Über die Atemwege zugeführtes kurzkettiges Fettsäureacetat stärkt die antivirale Immunität während einer Rhinovirus-Infektion

Hintergrund: 

Es ist bekannt, dass Mikrobiota eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunität spielt, indem sie immunmodulatorische Metaboliten wie kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) freisetzt. Rhinoviren (RVs) induzieren Erkrankungen der oberen Atemwege und lösen durch kaum verstandene Mechanismen eine Verschlimmerung von Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung aus. Lokale Wechselwirkungen zwischen SCFAs und antiviralen Immunantworten im Atemtrakt wurden bisher nicht untersucht.

Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) sind organische Säuren, die durch die Fermentation von Zellulose und anderen Ballaststoffen durch nützliche Bakterien im Darm entstehen. Studien haben gezeigt, dass SCFAs einen wichtigen Einfluss auf das menschliche Immunsystem haben.

Erstens können SCFAs die Integrität der Darmschleimhautbarriere fördern und die Funktion der Darmbarriere verbessern. Die Darmbarriere ist die erste Verteidigungslinie zum Schutz der Darmumgebung. Wenn die Darmbarriere geschädigt ist, können Schadstoffe über die Darmwand in den Blutkreislauf gelangen und dort Entzündungen und eine Störung des Immunsystems verursachen. Studien haben ergeben, dass SCFAs die Integrität der Darmbarriere verbessern und das Risiko einer Darmentzündung verringern können, indem sie die Differenzierung und Proliferation von Schleimhautzellen fördern und so die Dicke der Schleimhaut und die Schleimproduktion erhöhen.

Zweitens haben SCFAs die Funktion, Immunzellen zu regulieren. Studien haben gezeigt, dass SCFAs die Differenzierung und Proliferation von Immunzellen fördern und die Funktion von Immunzellen regulieren können. SCFAs können auch die Produktion entzündungsfördernder Zytokine reduzieren und die Aktivität von Immunzellen hemmen, wodurch das menschliche Immunsystem geschützt wird. Andere Studien haben auch herausgefunden, dass SCFAs die Funktion von T-Zellen regulieren, die Autoimmunfunktion steigern und eine gewisse Rolle bei der Prävention und Behandlung von Autoimmunerkrankungen spielen können.

Kurz gesagt spielen kurzkettige Fettsäuren eine wichtige Rolle für die normale Funktion des menschlichen Immunsystems. Wir sollten auf eine sinnvolle Kombination aus einer ballaststoffreichen Ernährungsstruktur achten, um die Anzahl und Vielfalt nützlicher Bakterien im Darm zu erhöhen und so die Produktion von SCFAs zu fördern und die Stabilität und Gesundheit des menschlichen Immunsystems aufrechtzuerhalten. Unter diesem Gesichtspunkt müssen wir unsere Immunität verbessern. Cistanche kann die Immunität erheblich verbessern, da Cistanche reich an einer Vielzahl antioxidativer Substanzen ist, wie zum Beispiel Vitamin C, Vitamin C, Carotinoiden usw. Diese Inhaltsstoffe können freie Radikale abfangen und oxidativen Stress reduzieren. Stimulieren und verbessern Sie die Widerstandskraft des Immunsystems.

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Zielsetzung:

Wir wollten untersuchen, ob die Manipulation von Lungenmetaboliten durch die Verabreichung von SCFAs über die Lunge die antivirale Immunität gegen RV-Infektionen modulieren kann.

Methoden:

Wir untersuchten die Auswirkungen der intranasalen Verabreichung der SCFAs Acetat, Butyrat und Propionat auf die basale Expression antiviraler Signaturen und von Acetat in einem Mausmodell einer RV-Infektion und in RV-infizierten Lungenepithelzelllinien. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkungen von Acetat, Butyrat und Propionat auf RV-Infektionen in differenzierten menschlichen primären Bronchialepithelzellen.

Ergebnisse:

Die intranasale Verabreichung von Acetat induzierte eine basale Hochregulierung von IFN-b, ein Effekt, der bei anderen SCFAs nicht beobachtet wurde. Butyrat-induzierte RIG-I-Expression. Die intranasale Acetatbehandlung von Mäusen erhöhte die Interferon-stimulierte Gen- und IFN-1-Expression während einer RV-Infektion und verringerte die Lungenviruslast 8 Stunden nach der Infektion. Acetat linderte virusinduzierte proinflammatorische Reaktionen mit abgeschwächter pulmonaler Mucin- und IL-6-Expression, die an den Tagen 4 und 6 nach der Infektion beobachtet wurde. Diese Interferon-verstärkende Wirkung von Acetat wurde in menschlichen Bronchial- und Alveolarepithelzelllinien bestätigt. In differenzierten primären Bronchialepithelzellen modulierte die Butyratbehandlung die IFN-b- und IFN-l-Genexpression während einer RV-Infektion besser.

Schlussfolgerungen:

SCFAs stärken die antivirale Immunität und reduzieren die Viruslast und proinflammatorische Reaktionen während einer RV-Infektion. (J Allergy Clin Immunol 2023;151:447-57.)

Auf Schleimhautoberflächen ansässige Bakteriengemeinschaften (Mikrobiota) spielen eine zentrale Rolle bei der Immunhomöostase und bestimmen die Reaktion auf entzündliche und infektiöse Erkrankungen wie Asthma, Kolitis sowie bakterielle und virale Infektionen.1-5 Bakterielle Metaboliten wie kurzkettige Fettsäuren (SCFAs), hauptsächlich Acetat, Butyrat und Propionat, sind mittlerweile eine bekannte Verbindung zwischen der Darmmikrobiota und den Wirtszellen.6,7 Diese Moleküle werden durch den Stoffwechsel von Ballaststoffen durch Bestandteile der Darmmikrobiota erzeugt. SCFAs haben sowohl lokale als auch systemische Wirkungen. Sie modulieren die Aktivierung und Funktion von Immunzellen durch Mechanismen wie die Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (z. B. Gpr41, Gpr43 oder Gpr109a) und die Hemmung von Histondeacetylasen, und es wurde gezeigt, dass sie die Homöostase der Schleimhaut und die orale Toleranz fördern. In jüngerer Zeit wurde die Existenz von Mikrobiota in den unteren Atemwegen beschrieben, und neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass respiratorische Kommensalen auch metabolisch aktive Organismen sind, die in der Lage sind, Metaboliten mit immunmodulatorischer Kapazität wie SCFAs zu produzieren.8 Somit werden SCFAs entweder lokal von Lungenmikrobiota freigesetzt oder Aus der Darmmikrobiota gewonnenes Material könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunität spielen. Die antivirale Wirkung von SCFAs gegen Rhinoviren (RVs) ist jedoch unbekannt.

Wohnmobile sind weltweit für eine enorme Belastung durch Infektionskrankheiten verantwortlich, da sie bei gesunden Personen leichte, selbstlimitierende Erkältungen auslösen und bei Personen mit chronischen Lungenerkrankungen wie Asthma oder chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) Exazerbationen auslösen. Diese Krankheiten verursachen weltweit erhebliche wirtschaftliche Kosten für die Gesundheitsinfrastruktur. Derzeit gibt es keine wirksamen Therapien oder zugelassenen Impfstoffe für RVs, da die große Vielfalt an Serotypen/Stämmen die Forschung vor erhebliche Herausforderungen gestellt hat.9 Daher ist die Entwicklung neuer präventiver und therapeutischer Ansätze für RV-Infektionen dringend erforderlich. Das Darmmikrobiom kann therapeutisch manipuliert werden, um klinische Vorteile bei Darminfektionskrankheiten (z. B. Clostridium difficile) zu bieten. Das Potenzial der Verabreichung von respiratorischen Kommensalen oder assoziierten Metaboliten, die antimikrobielle Immunität der Lunge in ähnlicher Weise zu stärken, bleibt unerforscht.10

Wir haben zuvor gezeigt, dass die Verabreichung einer ballaststoffreichen Diät oder von SCFAs Acetat, Butyrat und Propionat Mäuse vor einer Infektion mit dem Respiratory Syncytial Virus (RSV) schützte.5 Die orale Verabreichung von Acetat induzierte die Produktion von IFN-b und erhöhte Expression von Interferon-stimulierten Genen ( ISGs) in der Lunge während einer RSV-Infektion. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass Acetat, das direkt in die Atemwege verabreicht wird, vor einer RSV-Infektion schützt, indem es die Expression von ISGs in der Lunge erhöht.11 Wir gingen daher davon aus, dass die direkte Verabreichung von Acetat in die Atemwege, um die lokalen mikrobiellen Metabolitenkonzentrationen zu erhöhen, einen ähnlichen Schutz haben würde Auswirkungen auf RV-Infektionen. Hier zeigen wir, dass die In-vivo-Verabreichung von Acetat bei Mäusen die antiviralen Typ-I- und Typ-III-Interferone (IFNs) erhöht, die RV-Replikation reduziert und die virusinduzierte Immunpathologie abschwächt. Bei der Betrachtung der antiviralen In-vitro-Reaktion bestimmter Zelltypen auf ein breiteres Spektrum von SCFAs stellen wir fest, dass diese Verbindungen die IFN-Reaktionen der Alveolarmakrophagen nicht beeinflussen und unterschiedliche Wirkungen auf das Epithel haben, wobei bei Butyrat im Vergleich zu Butyrat eine stärkere antivirale Verstärkungswirkung beobachtet wird mit anderen SCFAs, was darauf hindeutet, dass In-vivo-Effekte auf komplexere Zell-Zell-Interaktionen zurückzuführen sein könnten. Diese Daten legen nahe, dass die Manipulation des pulmonalen mikrobiellen Metabolitenmilieus einen neuen Ansatz zur Prävention oder Behandlung respiratorischer Virusinfektionen darstellen könnte.

METHODEN

Ethik-Erklärung

Alle Tierversuche wurden gemäß dem Animals Act 1986 und den Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE)-Richtlinien durchgeführt und folgten dem von den Richtlinien des britischen Innenministeriums genehmigten Protokoll (britische Projektlizenz PPL-Nr. P07D80C24).

RV-Vermehrung und Quantifizierung

Für die Studien an Maus- und menschlichen Zelllinien wurde die Nebengruppe RV-Serotyp A1 (RV-A1) in Ohio-HeLa-Zellen (European Collection of Cell Cultures) gezüchtet. Infizierte Zellen wurden nach 24 Stunden geerntet, das Virus konzentriert und gereinigt und ein TCID50-Assay (50 Prozent Gewebekultur-Infektionsdosis) wurde durchgeführt, um den Virustiter wie zuvor beschrieben zu bestimmen.12 Für die Studien an humanen primären Bronchialepithelzellen (BEC). RV-A1 wurde in RD-ICAM-1-Zellen aus einem internen Stamm vermehrt, der aus klinischen Proben isoliert und zur Bestätigung der Identität sequenziert wurde. RV-A1 wurde durch Infektion von RD-ICAM-1-Zellen mit seriell verdünntem RV-A1 titriert, gefolgt von der Beobachtung zytopathischer Wirkungen und einem TCID50-Assay zur Bestimmung des Virustiters.

Mausstudie

Sechs Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden von Harlan Laboratories (Derby, UK) gekauft und am Imperial College London (UK) unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Mäuse wurden intranasal mit 50 ml Natriumacetat, -butyrat oder -propionat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) unter leichter Isofluoran-Anästhesie vorbehandelt. In einigen Experimenten wurden Mäuse anschließend 24 Stunden später intranasal mit 50 ml RV (5 3 106 TCID50) infiziert. Die Dosis der Acetatbehandlung betrug gemäß unserer vorherigen Studie mit dem gleichen Ansatz 20 mM.11 Die Acetatbehandlung wurde alle 24 Stunden nach der Infektion intranasal verabreicht.

Quantitative Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA aus der Lunge (100 mg Lungengewebe) und Zelllysat wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. cDNA wurde unter Verwendung zufälliger Hexamer-Primer (OmniscriptRT-Kit, Qiagen) synthetisiert. Erststrang-cDNA wurde zur Quantifizierung von IFN-b-, IFN-l-, Viperin-, MuC5AC- (Maus und Mensch), OAS1-, RIG-I- (Ddx58), MAVS-, MDA-5- (Maus) und RV-Kopien verwendet TaqMan-Assays mit Primern und Sonden, wie bereits berichtet.13 Zur absoluten Quantifizierung wurde jedes Gen auf das Niveau der 18s-rRNA normalisiert und die genauen Kopien des interessierenden Gens wurden anhand einer Standardkurve berechnet, die durch die Amplifikation von Plasmid-DNA erstellt wurde. Alternativ wurde 2-DDCt (Fold-Change) zur Berechnung der Genexpression verwendet. Die PCR-Bedingungen folgten den TaqMan Universal PCR Master Mix-Protokollen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). Der Genexpressionstest wurde mit StepOne (Applied Biosystems, Waltham, Mass) durchgeführt.

Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit

Mäuse wurden durch intraperitoneale Überdosis-Verabreichung von Pentobarbitonlösung eingeschläfert und die Luftröhren wurden mit einer Kanüle versehen. Die Lungen wurden dreimal mit sterilem PBS gewaschen. Die Flüssigkeit aus der bronchoalveolären Lavage (BAL) wurde zentrifugiert, der Überstand für die Messung der doppelsträngigen DNA gesammelt und die Pellets für die Gesamtzell- und Differenzialzählung suspendiert. Für die differenzielle Zellzählung wurden die Cytospin-Objektträger mit MayGrunwald-Giemsa gefärbt und der Zählvorgang wurde von einem erfahrenen Forscher blind durchgeführt.

Messung doppelsträngiger DNA

Doppelsträngige DNA wurde in der BAL-Flüssigkeit unter Verwendung des doppelsträngigen DNA-Reagenz Quant-iT PicoGreen (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.

Histologische Analyse

Nach der BAL wurden die Lungen über das Herz mit PBS perfundiert und mit 4 Prozent Paraformaldehyd aufgeblasen, und dann wurde die linke Lunge 24 Stunden lang in 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Stücke in Paraffinblöcke eingebettet und in 5- mm große Abschnitte geschnitten, die mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt wurden. Das entzündliche Infiltrat wurde in Mikrometern gemessen und es wurden 10 Messungen durchgeführt, beginnend vom Ende des Bronchial- oder Gefäßepithels bis zum Ende des entzündlichen Infiltrats, unter Verwendung der Olympus CellSens Standard-Software (Olympus Corporation, Tokio, Japan). Alle Zählungen wurden blind gegenüber den Versuchsbedingungen durchgeführt.

Durchflusszytometrie

Zellen wurden durch Perfusion mit PBS aus der Lunge isoliert und dann in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 1 mg/ml Kollagenase IV (Invitrogen-Gibco, Waltham, Massachusetts), verdaut. Aus der Lunge und BAL isolierte Zellen wurden mit Mouse Fc Block (#553141 BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 20 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit Oberflächenantikörpern Anti-CD45 (1:200, #557235, Klon 30-F11, BD Biosciences) gefärbt. Zur intrazellulären Färbung wurden die Zellen mit Zytofix/Zytoplasma (BD Biosciences) und mit Anti-RIG-I (1:50, Nr. 35H2L48, ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts) fixiert und nach der Inkubation wurden die Zellen mit sekundärem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper markiert H&L Cy3-konjugiert (1:1000, # ab97075, Abcam, Cambridge, Mass). Die Proben wurden im Durchflusszytometer BD FACS Canto-II (BD Biosciences) aufgenommen. Die Daten wurden in der FlowJo-Software (Version 10, Tree Star, Inc, Ashland, VA) analysiert.

In-vitro-Studien an Epithelzelllinien

Menschliche BECs (BEAS-2B) und menschliche Lungenepithelzellen (A549) wurden von ATCC (Manassas, Virginia) gekauft und wie zuvor beschrieben kultiviert.13 Zellen wurden einzeln in einer Konzentration von 1 ausgesät.5 3 105 Zellen/ml in 12-Well-Platten. 24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen weitere 24 Stunden lang mit 400 mM Natriumacetat (Sigma-Aldrich) behandelt. Anschließend wurden die Zellen eine Stunde lang mit RV-A1 (Multiplicity of Infection [MOI] 2) infiziert. Anschließend wurde das Virus entfernt, die Zellen gewaschen und neues Medium, ergänzt mit 5 Prozent FBS, hinzugefügt. Eine weitere Acetatbehandlung (400 mM) wurde unmittelbar nach der Infektion und alle 24 Stunden bis zur Zellernte hinzugefügt.

Sammlung primärer BECs und Ethikgenehmigungen

BECs eines gesunden Nichtrauchers wurden mit schriftlicher Einverständniserklärung aus Bronchialbürsten während der Bronchoskopie gesammelt. Alle Experimente wurden mit Genehmigung des Hunter New England Area Health Service Ethics Committee (05/08/10/3.09) und des University of Newcastle Safety Committee (H-163-1205) durchgeführt.

Bedingte Neuprogrammierung von BECs und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen

BECs wurden mit Rho-assoziiertem Proteinkinase-Inhibitor (Endkonzentration 10mM) und in Kombination mit bestrahlten NIH-3T3-Fibroblasten in Monoschichtkulturen wie zuvor beschrieben bedingt umprogrammiert.14,15 Bedingt umprogrammierte Medien bestanden aus ein 1:2-Verhältnis von Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (1 L-Glutamin mit hohem Glukosegehalt)/Ham's F12, ergänzt mit 5 Prozent FCS, Hydrocortison (400 ng/ml), Insulin (5 mg/ml), rekombinantem menschlichem Epithelwachstumsfaktor (10 ng). /ml), Choleratoxin (8,4 ng/ml), Adenin (23,9 mg/ml) und 0,2 Prozent Penicillin-Streptomycin.16 Erweiterte, bedingt umprogrammierte BECs wurden vom Rho-assoziierten Proteinkinase-Inhibitor entwöhnt und auf {{24} }Well-Polyester-Transwell-Membranen und differenzierte 25 Tage lang an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) wie zuvor beschrieben.17 Experimente wurden mit n 5 4 biotechnischen Replikaten durchgeführt. An 5- mm dicken ALI-Schnitten wurde eine standardmäßige Alcianblau-, pH-2,5- und Perjodsäure-Schiff-Färbung durchgeführt, um pseudostratifiziertes Epithel sichtbar zu machen (siehe Abb. E1 im Online-Repository dieses Artikels unter www.jacionline.org).

SCFA-Behandlung in BEC-Kultur

Vor der Infektion wurden ALI-Kulturen grundsätzlich mit 100, 400 oder 1600 mM Acetat, Butyrat, behandelt oder Propionat für 24 Stunden in 600 ml ALI-Endmedium, bestehend aus Bronchialepithel-Basismedium und Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (Verhältnis 50:50), das Hydrocortison (0,1 Prozent) enthält. , Rinderinsulin (0,1 Prozent), Adrenalin (0,1 Prozent), Transferrin (0,1 Prozent), Rinderhypophysenextrakt (0,4 Prozent) und Ethanolamin (80 mM), MgCl2 (0,3 mM), MgSO4 (0,4 mM), BSA (0,5 mg). /ml), Amphotericin B (250 mg/ml), all-trans-Retinsäure (30 ng/ml), Penicillin/Streptomycin (2 Prozent) und rekombinanter menschlicher Epithelwachstumsfaktor (0,5 ng/ml). Am Tag der Infektion wurden die Basalmedien durch neue ALI-Endmedien und eine SCFA-Behandlung ersetzt, die bis zur Endpunktanalyse belassen wurde.

RV-Infektion und Probenahme

ALI-BEC-Kulturen wurden apikal mit RV-A1 infiziert. Zunächst wurde die RV-A1-Stammlösung verdünnt, um eine MOI von 0,1 zu erhalten, und 2 Stunden lang in 50 ml Bronchialepithel-Basismedium mit Zusätzen, 1 Prozent Insulin, auf die apikale Oberfläche der Kulturen gegeben. Transferrin-Selen und 0,5 Prozent Linolsäure. Anschließend wurde das Infektionsmedium für den Rest des Experiments durch 500 ml frisches Bronchialepithel-Basismedium (mit Zusätzen) ersetzt. Apikale Waschproben (100 ml PBS) und Basalmedienproben wurden 8- und 48- Stunden nach der Infektion gesammelt und bei 280 °C gelagert. Die Zellen wurden in 350 ml RLT-Puffer (Qiagen), der 1 Prozent 2-Mercaptoethanol enthielt, bei 280 °C für Genexpressionsanalysen mittels RT-quantitativer PCR gelagert (Abb. E2, C).

Im Einklang mit den verstärkten antiviralen Immunwirkungen verringerte Acetat 48 Stunden nach der Infektion tendenziell die Anzahl der viralen RNA-Kopien (Abb. E2, D) und reduzierte die Lebendviruslast (Abb. E2, E). In BEAS2B-Zellen, einer BEC-Linie, beobachteten wir, dass die Acetatbehandlung die Expression von IFNB1-mRNA 8 Stunden nach der Infektion und von IFNL2-mRNA 4 und 8 Stunden nach der Infektion erhöhte (Abb. E2, F). Es gab keine signifikante Auswirkung auf die Viperin-Expression (Abb. E2, F). Im Gegensatz zu den in A459-Zellen beobachteten Auswirkungen auf die Viruslast gab es in BEAS2B-Zellen keinen Einfluss von Acetat auf die virale RNA oder die TCID50-Quantifizierung (Abb. E2, G und H).

Wirkung der SCFA-Behandlung auf antivirale Reaktionen in ALI-BEC-infizierten Kulturen

Nachdem wir eine verstärkende Wirkung von Acetat in Lungenepithelzelllinien beobachtet hatten, versuchten wir als nächstes, die Auswirkungen in einem Modell primärer Epithelzellen zu bewerten, die bei ALI differenziert wurden (ein experimentelles System, das In-vivo-Zellen genauer nachbildet). Zelldifferenzierung und Morphologie wurden durch die Bildung von Becherzellen (periodische Säure-Schiff-Färbung) bestätigt (Abb. E1).

Acetat erhöhte IFNB1 und IFNl2/3 (IL28) auf RV-infizierten BECs im Vergleich zu nicht infizierten Zellen signifikant (Abb. 3, B und D), es gab jedoch keinen Unterschied im Vergleich zu unbehandelten RV-infizierten Zellen. Acetat neigte dazu, die virale RNA entweder 8 Stunden oder 48 Stunden nach der Infektion mit RV-A1 zu reduzieren (Abb. 3, A und B). Angesichts der Tatsache, dass Acetat weniger deutliche verstärkende Wirkungen auf die RV-Induktion von Typ-I-IFN-Reaktionen in primär differenzierten Epithelzellen hatte, erweiterten wir unsere Untersuchungen, um festzustellen, ob Butyrat oder Propionat erkennbare Wirkungen hatten. Butyrat und Propionat erhöhten im Vergleich zu den nicht infizierten Zellen auch die mRNA-Expression der Genexpression IFNb, IFN12/3 (IL28) und IFN11 (IL29) (Abb. 3, F, G, H und L). Die Butyratbehandlung erhöhte die Expression von IFNB1, IL28 und IL29 48 Stunden nach der Infektion mit RV im Vergleich zu unbehandelten RV-infizierten Zellen, obwohl dieser Effekt nicht ausreichte, um einen Einfluss auf die Viruslast zu haben (Abb. 3, I, J, K, und ich). Wir fanden bei keiner SCFA-Behandlungsdosis eine unterdrückende Wirkung auf die RV-induzierte MUC5AC-Expression (siehe Abb. E3, AC, im Online-Repository dieses Artikels unter www.jacionline.org). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass SCFAs im Gegensatz zu Daten bei Mäusen und menschlichen Zelllinien eine begrenztere Wirkung auf die antivirale Immunität in differenzierten primären Epithelzellen haben.

Keine Wirkung von SCFAs auf Typ-I-IFN-Antworten in Alveolarmakrophagen

Um zu untersuchen, ob die antivirale Wirkung von Acetat und/oder anderen SCFAs auf die Modulation von Alveolarmakrophagen (einer wichtigen Frühreaktionszelle bei Virusinfektionen und Hauptquelle für Typ-I-IFN) zurückzuführen ist, haben wir die Wirkung der SCFA-Verabreichung ex vivo untersucht antivirale Reaktionen in mit RVA1 stimulierten Makrophagen. Wir fanden heraus, dass die Verabreichung von SCFA keinen signifikanten Einfluss auf die Induktion von Ifnb1, Viperin oder OAS1 durch RV hatte, was darauf hinweist, dass die immunstärkenden Wirkungen von SCFAs nicht durch Wirkungen auf Alveolarmakrophagen auftreten (siehe Abb. E4, AC, im Online-Artikel zu diesem Artikel). Repository unter www.jacionline.org).

Über die Atemwege verabreichtes SCFA verstärkte IFN-b und virusempfindliche Rezeptoren vor einer RV-Infektion

Um zusätzliche mechanistische Einblicke in die antiviralen Signalwege zu gewinnen, die an der Verstärkung von Typ-I-IFN durch SCFAs beteiligt sind, untersuchten wir als nächstes die Auswirkungen dieser Verbindungen auf Gene, die antivirale Signalwege erkennen. Wir verabreichten die 3 SCFAs (Acetat, Butyrat und Propionat) erneut intranasal in Konzentrationen von 20 mM über 24 Stunden (Abb. 4, A). Wir fanden keinen Einfluss der SCFAs auf die Expression des zytosolischen viralen RNA-Sensors MDA5 oder seines Adaptermoleküls MAVS (Abb. 4, B und C). Umgekehrt steigerte die Verabreichung von Butyrat (aber nicht von anderen SCFAs) die RIGI-mRNA-Expression (Abb. 4, D). Es wurde festgestellt, dass die verstärkende Wirkung von Butyrat auf die RIG-I-Expression spezifisch in Lungenepithel-/Stromazellen (CD452) auftritt, während in hämatopoetischen Immunzellen (CD451) keine Wirkung beobachtet wurde (Abb. 4, EI). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass verschiedene SCFAs möglicherweise über spezifische antivirale Wahrnehmungswege wirken, um die angeborene Immunität zu regulieren.

DISKUSSION

Diese Studie liefert neue Erkenntnisse über den potenziellen Nutzen der Verabreichung mikrobieller Metaboliten direkt in die Atemwege zur Stärkung der angeborenen Immunität der Lunge. Ballaststoffe und SCFAs aus der Darmflora werden seit langem mit positiven Auswirkungen auf die Lungengesundheit in Verbindung gebracht. Eine randomisierte, placebokontrollierte Studie zeigte, dass die Verwendung von Präbiotika (Ballaststoffen) bei Frühgeborenen RV-Infektionen im ersten Lebensjahr verhinderte.20 Ballaststoffe sind unverdauliche Polysaccharide, die durch mikrobielle Fermentation zu SCFAs abgebaut werden können. Studien haben auch gezeigt, dass SCFAs die gesunde Darmmikrobiota modulieren können.21 Unsere Studie zeigt, dass die Verabreichung von SCFAs über die Atemwege auch direkte lokale positive Auswirkungen auf die Reaktionen des Wirts haben kann. Wir haben einen anderen Mechanismus als die ernährungsbedingten Auswirkungen auf die Mikrobiota identifiziert, der eine direkte pulmonale Stimulation der angeborenen antiviralen Immunität durch SCFAs beinhaltet.

Unsere Daten zeigen, dass die Verabreichung von SCFA-Acetat die Basalexpression antiviraler Immunmediatoren im Steady State erhöht. Dies passt konzeptionell zu einer Rolle von Acetat bei der Vorbereitung der Lunge auf eine robustere frühe Freisetzung von IFNs. Dies wurde durch unsere Erkenntnisse gestützt, dass die Verabreichung von Acetat auch die Induktion von IFNs und ISGs als Reaktion auf eine RV-Infektion bei Mäusen verstärkte. Dies war mit einer verringerten Viruslast und einer späteren Unterdrückung proinflammatorischer Reaktionen und Schleimproduktion verbunden. Diese Effekte würden alle im Zusammenhang mit einer akuten Virusinfektion als vorteilhaft angesehen werden. Unsere Daten stimmen mit einer Reihe von Fachliteratur überein, aus der hervorgeht, dass Acetat weitreichende gesundheitliche Vorteile mit sich bringt, wie z. B. die Verbesserung der Herzfunktion, die Bildung roter Blutkörperchen und die Bildung des Immungedächtnisses.22 Darüber hinaus wird Acetat mit der Modulation verschiedener Faktoren in Verbindung gebracht Funktionen der Immunantwort23-25 und Kontrolle von Atemwegserkrankungen.

Wir haben auch die Wirkung der Acetatverabreichung auf die RV-Infektion des Epithels untersucht, da es sich um den primären Ort der anfänglichen Virusreplikation handelt. Wir fanden eine ähnliche antivirale Wirkung von Acetat in menschlichen Lungenzelllinien, wobei in A549-Zellen stärkere Effekte beobachtet wurden als in BEAS-2B-Zellen (von denen bekannt ist, dass sie höhere Grundwerte an IFN und ISGs exprimieren).27 ,28 Dies könnte teilweise erklären, warum die Acetatbehandlung bei BEAS-2B-Zellen geringere Auswirkungen hatte. Im Gegensatz dazu beobachteten wir, dass es bei humanen primär differenzierten BECs (ALI-BECs) keinen eindeutigen Effekt von Acetat auf Typ-I-IFN-Reaktionen auf RV gab. Darüber hinaus untersuchten wir auch die Fähigkeit von Acetat und anderen SCFAs, Typ-I-IFN-Reaktionen in ex vivo kultivierten Alveolarmakrophagen zu modulieren, und fanden ebenfalls keine Wirkung. Diese Diskrepanz zwischen In-vivo- und In-vitro-Befunden könnte darauf hindeuten, dass mehrere Zelltypen und Zell-Zell-Kommunikationen für den in vivo beobachteten klaren Phänotyp verantwortlich sein könnten, wobei ein weniger starker Effekt beobachtet wird, wenn isolierte Zellen mit SCFAs behandelt werden.

Obwohl das Hauptaugenmerk unserer Studie auf der Bewertung der Auswirkungen von SCFA auf die angeborene antivirale Immunität lag, ist es denkbar, dass nachgelagerte Auswirkungen auf adaptive Immunantworten auftreten könnten, und zukünftige Studien könnten sich auf mögliche Auswirkungen auf T- und B-Lymphozytenpopulationen und -produktion konzentrieren neutralisierender Antikörper.

Es sollte auch beachtet werden, dass das von uns verwendete Mausmodell ein Modell ist, bei dem die Virusreplikation relativ begrenzt (;24-36 Stunden) erfolgt, obwohl alle gemessenen Endpunkte replikationsabhängig sind.12,29 Weitere Studien unter Verwendung mausadaptierter Virusstämme dort, wo eine nachhaltigere Virusreplikation stattfindet, können tiefgreifendere und nachhaltigere Auswirkungen auftreten. Darüber hinaus wurden unsere Experimente ausschließlich an weiblichen Mäusen durchgeführt und weitere Studien sollten bestätigen, ob ähnliche Effekte bei männlichen Mäusen auftreten.

Obwohl Acetat nur begrenzte Auswirkungen auf ALI-BECs hatte, beobachteten wir, dass die Verabreichung von Butyrat die RV-Induktion von Typ-I-IFN-Reaktionen verstärken könnte. Diese Daten stehen im Gegensatz zu der Studie von Chemudupati et al.,30 die eine unterdrückende Wirkung von Butyrat auf Typ-I-IFN-Reaktionen zeigte. Diese Studie verwendete jedoch viel höhere Konzentrationen an Butyrat und konzentrierte sich auch auf verschiedene Atemwegsviren.

Die Schleimproduktion in der Lunge ist ein Merkmal einer RV-Infektion, die zu einem erhöhten klinischen Schweregrad und einer Verschlimmerung von Asthma und COPD führt,31,32 insbesondere durch MUC5AC-Verstärkung der Atemwegsentzündung.33 Wir haben gezeigt, dass die Acetatbehandlung die Muc5AC-Expression in der Lunge an den Tagen 4 und 2020 verringerte 6 nach der Infektion. Dementsprechend wurde gezeigt, dass SCFAs die Schleimproduktion in der Lunge während einer Grippeinfektion34 und einer allergischen Atemwegsentzündung abschwächen.34,35 Allerdings modulierte Acetat in ALI-BEC-Zellen die Muc5AC-Genexpression nicht, obwohl zu beachten ist, dass dies zu späteren Zeitpunkten der Fall war nicht untersucht. Unsere Beobachtung einer verringerten Mucin-Expression bei Mäusen, die mit Acetat behandelt und mit dem Virus infiziert wurden, steht im Einklang mit unseren früheren Erkenntnissen, dass Typ-I-IFN die wichtigste Mucin-Muc5ac-Expression in den Atemwegen während einer Virusinfektion negativ reguliert.14 Die molekularen Mechanismen, durch die dies geschieht, sind unklar , obwohl frühere Erkenntnisse zeigen, dass eine IL-13-vermittelte Typ-2-Entzündung bei der Induktion von MUC5AC wichtig sein könnte.36,37 Weitere Studien sollten darauf abzielen, umfassender zu verstehen, wie Acetat die Schleimproduktion in den Atemwegen beeinflussen kann.

Um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die SCFAs IFN induzieren, haben wir zusätzlich die Expression antiviraler Pathway-Sensing-Gene gemessen. Wir beobachteten, dass Butyrat und in geringerem Maße Acetat die RIG-I-Expression in Lungenepithelzellen von naiven Mäusen induzieren können. Unsere Daten deuten darauf hin, dass diese SCFAs die Viruserkennungsreaktion verstärken und die Lunge auf eine verstärkte angeborene Reaktion auf eine Virusinfektion vorbereiten.

In Atemwegsepithelzellen wurde sowohl bei Asthma als auch bei COPD eine beeinträchtigte Ex-vivo-Typ-I-IFN-Produktion bei RV-Infektionen nachgewiesen.38,39 Es wird postuliert, dass dieser Defekt die Anfälligkeit für virusinduzierte Exazerbationen bei diesen Personen erhöht. Die Mechanismen, die diese Defekte auslösen, sind unbekannt. Weitere Arbeiten an Tiermodellen oder erkrankten Zellkultursystemen sind erforderlich, um festzustellen, ob die bei Asthma und COPD beobachtete mikrobielle Dysbiose zu einem relativen Mangel an Acetat oder anderen SCFAs führt, der durch Verabreichung zur Wiederherstellung der beeinträchtigten antiviralen Immunität korrigiert werden könnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung von SCFAs zur Behandlung von RV-Infektionen mit einer Steigerung der IFN-Produktion vom Typ I und Typ III verbunden ist, zentralen Komponenten der pulmonalen antiviralen Immunantwort. Diese Studie unterstreicht, dass die Verabreichung von mikrobiellen Metaboliten wie SCFAs über die Atemwege positive Auswirkungen auf die antivirale Immunität haben und möglicherweise die Schwere respiratorischer Viruserkrankungen lindern könnte.

VERWEISE

1. Trompette A, Gollwitzer ES, Yadava K, Sichelstiel AK, Sprenger N, Ngom-Bru C, et al. Der Stoffwechsel von Ballaststoffen in der Darmmikrobiota beeinflusst allergische Atemwegserkrankungen und Hämatopoese. Nat Med 2014;20:159-66.

2. Thorburn AN, McKenzie CI, Shen S, Stanley D, Macia L, Mason LJ, et al. Hinweise darauf, dass Asthma eine entwicklungsbedingte Krankheit ist, die durch die Ernährung der Mutter und bakterielle Metaboliten beeinflusst wird. Nat Commun 2015;6:7320.

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