorwärts- und Seitenstreumustern ausgeblendet. Für die Aktin-Färbung wurde die mittlere Fluoreszenzintensität im Alexa 488-Kanal direkt gemessen. Für alle Antikörperfärbungen wurde der Prozentsatz an Alexa 488- oder PE-positiven Zellen mit einem Intervallgatter bestimmt, dessen untere Grenze basierend auf einer Isotypkontrolle festgelegt wurde. Alle Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt.

2.3.1 Antikörperfärbung von Zelloberflächenrezeptoren.

auftauchen. MDBK-Zellen dienten als Positivkontrolle für die Expression von v 3, IB-RS-2-Zellen dienten als Positivkontrolle für die Expression von v 8 und CHO-K1-Zellen dienten als Positivkontrolle für die Expression von HS . CHO677-Zellen exprimieren weder die getesteten Integrine noch HS und dienten daher in allen Experimenten als Negativkontrolle. Folgende Antikörper wurden verwendet: für v 3, PE-konjugierter Klon LM609 (Verdünnung 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); für v 8, primärer Antikörper 11E8, Klon 68, Maus-IgG2a (Verdünnung 1:100) (freundlicherweise bereitgestellt von Dr. Stephen Nishimura) mit sekundärem Ziegen-Anti-Maus-IgG2a (Verdünnung 1:1000), konjugiert mit Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ); für HS, Klon 10E4, Maus-IgM (Verdünnung 1:200) (Amsbio, Abingdon, UK) mit Sekundärantikörper Ziegen-Anti-Maus-IgM-mu-Kette (Verdünnung 1:2000), konjugiert mit Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, Cambridge, UK) . In jedem Experiment wurde nur ein primärer Antikörper verwendet.

Suspensionszellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Anhaftende Zellen wurden unter Verwendung von 1 0 mM EDTA in PBS abgelöst und dann mit PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen durch ein Zellsieb (Nylonsieb, 70 μm Porendurchmesser, VWR, Radnor, USA) filtriert, um Zellklumpen zu entfernen, und vor 1 μl LIVE/ auf 1 × 106 Zellen/ml eingestellt. DEAD FixableViolet Dead Cell Stain (Thermo Fisher Scientific) wurde 30 Minuten lang zu 1 ml Zellsuspension gegeben. Dieser Schritt und alle folgenden Schritte wurden lichtgeschützt und bei 4 ˚C durchgeführt. Der primäre Antikörper wurde 30 Minuten und der sekundäre Antikörper 20–30 Minuten inkubiert. Nach allen Schritten wurde ein Waschschritt mit 2 ml FACS-Puffer (PBS, 0,1 % Natriumazid, 0,1 % BSA) und eine Zentrifugation bei 300 × g, 5 min, 4 °C durchgeführt. Abschließend wurden die gefärbten Zellen in 300 μl FACS-Puffer resuspendiert.

2.3.2 Aktin-Färbung.

Filamentöses Aktin wurde unter Verwendung von Phalloidin-iFluor 488-Reagenz (ab176753, Abcam), hergestellt gemäß dem Datenblatt, gefärbt. BHK179, BHK-2P und BHK-InVcells wurden wie oben beschrieben abgelöst und mit 4 % Formaldehyd für 2 0 Minuten bei Raumtemperatur (RT) fixiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 1 × 10 6 fixierte Zellen wurden mit 0,1 Prozent Triton X-100 (Sigma-Aldrich) in PBS permeabilisiert, gefolgt von einer Inkubation bei RT für 3 min. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen (Zentrifugation bei 300 × g, 5 min) vor der Zugabe der vorbereiteten Phalloidin-Stammlösung, verdünnt 1:1000 in FACS-Puffer, und für 20 min bei RT inkubiert. Zuletzt wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und in 300 &mgr;l FACS-Puffer resuspendiert. Angefärbte Zellen wurden direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert und für die FACS-Analyse verwendet.

2.3.3 Transfektionsexperimente.

BHK164- und BHK-2P-Zellen wurden entweder mit EGFP-N1, einem Plasmid, das verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) (Clontech) exprimiert, oder in einer anderen Versuchsreihe mit pVSV-G, einem Plasmid, das das G-Protein von Vesicular exprimiert, transfiziert Stomatitis-Indiana-Virus (VSV) unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, 2 ug Plasmid-DNA und 1,875 ul oder 3,75 ul Lipofectamin, verdünnt in Cellvento TM BHK200-Medium, wurden gemischt und bei RT für 20 min inkubiert, um eine Komplexbildung zu ermöglichen. Danach wurden diese Mischungen auf Zellen in 12-Well-Platten (ungefähr 4 × 105 Zellen/ml) übertragen und das Medium wurde auf 200 μl aufgefüllt. Die Zellen wurden 24 h bei 37 °C inkubiert.

Für die FACS-Analyse wurde der gesamte Inhalt der Wells nach 24 h geerntet. Die pEGFP-transfizierten Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und in 300 ul FACS-Puffer resuspendiert. Ein Duplikat von pVSV-G-transfizierten Zellen wurde mit PBS mit 0,1 Prozent (v/v) TritonX-100 für 5 min bei RT vor der Antikörperfärbung permeabilisiert, während das andere nicht permeabilisiert blieb. Die Antikörperfärbung erfolgte wie oben beschrieben mit polyklonalem Kaninchenserum VSV 274/E (Verdünnung 1:500, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Stefan Finke) und sekundärem Antikörper Ziegen-Anti-Kaninchen (H plus L), konjugiert mit Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1: 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Statistische Analyse

Die Daten wurden mit GraphPad Prism Version 07.04 für Windows (GraphPad Software, La Jolla, USA) analysiert. Eine gewöhnliche Einweg-Varianzanalyse wurde mit Tukey's Post-Hottest durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen zu bewerten. Der Schwellenwert für die statistische Signifikanz wurde auf einen p-Wert von 0,001 festgelegt.

2.5 Transkriptomanalyse

2.5.1 RNA-Extraktion, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung.

Drei unabhängige Chargen jeder der adhärenten BHK179-Zelllinien und der BHK-2P- und BHK-InV-Suspensionszelllinien wurden für die Transkriptomanalyse verwendet. Im Durchschnitt wurden 8,3 × 105 BHK179-Zellen, 1,6 × 107 BHK-2P-Zellen und 1,4 × 107 BHK-InV-Zellen in TRIzol-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) lysiert. Nach Zugabe von 0,2 Volumina Trichlormethan zum Zelllysat, Inkubation und Zentrifugation wurde die wässrige Phase gesammelt und mit einem Volumen 100-prozentigem Ethanol vermischt. Daraus wurde Gesamt-RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) mit on-column DNase Verdau mit dem RNase-Free DNase Set (Qiagen) nach Herstellerangaben extrahiert. Der ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) wurde hinzugefügt und als interne Kontrolle für alle folgenden Schritte verwendet. Als nächstes wurde polyadenylierte mRNA aus 1–3 ug qualitativ hochwertiger Gesamt-RNA mit dem Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit (ThermoFisher Scientific) isoliert. Die mRNA wurde anschließend fragmentiert und für die cDNA-Synthese und Bibliothekserstellung mit dem TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Sequenzierung wurde am Heinrich-Pette-Institut, Hamburg, unter Verwendung von Geräten NextSeq 500 (2 x 75 bp) und HiSeq 4000 (1 x 50 bp) (Illumina) durchgeführt.

2.5.2 Statistische Analyse der differentiellen Genexpression.

Eine Qualitätsprüfung der Raw-Reads aus jeder Sequenzierungsbibliothek wurde mit FastQC (Version {{0}}.11.9; Babraham Institute, Cambridge, UK) durchgeführt, wobei der Schwerpunkt auf der Read-Längenverteilung und der Adapterkontamination vor und nach dem Adapter lag Trimmen mit Trim Galore (Version 0.6.4_dev, Babraham Institute) und Cutadapt (Version 2.10) [15]. Unter Verwendung von Salmon [16] wurden die getrimmten Raw-Reads dann quasi auf das Genom des syrischen Goldhamsters abgebildet.

Kurz gesagt, die Genom- und Transkriptreferenzen von GCF{{0}}.1_MesAur1.0 wurden vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) erhalten und mit Referenzsequenzen der ERCC-Spike- bei Kontrollen. Ein Köder-bewusster Transkriptom-Index [17] wurde konstruiert, um ein selektives Alignment mit Lachs zu ermöglichen. Zur Quantifizierung wurden zehn Bootstrap-Replikate verwendet und die Kompensation für sequenzspezifische Verzerrungen, GC-Verzerrungen und 5'- oder 3'-Positionsverzerrung aktiviert.

Anschließend wurden die Quantifizierungsdaten für die ERCC-Spike-in-Kontrollen mit ihrer theoretischen Konzentration korreliert, um Probleme bei der Probenvorbereitung zu erkennen.

Darüber hinaus wurden die genspezifischen Quantifizierungsdaten zunächst gefiltert (nur Gene, die in mehr als einem Replikat mit über 15 Counts vorkommen), mittels regularisierter Log-Transformation (rlog) normalisiert und für die explorative Datenanalyse, zB mit PCA, verwendet. Differentiell exprimierte Gene wurden identifiziert und anschließend für die Pathway-Analyse mit DESeq2 verwendet [18]. Die Expressionsdaten wurden auf signifikant unterschiedlich exprimierte Gene zwischen den Zelllinienpaaren BHK-2P und BHK179, BHK-InV und BHK-2P sowie BHK-InV und BHK179 analysiert. Anschließend wurde die resultierende binär-logarithmische (log2)-fache Änderung mit den Funktionen „lfcShrink“ und „apglm“ in DESeq2 angepasst, um niedrige oder variable Lesezahlen zu kompensieren, die zu einer Überschätzung der Varianz führen können [19].

Die Kriterien für ein signifikant unterschiedlich exprimiertes Gen wurden auf einen maximalen angepassten Wert von {{0}}.05 und einen minimalen absoluten Wert der geschrumpften log2-fachen Änderung von 1 gesetzt. Signalweg und die Kriterien für ein signifikant unterschiedlich exprimiertes Gen wurden auf einen maximalen angepassten Wert von 0,05 und einen minimalen absoluten Wert der geschrumpften log2-fachen Änderung von 1 gesetzt. Pathway- und Anreicherungsanalyse wurde unter Verwendung der Funktion „enrich“ im Clusterprofil (Version 3.16.0) durchgeführt.

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3. Ergebnisse

3.1 Die Anfälligkeit einer Zelllinie für FMDV ist unabhängig von ihrer individuellen Wachstumsrate und Zellteilungszahl

Batch-Experimente mit neun verschiedenen BHK-Suspensionszelllinien wurden über einen Zeitraum von sechs Tagen durchgeführt, und die Lebendzelldichte (VCD) und die Lebensfähigkeit wurden täglich gemessen. Basierend auf früheren Beobachtungen, dass sich die Zelllinien in ihrer Anfälligkeit für MKS-Serotyp Asia{{0}} [12] unterschieden, wurde untersucht, ob eine erhöhte Zellstoffwechsel- und Wachstumsrate mit einer verringerten Anfälligkeit für eine Infektion damit verbunden ist Virus (Tabelle 1). Zwei von drei anfälligen BHK-Suspensionszelllinien sind langsam wachsende Zellen mit kleinen Zellteilungszahlen (cd) von 0.60 (#3) und 0,70 (#9), während die dritte anfällige Zelllinie (#8) dies hat die höchste Wachstumsrate und cd (μ=0.035, cd=1.62) unter allen getesteten Zelllinien.

Der Serumentzug und die Anpassung an das Wachstum bei ACFM hatten in unserem Satz von untersuchten Zelllinien keinen Einfluss auf die Anfälligkeit für FMDV. Zelllinie Nr. 2 ist der langsam wachsende, serumabhängige Vorläufer der BHK-2P-Zelllinien, die mit GMEM und fötalem Rinderserum in Suspension gehalten wird. Während der Anpassung an das Wachstum in ACFM wurden die Zellen auf hohe VCD selektiert, verbunden mit einer hohen Wachstumsrate und cd. Wie die Haupt-BHK-2P-Zelllinie, die für die Studie verwendet wurde, stammen auch die Zelllinien Nr. 4 und Nr. 5 von der Zelllinie Nr. 2, unterscheiden sich jedoch in der Art der Anpassung an ACFM. Alle in ACFM gehaltenen BHK-2P-Zelllinien zeigten ein sehr ähnliches Wachstumsprofil. Eine Anfälligkeit für FMDV Serotyp Asia-1 wurde von keiner dieser Zelllinien während der Anpassung an ACFM erworben, wahrscheinlich weil die ursprüngliche Linie #2 bereits resistent war. In ähnlicher Weise wurde bei der Suspensionszelllinie Nr. 3 keine Änderung der Empfindlichkeit festgestellt. Beim adhärenten Wachstum (vgl. Zelllinie Nr. 1 in [12]) waren die Zellen anfällig für FMDV Asia-1 und behielten diese Eigenschaft während der Anpassung an das Wachstum in Suspension bei. Gleichzeitig erlangten sie nicht das schnelle Wachstumsprofil anderer Suspensionszellen.

3.2 Suspensionszellen weisen weniger primäre Rezeptoren, aber mehr sekundäre Rezeptoren für FMDV auf ihrer Oberfläche auf als adhärente BHK-Zellen

Der erste Schritt für ein Virus, um eine Zelle erfolgreich zu infizieren, ist die Bindung des Viruspartikels an Rezeptormoleküle auf der Zelloberfläche. Um die Unterschiede zwischen adhärent wachsenden BHK-Zellen und BHK-Zellen in Suspension zu analysieren, wurden Antikörper gegen zelluläre Rezeptoren getestet, die an der Interaktion mit der extrazellulären Matrix beteiligt sind und bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der MKS-Infektion spielen. Die Integrine v 3 und v 8 wurden als repräsentative Zellrezeptoren untersucht, die das RGD (Arg-Gly-Asp)-Bindungsmotiv erkennen und mit Serumkomponenten und der extrazellulären Matrix interagieren, aber auch von FMDV als seine natürlichen primären Rezeptoren verwendet werden. Keine der getesteten Suspensionszelllinien (BHK-InV und BHK-2P) exprimierte Integrin v 3 oder v 8 auf der Zelloberfläche. Während der Unterschied zwischen adhärentem BHK und Suspensions-BHK für Integrin v 8 nicht signifikant war (Abb. 1b), exprimierte ein signifikant höherer Prozentsatz an adhärentem BHK179 Integrin v 3 im Vergleich zu den Suspensionszelllinien BHK-InV und BHK-2P ( Abb. 1a).

Auf der Oberfläche beider Suspensionszelllinien wurden hohe Mengen an HS präsentiert. Die Expression von HS war zwischen den replizierten Kulturen von adhärenten BHK179-Zellen sehr unterschiedlich. Im Vergleich zu den Suspensionszelllinien waren weniger Zellen in den BHK179-Kulturen HS-positiv, obwohl der Unterschied auf dem vorbestimmten Signifikanzniveau nicht signifikant war (Abb. 2).

Färbung und mikroskopische Analyse zeigten große Unterschiede in der Anordnung des Aktin-Zytoskeletts zwischen adhärenten und suspendierten Zellen (Abb. 3). Die Aktinfilamente in den adhärenten BHK179-Zellen sind in einem feinen Netzmuster gleichmäßig über die gesamte Zelle verteilt (Abb. 3a), während in Suspension wachsende Zellen eine diffuse Aktinfärbung aufwiesen (Abb. 3b). Interessanterweise war die Menge an filamentösem Aktin zwischen den Suspensionszelllinien BHK-InV und BHK-2P unterschiedlich. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) nach Phalloidin-Färbung war in BHK-InV-Zellen im Vergleich zu BHK-2P signifikant höher, was auf einen höheren Gehalt an filamentösem Aktin in diesen Zellen hinweist (Abb. 3c).

3.3 Suspensionszellen unterscheiden sich in der Transfektionseffizienz, aber nicht in ihrer Fähigkeit, Oberflächenproteine ​​zu präsentieren

Aufgrund der Unterschiede in der Aktin-Konformation zwischen adhärenten und suspendierten Zellen wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Übertragbarkeit und der Fähigkeit, Proteine ​​auf ihrer Oberfläche zu präsentieren, untersucht. Im Allgemeinen ist die Transfektionseffizienz, gemessen an der Expression von EGFP, in Suspensionszellen reduziert (Abb. 4a). Bei Verwendung einer niedrigen Dosis des Transfektionsreagenzes exprimierte ein signifikant höherer Prozentsatz an adhärenten Zellen EGFP im Vergleich zu den Suspensionszellen. Wenn eine hohe Dosis an Transfektionsreagenz verwendet wurde, wurde ein höherer Prozentsatz an Suspensionszellen erfolgreich transfiziert, obwohl der Unterschied zwischen hohen und niedrigen Dosen nicht signifikant war. Um die Frage zu beantworten, ob Suspensionszellen noch Proteine ​​wie zelluläre Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentieren können, wurden Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das für das VSV-G-Protein kodiert (Abb. 4b). Eine Reihe von Zellen wurde vor dem Färben permeabilisiert, um der Möglichkeit Rechnung zu tragen, dass das G-Protein exprimiert, aber nicht auf der Zelloberfläche präsentiert wurde. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Fähigkeit, das VSV-G-Protein zu exprimieren und zu präsentieren, zwischen adhärenten und Suspensionszellen, weder bei Verwendung einer niedrigen noch einer hohen Dosis an Transfektionsreagenz.

3.4 Die Transkriptomanalyse zeigt Unterschiede in der Expression von Genen, die mit der extrazellulären Matrix in Verbindung stehen, zwischen Suspensionszellen

Eine Transkriptomanalyse wurde durchgeführt, um die Unterschiede zwischen adhärent wachsenden BHK-Zellen und BHK-Zellen in Suspension weiter zu untersuchen und um aufzuklären, warum sich Suspensionszellen in ihrer Anfälligkeit für FMDV unterscheiden. Eine adhärente BHK-Zelllinie (BHK179), die in mit FBS ergänztem MEM kultiviert wurde, sowie eine schnell wachsende FMDV-anfällige Zelllinie (BHK-InV) und eine schnell wachsende resistente Zelllinie (BHK-2P), beides angepasst an ACFM, wurden für die Analyse ausgewählt.

Eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) hob die enge Beziehung zwischen den biologischen Replikaten der einzelnen Zelllinien hervor (Abb. 5a). Alle Wiederholungen der gleichen Zelllinie sind im Diagramm eng beieinander angeordnet, mit wenig Hinweis auf Chargen-zu-Chargen-Effekte. Die erste Hauptkomponente (die 81 Prozent der Varianz im normalisierten Datensatz ausmacht) wurde als transkriptioneller Unterschied zwischen Zellen, die in Suspension wachsen, und Zellen, die in Adhärenz wachsen, interpretiert, während die zweite Hauptkomponente (15 Prozent der Varianz) den Unterschied zwischen darstellt Suspensionszelllinien BHK-2P und BHK-InV, die möglicherweise mit einer Anfälligkeit für eine MKS-Infektion in Verbindung gebracht werden. Zusammen konnten die ersten beiden Hauptkomponenten 96 Prozent der im Datensatz gefundenen Varianz erklären, was darauf hinweist, dass die Transkriptomanalyse relevante Unterschiede zwischen den drei Zelllinien identifizierte.

Die kleinste Anzahl unterschiedlich exprimierter Gene wurde beim Vergleich von BHK-InV mit BHK-2P gefunden (590 hochreguliert; 304 herunterreguliert). Ähnliche Zahlen wurden beim Vergleich von entweder BHK-2P oder BHK-InV einzeln mit BHK179 (1527 und 1519 hochreguliert; 1308 bzw. 943 herunterreguliert) beobachtet (Fig. 5b). Als die beiden Suspensionszelllinien (BHK-InV und BHK-2P) kombiniert und mit der adhärenten BHK179-Zelllinie verglichen wurden, wurden 1814 Gene unterschiedlich exprimiert. Während beim Vergleich von BHK179 mit BHK-InV 411 Gene ausschließlich unterschiedlich exprimiert werden, werden zwischen BHK179 und BHK-2P fast doppelt so viele (701 Gene) ausschließlich unterschiedlich exprimiert. Zwischen den beiden Suspensionszelllinien wurden ausschließlich 104 Gene unterschiedlich exprimiert.

Beim Vergleich der unterschiedlich exprimierten Gene der FMDV-empfindlichen Zelllinien BHK179 und BHK-InV mit der FMDV-resistenten Zelllinie BHK-2P wurde festgestellt, dass eine Untergruppe von 553 Genen in beiden Vergleichen unterschiedlich exprimiert wurde ( Abb. 5c). Da diese Gene möglicherweise an der MKS-Empfindlichkeit beteiligt sind, wurde eine GO-Term-Anreicherungsanalyse durchgeführt, die ergab, dass viele dieser Gene mit den zellulären Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), Zellmembranen und Zell-Zell-Verbindungen zusammenhängen (Abb. 5d). .

Da wir Unterschiede zwischen den Zelllinien im Zusammenhang mit ECM-Wechselwirkungen beobachteten, wurde das Transkriptom erneut analysiert, wobei der Schwerpunkt auf der Expression der Integrine v 1, v 3, v 6, v 8 sowie Aktin lag, die alle potenziell relevant für die Anfälligkeit für eine MKS-Infektion sind (Abb. 5e). Mit Ausnahme von ACTA2 gab es keinen signifikanten Unterschied in der Expression von Aktin-verwandten Genen zwischen BHK-InV- und BHK-2P-Zellen auf mRNA-Ebene. Die normalisierten Genzahlen für alle untersuchten Aktin-verwandten Gene waren in der adhärenten Zelllinie BHK179 signifikant höher als in den Suspensionszelllinien (S1 Abb).

Alle drei Zelllinien exprimierten ähnliche Mengen an ITGAV-Transkripten, die für die Integrin-Untereinheit v kodierten, zeigten jedoch eine unterschiedliche Expression für die Integrin-Untereinheiten. Im Detail exprimierten die Suspensionszelllinien BHK-2P und BHK-InV deutlich weniger ITGB1, ITGB3 und ITGB6 im Vergleich zur adhärenten Zelllinie BHK179. ITGB3 und ITGB8 wurden zwischen den Suspensionszelllinien BHK-2P und BHK-InV signifikant unterschiedlich exprimiert. Interessanterweise war ITGB8 das einzige kodierende Gen für die Integrin-Untereinheit, das in beiden FMDV-empfindlichen Zelllinien BHK179 und BHK-InV im Vergleich zur FMDV-resistenten Zelllinie BHK-2P stark überexprimiert war (Abb. 5e).

Cistanche kann Nieren nähren und die Nierenfunktion verbessern

4. Diskussion

Die Anpassung von Zellen an das Wachstum in Suspension und in serumfreien Medien ist ein zeitaufwändiger und schrittweiser, aber notwendiger Prozess in der Biotechnologie, um ertragreiche Zelllinien zu erzeugen, die zur Herstellung von Antikörpern, Impfstoffantigenen oder anderen Proteinen verwendet werden [1, 8 ]. Allerdings ist dieser Prozess immer mit der Gefahr behaftet, dass Zellen im Vergleich zum ursprünglichen Zellmaterial unerwünschte Eigenschaften erhalten [7]. Bei der Herstellung von Impfstoffantigenen ist die Empfindlichkeit der Zelllinie für das Zielvirus von großer Bedeutung. Für das Maul- und Klauenseuche-Virus (MKS) ist es ein bekanntes Phänomen, dass bestimmte BHK-Zelllinien bei wiederholter Subkultivierung infektionsresistent sind oder ihre Anfälligkeit verlieren [20–22]. Darüber hinaus können die antigenen Eigenschaften des Virus je nach Wirtszelle unterschiedlich sein [9].

Suspensionszellen wachsen unabhängig von einer Oberfläche und werden von sauerstoffreichen Nährmedien umhüllt, wodurch sie schnell wachsen können. Die schnelle Vermehrung von Zellen ist ein erforderliches Merkmal, um die Kultur einfach und in kurzer Zeit auf große Volumina zu skalieren. Die Entfernung von Serum aus dem Medium ist notwendig, um Kosten und das Kontaminationsrisiko zu reduzieren und Downscale-Prozesse zu vereinfachen [23, 24].

Die Batch-Wachstumsanalyse verschiedener BHK-Suspensionszelllinien sollte bestimmen, ob die Selektion auf eine schnell wachsende Zellpopulation unter serumfreien Bedingungen der Vermehrung von MKS abträglich ist. Tatsächlich wuchsen zwei von drei anfälligen Zelllinien langsam, aber ihre Anfälligkeit für FMDV erwies sich als unabhängig von ihrem Wachstumsstoffwechsel. Es ist wahrscheinlicher, dass die FMDV-Empfindlichkeit bereits während der anfänglichen Anpassung an das Wachstum in Suspension verloren geht (oder erhalten bleibt). Die Ablösung der Zellen von der Oberfläche und der Serumentzug in den folgenden Anpassungsschritten an das Suspensionswachstum führt zu Veränderungen im Expressionsniveau von Oberflächenproteinen und am Zytoskelett beteiligten Proteinen [7].

Integrine sind eine wichtige Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die in die Zellmembran integriert sind und die Signalübertragung von Zelle zu Zelle sowie eine starke Verbindung zwischen der Zelle und der Oberfläche durch die Bindung von Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) vermitteln [10, 25 ]. Die Regulierung des Zellzyklus, die Organisation des Zytoskeletts und die Translokation entstehender Rezeptormoleküle zur Zellmembran hängen von Integrinen ab [25]. Bei vielen Integrinen wird die Bindung der ECM sowie die Bindung von Liganden, die den Zellen durch die Zugabe von Serum zum Kulturmedium bereitgestellt werden, durch das RGD-Motiv vermittelt [6, 25] und ändert sich wahrscheinlich, wenn die Zelle schaltet von adhärentem auf Suspensionswachstum um. Die Erkennung des RGD-Motivs durch Integrine wird auch von FMDV genutzt, um eine rezeptorvermittelte Endozytose des Viruspartikels einzuleiten [26]. Das RGD-Motiv in VP1 von FMDV ist hoch konserviert [27], und die Integrine v 1, v 3, v 6 und v 8 sind bekannte Rezeptoren, die von FMDV in vivo und in vitro verwendet werden [28–31]. Da die vermuteten Unterschiede im Zelloberflächenproteom zwischen adhärenten und Suspensionszellen auch entscheidend für die Unterschiede in der Anfälligkeit für eine MKS-Infektion sein könnten, wurden Antikörper, die an das Integrin v 3 und v 8 binden, verwendet, um eine adhärente BHK-Zelllinie sowie a anfällige und eine resistente Suspensions-BHK-Zelllinie. Es wurde keine v6-Färbung durchgeführt, da zuvor gezeigt wurde, dass dieses Integrin nicht auf der Oberfläche von BHK-Zellen exprimiert wird [32], obwohl ITGB6-mRNA nachweisbar ist. In ähnlicher Weise scheint v8-Integrin trotz des in BHK179- und BHK-InV-Zellen festgestellten hohen Grades an ITGB8-mRNA-Expression im Allgemeinen nicht auf der Oberfläche von BHK-Zellen präsentiert zu werden. Integrin v 3 wurde in geringem Maße auf der adhärenten Zelllinie gefunden, aber nicht auf den Suspensionszelllinien.

Abgesehen von Integrinen können Ligandenbindung, Internalisierungsereignisse und intrazelluläre Signalübertragung durch Heparansulfat (HS)-Proteoglykane vermittelt werden [33], und der Erwerb von HS als sekundärer Rezeptor wird oft nach wiederholter Passage von FMDV in Kultur beobachtet [34]. Spezifische Antikörperfärbung zeigte reichlich HS auf beiden Suspensionszelllinien und in geringerem Ausmaß auch auf den adhärenten BHK-Zellen. Es ist bekannt, dass Mutationen im Genom von FMDV, die zu Veränderungen in den viralen Kapsidproteinen führen, um die Verwendung von HS als Rezeptor zu ermöglichen, das Virus im natürlichen Wirt abschwächen [35]. Die Verfügbarkeit von HS könnte daher ein entscheidender Faktor für die veränderte Antigenität der FMDV-Unabhängigkeit der Zelllinie sein, an die das Virus adaptiert wurde.

Da die zelluläre Ablösung mit Veränderungen des Aktin-Myosin-Kontraktionsmechanismus verbunden ist [7] und die Kultivierung von Zellen in Suspension andere Voraussetzungen für das Überleben mit sich bringt, z von großem Interesse in dieser Studie. Die mikroskopische Analyse zeigte eine konformative Umordnung des Zytoskeletts von einer retikulären Verteilung in adhärenten wachsenden Zellen zu einer dichten kugelförmigen Struktur unter Suspensionsbedingungen. Dies könnte ein Anpassungsmechanismus an die oben erwähnte hohe Scherspannung sein und tritt bekanntermaßen auch in CHO-Zellen unter den gleichen Bedingungen auf [6]. Aber es ist auch bemerkenswert, dass, während es keinen signifikanten Unterschied in der Expression der meisten Actin-Gene zwischen BHK-InV- und BHK-2P-Zellen auf mRNA-Ebene gab, signifikant mehr filamentöses Actin-Protein in den FMDV-empfindlichen BHK nachgewiesen wurde -InV als im FMDV-resistenten BHK-2P. Dies kann mit unterschiedlichen Polymerisationsraten von globulärem Aktin zu filamentösem Aktin zusammenhängen.

Zumindest in adhärenten Zellen hängt der Eintritt von FMDV von der Aktindynamik ab. Der virale Eintritt induziert Aktin-Rüschen und eine Störung des Aktin-Filament-Netzwerks durch die Umwandlung von filamentösem Aktin in globuläres Aktin wurde im frühen Stadium der Infektion beschrieben [36–38]. Nach dem zytopathischen Effekt (CPE) zu urteilen, der in adhärenten BHK-Zellen beobachtet wird, wenn sie mit FMDV infiziert sind, durchläuft das Zytoskelett in vielen seiner Komponenten intensive Umlagerungen [38]. Ein solcher CPE wird in Suspensionszellen aufgrund ihrer bereits kugelförmigen Form nicht gesehen, aber der erhöhte Aktingehalt kann dem Virus einen gewissen Vorteil verschaffen. Aufgrund der Unterschiede im Aktin-Zytoskelett wurden Transfektionsexperimente durchgeführt, um die Transfektionseffizienz zwischen Suspensions- und adhärentem BHK zu vergleichen und um festzustellen, ob das dichte Zytoskelett der Suspensionszellen die Präsentation von Proteinen auf der Zelloberfläche behindert. Es ist allgemein bekannt, dass Suspensionszelllinien sehr schwer zu transfizieren sind, was durch die reduzierte Anheftung des Transfektionskomplexes an die Zellmembran und die daraus resultierende reduzierte Aufnahme der DNA-Payload verursacht wird [39]. Dies wurde auch durch unsere Versuche bestätigt. Aber obwohl die Transfektionseffizienz in BHK-2P-Zellen im Vergleich zu der adhärenten BHK-Zelllinie verringert war, gab es keinen Unterschied in der Fähigkeit, das transfizierte VSV-G-Protein auf der Zelloberfläche zu präsentieren. Zwischen den pEGFP-N1- und pVSV-G-Expressionsplasmiden in BHK-2P-Zellen wurde ein Unterschied im Prozentsatz gefärbter Zellen beobachtet. Dies wurde nicht weiter untersucht, kann aber durch eine unterschiedliche Nachweisgrenze zwischen der zur Visualisierung von VSV-G verwendeten Immunfluoreszenzfärbung und der angeborenen Fluoreszenz von EGFP verursacht werden.

Schließlich wurde eine Transkriptomanalyse durchgeführt, um mehr Informationen über die transkriptionellen Unterschiede zwischen adhärenten und Suspensions-BHK-Zellen einerseits und zwischen FMDV-empfindlichen und FMDV-resistenten BHK-Zelllinien andererseits zu erhalten. Unsere Ergebnisse stimmen mit anderen Studien über transkriptomische Veränderungen in CHO-, MDCK- oder HEK-Zellen während des Übergangs von adhärentem Wachstum zu Suspensionswachstum überein. Im Allgemeinen hängen die meisten Veränderungen mit der Zytoskelettstruktur, dem Zellstoffwechsel und den Wechselwirkungen zwischen ECM-Komponenten zusammen und werden für Suspensionszellen hochreguliert [7, 40, 41]. Überraschenderweise zeigte die FMDV-resistente BHK-2P-Suspensionszelle eine Herunterregulierung dieser Gensätze, was auch die verringerten Aktinspiegel in BHK-2P im Vergleich zu den BHK-InV-Zellen erklären könnte. Eine spezifische Analyse der Expression der Integrin-Untereinheit ergab ähnliche Niveaus von Transkripten der Integrin-Untereinheit V in allen drei Zelllinien. Die höchste Expression in allen Zelllinien wurde für die Integrin-Untereinheit 1 gefunden. Es ist wichtig zu beachten, dass Integrin 1 Heterodimere mit zehn verschiedenen Ketten bilden kann und von den meisten Säugetierzellen konstitutiv exprimiert wird [6, 42]. Ebenso ist die V-Untereinheit in der Lage, ein Heterodimer mit fünf verschiedenen Ketten zu bilden, aber 6 und 8 werden nur in Kombination mit V auf der Zelloberfläche präsentiert [42]. Dies wird durch die beobachtete Häufigkeit von Transkripten der einzelnen Integrin-Untereinheiten genau wiedergegeben. Die erhöhte Transkription von 3 in adhärenten Zellen korreliert auch gut mit dem höheren Signal für Integrin v 3 in den Antikörperfärbungsexperimenten. Andererseits spiegelten sich die beobachteten Unterschiede in den ITGB3- und ITGB8-mRNA-Spiegeln zwischen BHK-2P und BHK-InV nicht in der Oberflächenfärbung wider. Wir konnten nicht klären, ob dies lediglich auf die unterschiedliche Empfindlichkeit zwischen den mRNA- und Proteinquantifizierungsmethoden zurückzuführen war oder auf eine posttranskriptionelle Blockierung der Proteinexpression oder Oberflächenpräsentation hinweist [43]. Insgesamt exprimierten die Suspensionszelllinien BHK-2P und BHK-InV deutlich weniger ITGB1-, ITGB3- und ITGB6-mRNA im Vergleich zur adhärenten Zelllinie.

5. SchlussfolgerungenIn

Zusammenfassend ist es bei der Herstellung von Suspensionszellen von entscheidender Bedeutung, einen elterlichen Zellklon mit bekannten Eigenschaften zu verwenden und die resultierende Zellpopulation während des Anpassungsprozesses sorgfältig zu screenen, um sicherzustellen, dass die Zelllinie in diesem Fall wesentliche Merkmale beibehält , die Anfälligkeit für MKS. Darüber hinaus sollen moderne Methoden wie FACS-Analyse und Transkriptomik zur weiteren Charakterisierung von Produktionszelllinien eingesetzt werden.

Cistanche kann Nieren nähren und die Nierenfunktion verbessern

Danksagungen

Wir danken Patrick Zitzow für seine hervorragende technische Unterstützung.

Autorenbeiträge

Konzeption:Veronika Dill, Michael Eschbaumer.

Formale Analyse:Veronika Dill, Florian Pfaff.

Fördermittelakquise:Aline Zimmer, Martin Beer.

Ermittlung:Veronika Dill.

Methodik:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Projektverwaltung:Martin Beer.Quellen: Aline Zimmer.

Aufsicht:Michael Eschbaumer.

Visualisierung:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Schreiben – Originalentwurf:Veronika Dill.

Schreiben – Review & Lektorat:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, Michael Eschbaumer.

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