Altern und Langlebigkeit waren schon immer verführerische Themen für Organismen. Als eine Art adulte Stammzelle mit der Fähigkeit zur Selbsterneuerung

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Abstrakt:Die Seneszenz in mesenchymalen Stammzellen (MSCs) behindert nicht nur die Anwendung von MSCs in der regenerativen Medizin, sondern ist auch eng mit der biologischen Alterung und der Entwicklung degenerativer Erkrankungen korreliert. In dieser Studie untersuchten wir die Anti-Aging-Wirkung von Curcumin (Cur) auf MSCs (cBMSCs), die aus dem Knochenmark des Hundes stammen, und klärten den potenziellen Wirkungsmechanismus basierend auf der Modulation der Autophagie weiter auf. cBMSCs wurden in vitro mit Standardverfahren erweitert, um ein Zellmodell vorzeitiger Seneszenz zu konstruieren.Cistanche-Dosierung redditUnsere Beweise zeigen, dass im Vergleich zur dritten Passage von cBMSCs viele typische Seneszenz-assoziierte Phänotypen in der sechsten Passage von cBMSCs beobachtet wurden. Die Cur-Behandlung kann das cBMSC-Überleben verbessern und die cBMSC-Seneszenz verzögern, laut Beobachtungen, dass die Cur(1 μM)-Behandlung die Effizienz der koloniebildenden Einheit-Fibroblasten (CFU-Fs) verbessern und die mRNA-Expression pluripotenter Transkriptionsfaktoren (SOX) hochregulieren kann (SOX{{5}) } und Nanog) sowie Hemmung der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase (SA- -gal)-Aktivitäten und der mRNA-Expression der Seneszenz-bezogenen Marker (pl6 und p21) und entzündungsfördernder Moleküle (Tumor-Nekrose-Faktor- (TNF-a) und Interleukin-6(IL-6)). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Cur（0.1 μM~10μM） die autophagische Aktivität erhöht, was durch Hochregulierung der mit Mikrotubuli assoziierten leichten Kette 3 des Proteins 1 (LC3), unc51--ähnlicher Autophagie-aktivierender Kinase, identifiziert wurde -1 (ULK1), Autophagie-verwandtes Gen (Atg)7 und Atg12 und die Erzeugung von Typ II der leichten Kette 3 (LC3-II), wodurch autophagische Vakuolen und saure Vesikelorganellen erhöht werden, wie z sowie eine signifikante Abnahme des p62-Proteinspiegels verursachen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der Autophagie-Aktivator Rapamycin (RAP) und Cur die Alterungsmerkmale von cBMSCs teilweise verbessern, während der Autophagie-Inhibitor 3-Methyladenin (3-MA) die Alterung von cBMSCs und die Cur-Behandlung verschlimmerte in der Lage, die unterdrückte Autophagie wiederherzustellen und der 3-MA-induzierten cBMSC-Seneszenz entgegenzuwirken. Daher hebt unsere Studie die wichtige Rolle der Cur-induzierten Autophagie und ihre Auswirkungen auf die Verbesserung der cBMSC-Seneszenz hervor und liefert neue Erkenntnisse zur Verzögerung der Seneszenz und zur Verbesserung des therapeutischen Potenzials von MSCs.

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Schlüsselwörter:Kurkumin;Seneszenz; Autophagie; mesenchymale Stammzellen aus Hundeknochenmark

1. Einleitung

Altern und Langlebigkeit waren schon immer verführerische Themen für Organismen. Als eine Art adulter Stammzellen mit der Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Immunsuppression, Differenzierung und Migration befinden sich mesenchymale Stammzellen (MSCs) ausgiebig in verschiedenen Geweben und Organen, wie Knochenmark, Fettgewebe, Fruchtwasser, Plazenta, Nabelschnur Schnur und Muskel [1,2] und spielen eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase während der gesamten Lebensdauer eines Organismus [3,4]. Immer mehr Beweise haben gezeigt, dass die biologische Alterung und die Entwicklung vieler degenerativer Erkrankungen der MSC-Seneszenz zugeschrieben werden können [5,6]. Darüber hinaus sind MSCs vielversprechende Quellen für zellbasierte regenerative Therapien, müssen jedoch normalerweise in vitro erweitert werden, um die minimale Transplantationszahl von MSCs (20-100 Millionen) für Behandlungen zu erreichen [7]. Die In-vitro-Kultur ist jedoch nicht in der Lage, die In-vivo-Mikroumgebung von MSCs vollständig zu simulieren, und löst unweigerlich zelluläre Seneszenz aus [8,9]. Schädigung [11], oxidativem Stress [12] und Onkogenaktivierung [13] und führt schließlich zur Beendigung der Zellteilung. Darüber hinaus zeigen alternde MSCs eine negative Wirkung auf biologische Funktionen, einschließlich Immunmodulation, Differenzierung und Migration [14]. Es wurde viel Arbeit unternommen, um wirksame Strategien zur Verzögerung der Seneszenz bei MSCs zu etablieren. Kürzlich wurden mehrere aus Kräutern gewonnene Produkte vorgeschlagen, um die Gesundheit und Langlebigkeit des Organismus zu fördern und könnten vielversprechende Instrumente zur Verzögerung der MSC-Seneszenz sein [15].

Cistanche kann Anti-Aging

Curcumin(Cur), ein hydrophobes Polyphenol, das aus Kurkuma der traditionellen chinesischen Medizin gewonnen wird, hat aufgrund seiner entzündungshemmenden, antioxidativen, antiapoptotischen, Antitumor- und Anti-Aging-Wirkung in Gewebezellen und einigen Krankheitsmodellen große Aufmerksamkeit erregt [{ {4}}]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Cur gesundheitsbezogene Vorteile bei altersbedingten Erkrankungen hat, einschließlich osteoartikulärer, neurologischer, reproduktiver und kardiovaskulärer Erkrankungen [20-24]. Das Altern ist mit muskuloskelettalen Veränderungen und dem Beginn und Fortschreiten von osteoartikulären Erkrankungen verbunden. Es wurde festgestellt, dass eine chronische diätetische Intervention mit Cur die motorische Funktion der Hand und der Finger bei Affen mittleren Alters verbessert und positive Auswirkungen auf die gealterte Skelettmuskulatur hatte [25,26]. Verfügbare Daten von Buhrmann und Kollegen haben gezeigt, dass Cur umweltbedingte Osteoarthritis abschwächen kann, indem es das Überleben von Chondrozyten und Entzündungsreaktionen ausgleicht [27,28]. Darüber hinaus übt Cur durch die Vermittlung von Autophagie und Entzündung neuroprotektive Wirkungen aus und kann daher eine wirksame Therapie für Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alexander-Krankheit, der Alzheimer-Krankheit und der Parkinson-Krankheit sein [29,30].

Tatsächlich könnte die Tatsache, dass Cur eine pleiotrope Aktivität besitzt, auf ihre Aktivierungs- und Schutzwirkung auf MSCs zurückgeführt werden [31,32]. Mehrere Studien haben bestätigt, dass Cur an der Regulierung der immunmodulatorischen Fähigkeiten beteiligt ist; Das unterschiedliche Potenzial von MSCs für verschiedene Zelllinien (Neurozyten, Chondrozyten, Adipozyten und Osteoblasten) und mehrere Signalmechanismen sind an diesem Prozess beteiligt [2831, 33-35]. Darüber hinaus wird Cur auch als gutes Antioxidans angesehen, um die Lebensdauer von aus Rattenfettgewebe stammenden mesenchymalen Stammzellen (ADSCs) aufgrund der Erhöhung der Genexpression der Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) zu verbessern [36]. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die Hemmung von p65 durch Cur zelluläre Seneszenz und entzündliche Aktivierung in menschlichen, aus der Nabelschnur stammenden MSCs verhindern kann [37].Cistanche-Extrakt VorteileOffensichtlich wurde aufgrund ihres enormen therapeutischen Potenzials mehr Aufmerksamkeit auf die Anti-Aging-Effekte von Cur in MSCs gerichtet, aber die Mechanismen, die diesem Effekt zugrunde liegen, sind noch unklar. Einige Beweise aus In-vitro-Studien haben bestätigt, dass die vorteilhaften Wirkungen von Cur auf seine Modulation der Autophagie zurückzuführen sind [29, 38-41]. Han und Kollegen zeigten, dass Cur humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) vor H2O2--induzierten oxidativen Schäden schützen kann und dass positive Effekte durch die Verstärkung der Autophagie über Phosphatidylinositol-3--Kinase (PI3K)/Akt/ auftreten. Säugetier Ziel der Rapamycin (mTOR) Hemmung [40]. Eine andere Studie zeigte, dass Cur in der Lage ist, das Zellüberleben zu fördern, indem es die durch Hypoxie/Reoxygenierung (H/R) induzierte Apoptose und übermäßige Autophagie bei Kardiomyozyten hemmt [41]. Ob Cur als positiver oder negativer Regulator der Autophagie fungiert, hängt daher vom stresserzeugenden Stimulus und der zellulären Umgebung ab, und es sind weitere Details erforderlich, um festzustellen, ob die Modulation der Autophagie durch Cur eine wirksame Strategie zur Verzögerung der MSC-Seneszenz ist. Als Prinzip des Abbau- und Recyclingweges für intrazelluläre Substanzen spielt die Autophagie eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase und dem Widerstand gegen Umweltbelastungen und hat das enorme Potenzial zur Verzögerung der zellulären Seneszenz und zur Behandlung altersbedingter Krankheiten gezeigt. Organellendysfunktion und Akkumulation von toxischen Metaboliten sind die Schlüsselmerkmale von seneszenten MSCs [42], was auf eine mögliche Verbindung zwischen Autophagie und Seneszenz hindeutet. Ma und Kollegen fanden heraus, dass die autophagische Aktivität gealterter BMSCs im Vergleich zu jungen BMSCs verringert war und dass der Autophagie-Inhibitor 3-Methyladenin (3-MA) die Seneszenz bei jungen MSCs beschleunigen konnte; im Gegensatz dazu fanden sie heraus, dass der Autophagie-Aktivator Rapamycin (RAP) die biologischen Eigenschaften gealterter BMSCs teilweise wiederherstellen konnte[5]. Eine kürzlich durchgeführte Studie untersuchte die Rolle der modulierten Autophagie durch den Einsatz von RAP und 3-MA bei der durch D-Galactose (D-gal) induzierten MSC-Seneszenz und zeigte, dass RAP die MSC-Seneszenz bemerkenswert linderte [43]. Interessanterweise haben mehrere Studien gezeigt, dass bei seneszenten MSCs eine Zunahme der Autophagie beobachtet wird und dass die Autophagie für die Aufrechterhaltung der MSC-Seneszenzprozesse unerlässlich ist [44,45]. Ob Autophagie als positiver oder negativer Regulator der Seneszenz bei MSCs angesehen werden könnte, bleibt daher widersprüchlich und mehrdeutig. Folglich wäre es interessant, die Beziehung zwischen Autophagie, MSC-Seneszenz und Cur zu untersuchen, was eine breitere Perspektive für die Verzögerung der Seneszenz und die Verbesserung des therapeutischen Potenzials von MSCs bieten könnte.

In dieser Studie war unser primäres Ziel aufzuklären, ob die Cur-Behandlung die aus dem Knochenmark des Hundes stammende MSC(cBMSC)-Seneszenz verzögern kann und ob der zugrunde liegende Mechanismus mit der Modulation der Autophagie korreliert. Zu diesem Zweck bewerteten wir die phänotypische Charakterisierung, autophagische Aktivität und Genexpression nach Cur-Exposition in seneszenten cBMSCs sowie, ob die Beziehung zwischen Autophagie und ihren Auswirkungen auf die Seneszenz von cBMSCs mithilfe von 3-MA und RAP bestimmt wird .

2. Ergebnisse

2.1. Eigenschaften von cBMSCs

cBMSCs wurden in vitro mit Standardverfahren expandiert und es wurde gezeigt, dass sie über neun Generationen stabil passagiert werden (Daten nicht gezeigt). Die cBMSCs zeigten während des gesamten Kultivierungsprozesses ein an Kunststoff haftendes und Fibroblasten-ähnliches Aussehen (Abbildung 1A). Die Differenzierungskapazität von cBMSCs wurde durch adipogene und osteogene Induktion bestätigt (Abbildung 1B, C). Der Immunphänotyp von cBMSCs wurde mittels Durchflusszytometrie bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellpopulation CD90, CD105 und ITGB1 positiv exprimierte und CD31, CD34 und CD45 negativ exprimierte, was eher auf ihren mesenchymalen als auf ihren hämatopoetischen Ursprung hindeutet (Abbildung 1 und Tabelle 1).

2.2.cBMSCs weisen während der In-vitro-Expansion zunehmend Seneszenzmerkmale auf

Frühpassage-cBMSCs (P1 und P3) zeigen eine lange fusiforme oder dreieckige Form und sind nach dem Wachstum in vitro zu einem Whirlpool angeordnet (Abbildung 2A). Anschließend zeigten cBMSCs im Laufe der langfristigen Kultivierung in vitro allmählich alterungsassoziierte Phänotypen, die durch eine vergrößerte und flache Morphologie und eine Verringerung der Proliferation gekennzeichnet waren (Abbildung 2A, B). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse eines Colony Forming Unit-Fibroblast (CFU-F)-Assays, dass sowohl die Anzahl der CFU-F als auch die Größe der Kolonien entlang der Kulturpassagen signifikant verringert wurden (Abbildung 2C), was mit der herunterregulierten mRNA übereinstimmt Ausdruck der pluripotenten Transkriptionsfaktoren Nanog und SOX-2 in der 6. und 9. Passage (Abbildung 2G).

Seneszenz-assoziierte -Galactosidase (SA- -gal) ist ein lysosomales Enzym, dessen Aktivität stark mit der zellulären Seneszenz korreliert [46]. Die Ergebnisse der SA- -gal-Färbung zeigten, dass die Zahl der SA- -gal-positiven Zellen von 7,5 ± 2,4 Prozent (P3) auf 65,0 ±5,0 anstieg. Prozent (P6) bzw. 87,3 ± 3,3 Prozent (P9) (Abbildung 2D).Cistanche Dschingis KhanDarüber hinaus wurde eine erhöhte Expression von Zellzyklus-Kinase-Inhibitoren (p21 und p16) und entzündungsfördernden Molekülen (TNF- und IL-6), die als Komponenten eines Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) wirken, nachgewiesen in der 6. und 9. Passage (Abbildung 2E, F). Daher weisen cBMSCs eine passageabhängige Zunahme von seneszenten Phänotypen auf und stellen die Proliferation bei der 9. Passage ein.

2.3. Cur lindert den Seneszenzzustand von cBMSCs

Die cBMSCs der 6. Passage wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von Cur in Dosen von 0,1,0,5,1,5 oder 10μmol/ml (μM) für inkubiert 12 h, 24 h, 48 h und 72 h, und ihre zelluläre Lebensfähigkeit wurde mit CCK-8 bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass Cur (0.1-10 uM) keine toxische Wirkung in cBMSCs hervorruft und spürbare Auswirkungen auf die Erhöhung der Lebensfähigkeit von cBMSCs nach 24-stündiger Behandlung hat (Abbildung 3A). Um die Wirkung von Cur auf die zelluläre Seneszenz zu bewerten, wurden cBMSCs verschiedenen Konzentrationen von Cur (0,1, 1 und 10 uM) für 24 h ausgesetzt. Das Ergebnis zeigte, dass die Anzahl der SA- -gal-positiven Zellen in cBMSCs nach der Behandlung mit Cur (1 μM und 10 uM) im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert war (Abbildung 3B). CFU-F-Assays wurden verwendet, um die Auswirkungen von Cur auf die Selbsterneuerungseffizienz von cBMSCs (P6) zu bewerten. Es wurde festgestellt, dass die Dosis von 1 μM Cur die wirksamste Konzentration zur Verbesserung der Effizienz der CFU-F von cBMSCs ist. Die Dosis von 10 μM Cur hatte jedoch nachteilige Auswirkungen auf die Selbsterneuerungseffizienz von cBMSCs (Abbildung 3C). Darüber hinaus wurde die seneszenzlindernde Wirkung von Cur bei einer Dosis von 1 μM beobachtet, die sich in der Herunterregulierung von p16 manifestierte. IL-6 und TNF- und Hochregulierung der Expression von Nanog und SOX-2 (Abbildung 3D-F).cistanche lebensverlängerungZusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Cur bei einer Dosis von 1 μM wirksam zytoprotektive Wirkungen auf seneszente cBMSCs ausüben kann.

2.4. Cur-Behandlung verstärkte autophagische Aktivität in cBMSCs

Die funktionelle Aktivierung der Lysosomen spielt eine entscheidende Rolle im Verlauf der Autophagie, und Störungen der lysosomalen Ansäuerung wirken sich nachteilig auf die lysosomale Abbaufunktion aus [38]. Daher wurde die autophagische Aktivität zuerst durch LysoTracker-Färbung nachgewiesen, die die lysosomale Ansäuerung überwachen kann. Das Ergebnis zeigte, dass die Vorkonditionierung mit Cur dosisabhängig die Intensität der roten Fluoreszenz in cBMSCs verstärkte, was darauf hindeutete, dass die Ansäuerung der Lysosomen erhöht worden war (Abbildung 4D).

Um die Auswirkungen von Cur auf die Autophagie von cBMSCs weiter zu bewerten, haben wir die Autophagosomen-Marker Mikrotubuli-assoziiertes Protein 1A/1Belight-Kette 3 (LC3) und p62/SQSTM1 verwendet, die entscheidende Marker für die Bewertung des autophagischen Flusses sind[47,48 ]. Die erhöhte autophagische Aktivität wurde in cBMSCs nach Cur-Exposition beobachtet, wie durch eine dosisabhängige Zunahme der Umwandlung von LC{{10}}I zu LC3-}II neben dem beschleunigenden p62 gezeigt wird Abbau (Abbildung 4A). Darüber hinaus die mRNA-Expression von ATG7, ATG12.LC3. und ULK1 wurden nach der Cur-Behandlung hochreguliert (Abbildung 4B). Die Ultrastruktur von cBMSCs wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Wir beobachteten dann eine Zunahme der Bildung von Autophagosomen und Autolysosomen in cBMSCs nach Behandlung mit Cur in Dosen von 0,1, 1 und 10 μM für 24 h (Abbildung 4C).cistanche nzDie Immunfluoreszenzfärbung zeigte auch, dass die Anzahl der charakteristischen punktförmigen fluoreszierenden Punkte von LC3 durch die Cur-Behandlung signifikant erhöht wurde (Abbildung 4E). Diese Ergebnisse zeigten, dass Cur dosisabhängig die lysosomale Ansäuerung und Autophagie-Aktivierung fördern kann.

Dieser Artikel ist aus Int. J.Mol. Wissenschaft. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms