Alkoholspezifische Transkriptionsdynamik der Gedächtnisrekonsolidierung und des Rückfalls Teil 4

Zusätzlich zu Arc fanden wir heraus, dass die mRNA-Spiegel von Egr1, nicht jedoch von Bdnf, in DH und mPFC durch Alkohol-Gedächtnisabruf erhöht waren.

Mit der Zeit gewinnen die Menschen nach und nach ein neues Verständnis für das Geheimnis des Vergessens. In diesem Prozess hat sich die neue Speicherabruftechnologie nach und nach zu einem Forschungs-Hotspot entwickelt.

Gibt es also einen Zusammenhang zwischen dem Abrufen des Alkoholgedächtnisses und der Gedächtnisleistung? Schauen Sie jetzt vorbei! Zunächst müssen wir uns darüber im Klaren sein: Das Abrufen von Alkoholgedächtnissen ist keine eigenständige Technologie. Es handelt sich um eine Technologie, die durch Alkohol Auswirkungen auf Gehirnneuronen hat. Dieser Prozess kann einige „schlafende“ Erinnerungen im Gehirn aktivieren und es uns ermöglichen, diese Erinnerungen aufzufrischen.

Zweitens müssen wir wissen, dass die Verbesserung des Gedächtnisses uns nicht einfach nur ermöglicht, uns an mehr Dinge zu „erinnern“, sondern ein Prozess des Abrufens und Rekonstruierens von Erinnerungen auf unterschiedliche Weise ist. Dieser Prozess kann uns helfen, das erlernte Wissen besser zu festigen und zu verstehen und so unser Gedächtnis zu verbessern.

Daher können wir den Schluss ziehen, dass es einen Zusammenhang zwischen dem Abrufen des Alkoholgedächtnisses und der Gedächtnisleistung gibt. Wenn wir diese Technologie verwenden, um frühere Erinnerungen nach dem Trinken von Alkohol wieder zu extrahieren, durchlaufen wir einen Prozess der Rekonsolidierung dieser Erinnerungen und verbessern dadurch unser Gedächtnis bis zu einem gewissen Grad.

Natürlich müssen wir auch beachten, dass das Abrufen des Alkoholgedächtnisses keine dauerhafte und zuverlässige Technik zur Verbesserung des Gedächtnisses ist. Wenn wir über einen langen Zeitraum ein ausgezeichnetes Gedächtnis haben wollen, müssen wir unser Gedächtnis durch tägliches Lernen und Leben, kombiniert mit anderen Gedächtnistrainingstechniken, kontinuierlich festigen und verbessern.

Dabei müssen wir jederzeit eine optimistische Einstellung bewahren, um unsere Lernmotivation und unser Gedächtnispotenzial besser zu stimulieren. Lassen Sie uns deshalb das Gedächtnistraining aktiv angehen, unablässig wir selbst sein und mutig auf dem Weg zur kontinuierlichen Verbesserung des Gedächtnisses voranschreiten! Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholin- und Wachstumsfaktorspiegels. Diese Stoffe sind sehr wichtig für das Gedächtnis und das Lernen. Darüber hinaus kann Fleisch auch die Durchblutung verbessern und die Sauerstoffversorgung fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält, wodurch die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert werden.

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Eine erhöhte Egr1-mRNA-Expression wurde zuvor mit der Wiederherstellung von Angst- und Drogenerinnerungen in Verbindung gebracht[19, 21, 48, 61], was die Möglichkeit erhöht, dass dieser Transkriptionsfaktor auch eine Rolle bei der Wiederherstellung von Alkoholerinnerungen spielt.

Während die Rolle von Bdnf bei der Wiederherstellung des Gedächtnisses weiterhin umstritten ist [19, 49], ist die Bdnf-Induktion bekanntermaßen von entscheidender Bedeutung für das Lernen von Gedächtniserwerb und -auslöschung [19, 62]. Das Fehlen einer Änderung der Bdnf-Expression in unserer Studie könnte daher darauf hindeuten, dass unser Gedächtnisabrufverfahren parallel zum Gedächtnisabruf kein Extinktionslernen initiierte.

Darüber hinaus haben wir kürzlich berichtet, dass, obwohl die mRNA-Spiegel von Bdnf in der DH nicht per se durch Alkohol-Gedächtnisabruf erhöht werden, die Expression des Wachstumsfaktors erhöht war, wenn auf den Abruf eine aversive Gegenkonditionierung folgte, die einen Rückfall verhinderte [44], was auf eine komplexe Rolle von Bdnf schließen lässt in der Dynamik des Alkoholgedächtnisses.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Anstieg der IEG-Expression nicht nur auf die Wiederherstellung alkoholbezogener Erinnerungen zurückzuführen ist.

Tatsächlich waren ARC und EGR1 zuvor an der Konsolidierung verschiedener Arten von Erinnerungen beteiligt, darunter Angsterinnerungen [19, 46, 47, 62], Erkennungserinnerungen [21] und Erinnerungen im Zusammenhang mit verschiedenen Drogen [20, 22, 61].

Es gibt jedoch auch zunehmend Hinweise darauf, dass sich einige der Mechanismen, die der Alkoholsucht zugrunde liegen, von denen unterscheiden könnten, die das natürliche Belohnungsstreben steuern [5, 27, 28, 63]. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass Erinnerungen an unterschiedliche Belohnungen (und insbesondere an unterschiedliche Drogen) unterschiedlich verarbeitet werden [29–32]. Die Ergebnisse unserer RNAseq-Analyse enthüllten tatsächlich die einzigartige transkriptomische Signatur, die durch das Abrufen des Alkoholgedächtnisses induziert wird.

Konkret fanden wir 44 Gene im DH und einen anderen Satz von 9 Genen im PFC, die nach dem Abrufen des Alkoholgedächtnisses signifikante Veränderungen zeigten. Nach weiterer Datenvalidierung konzentrierten wir uns auf ein Gen im mPFC (Fkbp5) und drei Gene im DH (Adcy8, Scl8a3 und Neto1) und stellten fest, dass ihre Expression durch den Abruf von Saccharose-assoziierten Erinnerungen nicht beeinflusst wurde.

Dies deutet darauf hin, dass diese vier spezifischen Gene im Gegensatz zu Arc und Egr1 wahrscheinlich keine allgemeine Rolle bei der Verarbeitung von Belohnungserinnerungen spielen, sondern möglicherweise eher eine selektive Rolle bei der Verarbeitung von Alkoholerinnerungen spielen.

Interessanterweise wurden diese vier Gene zuvor mit Störungen des Alkoholkonsums sowie mit Lern- und Gedächtnisstörungen in Verbindung gebracht. Somit kodiert Fkbp5 für das FK506-Bindungsprotein 5, einen Regulator des neuroendokrinen Stresssystems [64].

FKBP5-Varianten modulieren die Schwere des Alkoholentzugssyndroms [65] und sagen die Neigung zu starkem Alkoholkonsum beim Menschen voraus [66–68]. Es wurde gezeigt, dass die Deletion von Fkbp5 bei Mäusen die Schwere des Alkoholentzugs [65] und den Alkoholkonsum [67] steigerte, wohingegen die pharmakologische Hemmung des Proteins den moderaten Alkoholkonsum und die Wiederherstellung von CPP bei Mäusen reduzierte [69] und den Alkoholkonsum bei gestressten männlichen Ratten reduzierte [70].

Die Konzentrationen der Adcy8-mRNA, die für Adenylatcyclase 8 (AC8) kodiert, die die cAMP-Bildung als Reaktion auf den Kalziumeinstrom katalysiert und kürzlich als möglicher Regulator der Alkoholaufnahme angesehen wurde [28, 71], waren in Blutzellen von Alkoholikern, die über lange Zeit abstinent waren, verringert [72].

Es wurde zuvor gezeigt, dass die Löschung von Adcy8 den Alkoholkonsum reduziert und die Empfindlichkeit gegenüber den sedierenden Wirkungen von Alkohol bei Mäusen erhöht [73]. Darüber hinaus regulierte eine chronische Alkoholexposition bei Ratten die Gehirnexpression der Trägerfamilie 8 (Natrium/Kalzium-Austauscher), Mitglied 3 (NCX3), des von Scl8a3 kodierten Proteins, hoch [74, 75].

Alkoholkonsum bei Ratten war auch mit einer verringerten Hirnstammexpression von Neto1 verbunden [76], das für Neuropilin Tolloid-like 1 (NRP1) kodiert, einem Bestandteil des NMDA-Rezeptorkomplexes [77].

Dieses Protein ist an der synaptischen Reorganisation und Übertragung im Hippocampus beteiligt [78] und wird für räumliches Lernen und Gedächtnis benötigt [77].

Unsere Ergebnisse zeigen also, dass das bloße Abrufen von Alkoholerinnerungen, auch ohne pharmakologische Wirkungen von Alkohol, die Expression dieser Gene beeinflusst. Ihre spezifische Rolle bei der Wiederherstellung des Alkoholgedächtnisses und bei Rückfällen muss jedoch noch getestet werden.

Eine Einschränkung der vorliegenden Studie besteht darin, dass der RNA-seq-Assay an den mPFC- und DH-Massengeweben und nicht an einzelnen Zellen durchgeführt wurde, die durch Gedächtnisabruf aktiviert wurden. Insbesondere haben neuere Studien darauf hingewiesen, dass Erinnerungen im Allgemeinen [79, 80] und insbesondere alkoholbezogene Erinnerungen [32, 81, 82] über die Aktivierung neuronaler Ensembles kodiert werden, die aus einer kleinen Anzahl von Neuronen bestehen, die über neuronale Aktivierungsmarker identifiziert werden können ( z. B. cFOS) [80].

Tatsächlich wurden ähnliche IEG (cFOS)-Aktivierungsmuster durch den Abruf operanter bedingter Alkohol- und süßer Belohnungserinnerungen im mPFC und in zusätzlichen mesolimbischen Regionen im Rattengehirn gefunden [32, 81]. Daher ist es möglich, dass die selektive Durchführung des RNA-seq-Assays an dem durch Gedächtnisabruf aktivierten Neuronalensemble zu genaueren Ergebnissen geführt hätte.

Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass das Abrufen des Alkoholgedächtnisses zwei parallele Transkriptionsprogramme induziert. Ein Programm, das über gemeinsame molekulare Mechanismen des Lernens und Gedächtnisses, einschließlich der IEGs Arc und Egr1, vermittelt wird, befasst sich mit der Konsolidierung von Erinnerungen im Allgemeinen.

Das andere Transkriptionsprogramm, das durch den Abruf des Alkoholgedächtnisses in Gang gesetzt wird, wird von Genen gesteuert, die speziell alkoholbezogenes Verhalten fördern. Dieses duale Verarbeitungsmodell für Alkoholerinnerungen lässt die Möglichkeit aufkommen, dass die Gedächtnisrekonsolidierung für verschiedene Erinnerungen ähnliche duale molekulare Mechanismen haben könnte, wobei einige Komponenten von mehreren Erinnerungen gemeinsam genutzt werden und andere für jeden Speichertyp einzigartig sind.

Dieses hypothetische Modell muss noch beurteilt werden, indem untersucht wird, ob die Manipulation dieser Gene die Wiederherstellung des Alkohol- und Saccharose-Gedächtnisses unterschiedlich beeinflusst. Wenn ja, würde es darauf hindeuten, dass es möglich sein könnte, auf belohnungsspezifische molekulare Ziele zu zielen, um Störungen im Zusammenhang mit pathogenen Erinnerungen, wie z. B. Sucht, zu behandeln, anstatt wichtige molekulare Mechanismen zu stören, die für viele Funktionen über die Wiederherstellung des Alkoholgedächtnisses hinaus wesentlich sind.

MATERIALEN UND METHODEN

Einzelheiten zu den Geräten, Medikamenten und Reagenzien, dem Design und der Vorbereitung von Oligodesoxynukleotiden (ODN), Westernblot- und qRT-PCR-Analysen sowie der Vorbereitung der RNA-seq-Bibliothek finden Sie in den ergänzenden Informationen.

Tiere

Männliche und weibliche C57BL/JRccHsd-Mäuse (25–30 g), 3–4 pro Käfig gehalten, wurden in der Tiereinrichtung der Universität Tel Aviv (Israel) gezüchtet und unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten (Licht an um 7 Uhr morgens). mit Nahrung und Wasser adlibitum zur Verfügung.

In Experimenten mit Saccharose-Platzkonditionierung wurde der Zugang zu Futter vor den Trainingseinheiten sechs Stunden lang eingeschränkt, um die Motivation der Mäuse zum Sammeln von Saccharose-Pellets zu steigern. Diese kurze Dauer des Nahrungsentzugs basiert auf Erkenntnissen, dass ein zwei- bis sechsstündiges Fasten tagsüber keinen Einfluss auf das Essverhalten hat [83] und keine signifikante Verschiebung der Stoffwechselmarker auslöst [84], wodurch die Auswirkungen der Nahrungsrestriktion an sich minimiert werden .

Um den Gewichtsverlust zu kontrollieren, wurden die Mäuse zweimal pro Woche gewogen. Alle Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Tel Aviv und den NIH-Richtlinien (Animal Welfare Assurance NumberA5010-01) genehmigt und entsprechen diesen. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren.

Verhaltensverfahren

Platzkonditionierung

Alkoholbedingte Ortspräferenz (CPP): Alle Mäuse wurden 3 Tage lang an tägliche ip-Kochsalzinjektionen gewöhnt.

Basistest (Tag 1): Am ersten Tag wurde die Schiebetür zurückgezogen und die Mäuse durften den gesamten Apparat 30 Minuten lang frei erkunden. Konditionierung des Alkoholplatzes (Tage 2–9): Das Training begann 24 Stunden nach dem Basistest mit einer Sitzung täglich über 8 Tage verabreicht, bei geschlossener Schiebetür. An den Tagen 3, 5, 7 und 9 erhielten die Mäuse Alkohol (1,8 g/kg, 20 % v/v; ip) und wurden sofort für 5 Minuten in das Paarkompartiment eingesperrt.

Es wurde zuvor gezeigt, dass diese Dosis und Konditionierungsdauer alkoholinduziertes CPP hervorruft [42, 85]. An den abwechselnden Tagen (d. h. an den Tagen 2, 4, 6 und 8) erhielten die Mäuse eine Kochsalzlösung und wurden für die gleiche Dauer wie am Tag der Alkoholkonditionierung in das ungepaarte Abteil eingesperrt.

Gepaarte Kompartimente wurden ausgeglichen. Ortspräferenztest 1 (Tag 10): Der Ortspräferenztest erfolgte wie für den Basistest beschrieben und diente der Indexierung des Alkohol-CPP [41]. Präferenz wurde als Anstieg des Prozentsatzes der Zeit definiert, die während des Ortspräferenztests 1 im Vergleich zum Basistest in der Alkoholkompartiment verbracht wurde.

Erinnerungsabruf (Tag 11): Vor diesem Stadium wurden die Mäuse unterschiedlichen Versuchsbedingungen zugewiesen (angepasst hinsichtlich CPP-Werten und Geschlecht). Während einer Gedächtnisabrufsitzung wurden die Mäuse drei Minuten lang in der mit Alkohol behandelten Abteilung eingesperrt und dann in ihre Heimkäfige zurückgebracht. Kontrollmäuse wurden kurz behandelt. Ortspräferenztest 2 (Tag 12): Die Mäuse wurden einem Ortspräferenztest unterzogen, der mit dem Ortspräferenztest 1 identisch war.

Saccharose-CPP: Saccharose-Vortraining (Tage 1–6): An den Tagen 1–3 wurden die Mäuse daran gewöhnt, 5–6 Saccharosepellets (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA) in Heimkäfigen zu sammeln . An den Tagen 4–6 wurden die Mäuse darauf trainiert, während {{12}minütigen Sitzungen 3 Pellets in einer leeren Plexiglasbox zu sammeln. Mäuse, die während des Saccharose-Trainings weniger als sechs Pellets (von insgesamt neun Pellets über die drei Tage) sammelten, wurden vom Experiment ausgeschlossen (2 Mäuse von 32).

Basistest (Tag 7): Am siebten Tag wurde die Schiebetür in einer CPP-Kammer zurückgezogen und die Mäuse durften den gesamten Apparat 30 Minuten lang erkunden. Auch hier wurde ein unvoreingenommener Geräte-/unvoreingenommener Zuordnungsansatz angewendet, wie er im Alkohol-CPP-Verfahren beschrieben ist. Saccharose-Platzkonditionierung (Tage 8–15): Das Training begann 24 Stunden nach dem Basistest mit einer Sitzung pro Tag über 8 Tage, mit Gleiten Tür geschlossen. An den Tagen 9, 11, 13 und 15 wurden die Mäuse in das Paarkompartiment gesetzt und eine Minute später wurden drei Saccharosepellets auf dem Boden verteilt.
15 Minuten später wurden die Mäuse in ihre Heimkäfige zurückgebracht. An den abwechselnden Tagen (dh den Tagen 8, 10, 12 und 14) wurden die Mäuse 15 Minuten lang ohne Störung in das ungepaarte Abteil gebracht.

Gepaarte Kompartimente wurden ausgeglichen. Ortspräferenztest 1 (Tag 16): Der Ortspräferenztest erfolgte wie für den Basistest beschrieben und diente der Indexierung des Saccharose-CPP. Präferenz wurde als Anstieg des Prozentsatzes der Zeit definiert, die während des Ortspräferenztests 1 im Vergleich zum Basistest im Saccharose-Paarkompartiment verbracht wurde ).

Validierung von Oligodesoxynukleotiden (ODN).

Das Design von Arc-Antisense-ODN (AS-ODN) und verschlüsseltem ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) folgte den zuvor beschriebenen Richtlinien [56, 86].

Arc AS-ODN-Funktionsvalidierung. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl, 0,25 µl/min) wurde in die DH in einer Hemisphäre infundiert, und SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}},5 µl, 0,25 µl/min) wurde in die andere Hemisphäre infundiert (die Seiten waren im Gleichgewicht). Zwei oder vier Stunden später erkundeten die behandelten Mäuse fünf Minuten lang einen unbekannten Kontext (CPP-Kompartiment, siehe Gerätebeschreibung oben), um eine neuheitsabhängige ARC-Expression zu induzieren. Mäuse wurden eine Stunde später eingeschläfert (d. h. 3 oder 5 Stunden nach der ODN-Infusion), Gehirngewebe wurde gesammelt und die ARC-Proteinspiegel wurden durch Western-Blot-Analyse bestimmt (Abbildung S4).

Chirurgische Eingriffe und intrahippocampale Mikroinfusionen: Chirurgische Eingriffe und Mikroinfusionen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt[42, 87].

Operation. Stereotaktische Eingriffe wurden unter Isoflurananästhesie durchgeführt. Die Mäuse wurden in einen stereotaktischen Rahmen (RWD Life Science, Shenzhen, China) gelegt und bilaterale Führungskanülen (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) auf den DH gerichtet die folgenden Koordinaten (–2 mm hinter dem Bregma, ±1,3 mm mediolateral, –1,45 mm ventral der Schädeloberfläche). Kanülen wurden mit Dentalacryl gesichert. Passende Dummykanülen (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) wurden in die Führungskanülen eingeführt und mit Staubkappen versehen, um die Injektorstelle bedeckt und frei von Ablagerungen zu halten. Den Mäusen wurde erlaubt, sich vor dem Alkohol-CPP-Training 7–10 Tage lang zu erholen.

Intrahippocampale Infusionen. Actinomycin D (4 µg/µl, 0,5 µl pro Seite, 0,25 µl/min, in DMSO) [19] oder ein äquivalentes Vehikelvolumen wurde unmittelbar nach dem Abrufen des Gedächtnisses in den DH mikroinjiziert . Es wurde gezeigt, dass die Infusion von Actinomycin D in den Hippocampus in einer ähnlichen Konzentration die Wiederherstellung des Gedächtnisses stört [19]. Arc AS-ODN oder Kontroll-SCR-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl/Seite, 0,25 µl/min; in PBS) wurde 4 Stunden vor oder 2 Stunden in den DH mikroinjiziert 4 Stunden nach dem Abrufen des Gedächtnisses.

Nach dem Entfernen des Staubbechers und der Dummy-Kanülen wurde über einen Zeitraum von 2 Minuten eine Mikroinfusion an wachgehaltenen Mäusen durchgeführt, wobei Injektionskanülen (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) verwendet wurden, die 0,5 mm über die Führung hinausragten Kanülenspitze. Die Injektionskanülen wurden weitere 2 Minuten an Ort und Stelle belassen. Nach der Infusion wurden Blindkanülen in die Führungskanülen eingeführt, mit der Staubkappe gesichert und die Tiere kehrten in ihre Heimkäfige zurück. Die Lage der Kanülen wurde in 30 μm dicken koronalen Schnitten von mit Kresylviolett gefärbtem Paraformaldehyd-fixiertem Gewebe überprüft.

Datenanalyse

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75 % der Zeit, die sich während des Basistests in einem der Kompartimente aufhielt, wurden von der Studie ausgeschlossen (9 von 267). Die CPP-Einstellung wurde durch den Vergleich der CPP-Werte zwischen der Basislinie und dem CPP-Test 1 bestätigt und durch einen gepaarten T-Test analysiert. Da die Expression von CPP (d. h. Gedächtnisbildung) für den Gedächtnisabruf erforderlich ist, wurden Daten von Mäusen, die kein CPP zeigten (ein Anstieg der Präferenz um mindestens 5 % zwischen dem Ausgangswert und Test 1), vom Experiment ausgeschlossen (48 von 258).

Alkohol-CPP nach Beeinträchtigung der Gedächtnisrekonsolidierung wurde durch eine gemischte Modell-ANOVA mit einem Zwischensubjektfaktor der Behandlung (Actinomycin D oder ODN) und einem Innersubjektfaktor des Tests (CPP-Test 1, CPP-Test 2) analysiert. Signifikante Wechselwirkungen wurden durch einen Student-Newman-Keuls-Post-hoc-Test analysiert. Die Dichten der Western-Blot-immunreaktiven ARC-Proteinspiegel wurden auf die GAPDH normalisiert und durch eine einfaktorielle ANOVA mit einem Zwischen-Subjekt-Faktor der Behandlung, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test, analysiert. qRT-PCR-mRNA-Expressionsdaten wurden auf Gapdh normalisiert und als Prozentsatz der Expression einer Kontrollgruppe ausgedrückt.

Daten von allen Genen für jede Gehirnregion wurden durch eine einfache ANOVA mit einem Zwischen-Subjekt-Faktor von Behandlung analysiert, gefolgt von Dunnett-Test für jedes Gen, zum Vergleich mit den Daten, die von einer Kontrollgruppe (kein Abruf) erhalten wurden. Für RNA-seq, Wir haben Gewebe von 3 Tieren für jedes Replikat gepoolt und die folgende Anzahl von Replikaten vorbereitet: 3 für den dorsalen Hippocampus (DH) – keine Retrieval, 2 für DH – Retrieval, 3 für den präfrontalen Kortex (PFC) – keine Retrieval und 2 für ( PFC)-Rückgewinnung. Nach der vollständigen RNA-Isolierung mit Trizol wurden Sequenzierungsbibliotheken mit der von uns entwickelten Methode erstellt [88].

Die Bibliotheken wurden einer 50-bp-Single-End-Sequenzierung mit IlluminaHiseq 2000 unterzogen. Nach Bestätigung der Qualität der Sequenzierungsdaten durch FastQC wurden die Lesevorgänge mithilfe von Bowtie2 (89) auf das mm9-Referenzgenom abgebildet und mit Tophat2 (90) annotiert.

Den Genen zugeordnete Reads wurden durch FeatureCounts quantifiziert [91]. Wir haben Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a und das mitochondriale Chromosom ausgeschlossen, um die Zählung überamplifizierter Gene zu vermeiden, die die Bibliotheksnormalisierung verzerren könnten, wie zuvor beschrieben [92]. DESeq2 [58] wurde verwendet, um differentiell exprimierte Gene (DEG) in der Retrieval-Gruppe im Vergleich zur No-Retrieval-Kontrollgruppe mit einem an die Signifikanzgrenze angepassten p-Wert (p(adj) < 0.05) zu identifizieren.

DATENVERFÜGBARKEITRNA-seq-Daten sind bei NCBI Gene Expression Omnibus unter https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) mit einem Prüfer-Token verfügbar: knyfwwiorbutvuv.

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