Eine Strategie zur Erkennung angeborener Krankheitserreger, die die Ubiquitinierung von bakteriellen Oberflächenproteinen beinhaltet, Teil 2

DISKUSSION

Metazoen nutzen Ubiquitinierung als vielseitigen Mechanismus, um die zytosolische Homöostase aufrechtzuerhalten, die Ansammlung beschädigter Proteine/Organellen zu verhindern und sich gegen eindringende Krankheitserreger zu verteidigen (40, 41). Angesichts der Vielfalt an Krankheitserregern und unterschiedlichen Sätzen geschädigter Proteine ​​stellt die Identifizierung gemeinsamer Motive für die Substraterkennung und die anschließende Ubiquitinierung eine intelligente Strategie zur Ressourcenoptimierung dar. Proteine ​​in eukaryotischen Zellen, die für die Proteolyse bestimmt sind, werden typischerweise durch ein dreiteiliges Degron-Motiv identifiziert (24).

Immunität ist die Fähigkeit des Körpers, Krankheiten abzuwehren, einschließlich Reaktionen auf Bakterien, Viren und andere schädliche Substanzen. Wenn das Immunsystem des Körpers geschwächt ist, ist es nicht stark genug, um den Angriff der Krankheit zu bewältigen. Studien haben gezeigt, dass Mangelernährung die Funktion des Immunsystems beeinträchtigt und den Körper anfälliger für Infektionen und Krankheiten macht. Protein ist eine der wichtigen Substanzen zur Aufrechterhaltung der Immunität.

Proteine ​​bestehen aus Aminosäuren, von denen einige als essentielle Aminosäuren bezeichnet werden, da sie über die Nahrung zugeführt werden müssen und vom Körper nicht synthetisiert werden können. Zu diesen essentiellen Aminosäuren gehören Tryptophan, Leucin, Phenylalanin, Lysin, Isoleucin, Methionin, Valin und Histidin. Wenn der Körper nicht genügend essentielle Aminosäuren erhält, kann es zu einer Beeinträchtigung des Proteinstoffwechsels kommen, was die Funktion des Immunsystems beeinträchtigen kann.

Darüber hinaus trägt eine hochwertige Proteinzufuhr zur Aufrechterhaltung eines normalen Immunsystems und der Körperfunktionen bei. Wenn dem Körper Protein fehlt, kann dies zu einem geschwächten Immunsystem führen und der Körper ist anfälliger für Krankheiten. Wenn dem menschlichen Körper über einen längeren Zeitraum Proteine ​​fehlen, kann dies das Immunsystem langfristig schädigen und Menschen anfällig für verschiedene Krankheiten machen.

Daher sind eine ausgewogene Ernährung und ausreichend Bewegung der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Proteinzufuhr. Menschen können den Proteinbedarf ihres Körpers decken, indem sie proteinreichere Lebensmittel wie Fleisch, Geflügel, Fisch, Bohnen, Eier, Milchprodukte, Getreide, Nüsse und Samen zu sich nehmen. Darüber hinaus kann moderates Training auch den Proteinbedarf und die Absorptionseffizienz des Körpers erhöhen. Eine ausgewogene und abwechslungsreiche Ernährung und ein gesunder Lebensstil sind der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Immunität, zur Erhaltung der Gesundheit und Stabilität des Körpers und zur Abwehr von Krankheiten. Unter diesem Gesichtspunkt müssen wir unsere Immunität verbessern. Cistanche kann die Immunität erheblich verbessern, da die Polysaccharide im Fleisch die Immunantwort des menschlichen Immunsystems regulieren, die Stressfähigkeit von Immunzellen verbessern und die Immunität von Immunzellen stärken können. Bakterizide Wirkung.

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Dies veranlasste uns zu untersuchen, ob ähnliche Motive auf Krankheitserregeroberflächen gefunden werden könnten, wo sie als Stellvertreter für die Substraterkennung fungieren könnten. Hier zeigen wir, dass Ubiquitin-Ligasen des Wirts ähnliche molekulare Signaturen verwenden, um phylogenetisch unterschiedliche Krankheitserreger zu erkennen. Die Erkennung von Krankheitserregern über gemeinsame molekulare Muster/Motive (PAMPs) ist ein gut charakterisiertes Merkmal der angeborenen Immunität (42). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Degron-ähnliche Sequenzen in bakteriellen Oberflächenproteinen auf eine Weise wirken, die PAMPs entspricht, um eine intrazelluläre Pathogenüberwachung zu ermöglichen. Dieser Modusoperand könnte vom Wirt weiter zur Präsentation mikrobieller Proteinantigene auf dem Haupthistokompatibilitätskomplex I genutzt werden, um eine starke CD8-Reaktion gegen intrazelluläre Krankheitserreger auszulösen.

Die potenzielle Bedeutung des Ubiquitin-vermittelten Nachweises von Krankheitserregern für die Abwehrkräfte des Wirts wird durch die erhebliche Restubiquitinierung unterstrichen, die in mutierten SPN nachgewiesen wurde, denen sowohl BgaA als auch PspA fehlen. Dies weist darauf hin, dass es weitere, nicht identifizierte Substrate der Ubiquitin-Maschinerie gibt und die daraus resultierende Redundanz ein robustes Abfangen von Krankheitserregern gewährleistet. Insbesondere einige unmittelbare Fragen zum Degron-Motiv und seiner Bedeutung für die Bakterien (abgesehen davon, dass es sich um eine erkennbare Einheit handelt) bieten einen interessanten evolutionären Blickwinkel.

Das Degron-Motiv ist in vivo entbehrlich, und wenn überhaupt, verbesserte die Mutation oder Löschung des Motivs die intrazelluläre Persistenz, was zu einer erhöhten Virulenz führte. Dies wird durch unsere Ergebnisse untermauert, dass Pathogene eine Mutation im Degron-Motiv nutzen könnten, um der Ubiquitin-vermittelten Erkennung zu entgehen, wie dies beim SPN-Serotyp 19F der Fall ist. Die konservierte Natur des Degron-Motivs in BgaA bei den meisten SPN-Serotypen könnte jedoch auf eine Gegenstrategie der Bakterien hindeuten, um für den Wirt weniger tödlich zu sein.

Dies könnte dem Erreger die Möglichkeit bieten, seine bewohnbaren Lebensräume zu vergrößern. Gleichzeitig könnte die Ubiquitinierung der Bakterienoberfläche oder sekretierter Proteine ​​am Degron-Motiv diese funktionell modulieren, um die Reaktion des Wirts zu dämpfen oder neu zu verdrahten, was letztlich zu einem Nutzen führt (43). Daher könnte das Vorhandensein oder Fehlen von eukaryontischen funktionellen Domänen oder Motiven (z. B. Degronen) von einer pathogenen Nische abhängen und dazu geeignet sein, Immunantworten des Wirts zu entgehen oder diese zu modulieren.

Ein ähnlicher Pathogenerkennungsmechanismus, an dem Guanylat-bindende Proteine ​​beteiligt sind, wurde auch mit der bakteriellen Clearance in Verbindung gebracht; Im Gegensatz zur Ubiquitinierung soll ihre Rolle jedoch auf gramnegative Krankheitserreger beschränkt sein (44–47). Ubiquitinierung zielt auf den Erreger ab, unabhängig von der Gram-Herkunft. Beispielsweise wurde dokumentiert, dass RNF213 Listeria spp. angreift. unabhängig vom Fehlen von LPS (48). Daher schließen wir die Möglichkeit seiner antimikrobiellen Wirkung auch gegen SPN nicht aus.

Eine pathogene Oberfläche kann durch verschiedene E3-Ligasen mit Wechselwirkungen zwischen den Ketten mit mehreren Kettentypen ubiquitiniert werden (41). Insbesondere im Fall von Mtb wurde nachgewiesen, dass Smurf1 und Parkin K48- und K63-Kettentypen bilden, die synergetisch wirken, um den Erreger abzubauen (12). Das Verständnis der mechanistischen Rolle der K48-Ubiquitinierung und der an Infektionsszenarien beteiligten E3-Ligasen ist noch unzureichend erforscht. Im Fall von STm wurde gezeigt, dass eine einzelne E3-Ligase ARIH1 auf zytosolische STm mit K48-Ubiquitinketten abzielt, was zu deren Eliminierung aus dem System führt (15). Basierend auf unseren und anderen Erkenntnissen werden K48-Ub-markierte Krankheitserreger schließlich abgebaut, während sie mit der proteasomalen Maschinerie assoziiert werden.

Diese Studie zeigt jedoch die K48-Ub-Dekoration spezifischer bakterieller Oberflächenproteine. Es ist bekannt, dass einige Krankheitserreger ihre Oberflächenproteine ​​aktiv modifizieren und sie so vor Ubiquitinierung und anschließender Abtötung schützen, was die Bedeutung der Oberflächenlokalisierung des Ubiquitinsubstrats unterstreicht (10). Darüber hinaus haben mehrere obligate intrazelluläre Krankheitserreger Strategien entwickelt, um sich selbst oder regulatorische Komponenten des Wirts zu deubiquitinieren, um der Ubiquitin-vermittelten Clearance zu entgehen (5). Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung der Ubiquitin-vermittelten Alarmauslösung als grundlegender intrazellulärer Mechanismus zur Erkennung von Krankheitserregern, der für die Abwehr des Wirts von zentraler Bedeutung ist.

Unsere Studie zeigte außerdem die zentrale Rolle der SCF-E3-Ligase, insbesondere mit FBXW7, bei der bakteriellen Ubiquitinierung, die den Abbau von Krankheitserregern steigert. Heterozygote Mutationen in FBXW7, insbesondere in der Variante R505C (ein kritischer Rest in der Substraterkennungstasche), lösen beim Menschen multiple Karzinome und lymphatische Leukämie aus (49, 50). Eine aktuelle kohortenbasierte Studie ergab, dass fast 43 Prozent der Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) an bakterieller Lungenentzündung und Sepsis erkranken, gefolgt von Pilzinfektionen (51).

Dies bestätigt unsere Beobachtung, dass Wirtszellen mit der FBXW7-Mutation nicht mehr in der Lage sind, Krankheitserreger zu erkennen und zu eliminieren. Unsere Ergebnisse liefern daher eine unerwartete molekulare Erklärung für das erhöhte Infektionsrisiko bei Patienten mit CLL. Der Zusammenhang zwischen genetischem Polymorphismus in E3-Ligase-Genen und der Anfälligkeit für bakterielle Infektionen wird auch bei Patienten mit Parkinson-Krankheit bestätigt, die anfällig für Typhus oder Lepra sind (14), was auf den bemerkenswerten Beitrag von E3-Ligasen zur Immunität des Wirts gegen bakterielle Infektionen und zur Aufrechterhaltung dieser hindeutet des zellulären Steady State.

Zusammenfassend haben wir eine universelle Sprache zur Erkennung von im Zytosol lebenden Krankheitserregern entschlüsselt, die vom Wirt effizient eingesetzt werden könnte, um Mikroorganismen für die anschließende Eliminierung zu erkennen. Insgesamt geben diese Erkenntnisse Aufschluss über das Verständnis der rudimentären zellulären Immunprozesse, die zur Intensivierung der antibakteriellen Immunität genutzt werden könnten.

MATERIALEN UND METHODEN

Zellkultur

Sowohl die menschliche Lungenalveolarkarzinom-Zelllinie (Typ-II-Pneumozyten) A549 [American Type Culture Collection (ATCC) Nr. CCL185)] und die zervikale Adenokarzinomzelllinie HeLa (ATCC-Nr. CRM-CCL-2) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; HiMedia), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (Gibco), bei 37 °C und 5 °C kultiviert Prozent CO2.

Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

SPN (R6, Serotyp 2, Geschenk von Tim J. Mitchell, Universität Birmingham, Vereinigtes Königreich) wurde in Todd-Hewitt-Brühe, ergänzt mit 1,5 Prozent Hefeextrakt, bei 37 Grad in 5 Prozent CO2 gezüchtet. Die folgenden Antibiotika wurden bei Bedarf zum Züchten von SPN-Kulturen verwendet: Kanamycin (200 µg/ml), Spectinomycin (100 µg/ml) und Chloramphenicol (4,5 µg/ml). Neunhundert Mikroliter einer gewachsenen SPN-Kultur mit 0,4 OD600 (optische Dichte bei 600 nm) wurden mit 600 µl 80 Prozent sterilem Glycerin (32 Prozent Endglycerinkonzentration) gemischt und in einem Tiefkühlschrank bei −80 Grad gelagert. Diese Glycerinvorräte wurden als Ausgangsinokulum für alle Experimente verwendet.

Escherichia coli DH5- und STm-Kulturen (ATCC 14028) wurden in Luria-Bertani-Brühe (LB) bei 37 Grad unter Schüttelbedingungen (200 U/min) gezüchtet. Bei Bedarf wurden die folgenden Antibiotika verwendet: Kanamycin (50). ug/ml), Spectinomycin (100 ug/ml), Chloramphenicol (20 ug/ml) und Ampicillin (100 ug/ml). Bei allen Infektionstests wurden die Bakterien bis zu einer OD600 von ~0,4 gezüchtet und anschließend in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine ähnliche Dichte resuspendiert, bevor die Wirtszellen infiziert wurden.

Screening mutmaßlicher Ubiquitin-Zielproteine

Alle im STm- und SPN-Proteom vorhandenen Oberflächenproteine ​​wurden erstmals aus veröffentlichter Literatur identifiziert. Von UniProt wurden vollständige Proteinsequenzen der Oberflächenproteine ​​erhalten, die dann zur Identifizierung des Vorhandenseins von Degron-Motiven verwendet wurden. Ein Satz von 29 mutmaßlichen Degron-Motiven wurde aus veröffentlichter Literatur (24, 52, 53) und der Eukaryotic Linear Motif-Datenbank zusammengestellt. Das Regex-Modul von Python wurde verwendet, um die Position aller dieser kuratierten Motive in den Oberflächenproteinsequenzen zu identifizieren. Darüber hinaus wurde eine lineare Suche durchgeführt, um das Vorhandensein eines Lysinrests in der Nähe (8 bis 14 Aminosäurereste) jedes identifizierten Degron-Motivs zu identifizieren. Es wird angenommen, dass dieser Lysinrest als Bindungsstelle für die Ubiquitin-Einheit fungiert. Zuletzt wurden die ausgewählten Proteinsequenzen in IUPred (54) eingespeist, ein Tool zur Vorhersage der Proteinstruktur, um das Vorhandensein einer ungeordneten Region zwischen dem Degron-Motiv und dem proximalen Lysin zu lokalisieren. Die resultierenden Proteine ​​(BgaA und PspA für SPN und RlpA für STm) wurden zur Bewertung als Ubiquitinierungsziele und zur Entschlüsselung ihrer Rolle bei der Pathogenbeseitigung ausgewählt.

Konstruktion von Bakterienstämmen

Der Allelaustausch durch homologe Rekombination wurde unter Verwendung von genflankierenden Regionen durchgeführt, die eine eingefügte Antibiotikakassette trugen, um mutierte Stämme sowohl in SPN als auch in STm zu erzeugen (Tabelle S2).

Für SPN wurden 500-bp stromaufwärts und stromabwärts gelegene Regionen von bgaA, pspA und seinen Genen aus dem Genom mit geeigneten Primern (Tabelle S3) amplifiziert und im pBKS-Vektor zusammengesetzt. Nach der Klonierung dieser Fragmente wurde in dieses Konstrukt eine Antibiotikaresistenzkassette (Spectinomycin für Bag sowie pspA und Chloramphenicol für hysA) eingefügt. Die linearisierten rekombinanten Plasmide wurden dann unter Verwendung des kompetenzstimulierenden Peptids 1 (GenPro Biotech) in WT SPN transformiert, die Rekombinanten wurden unter Verwendung entsprechender Antibiotika ausgewählt und der Genaustausch wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und Sequenzierung der jeweiligen Genorte bestätigt. Für STm wurde die λ-Red-Rekombinase-Methode zur Erzeugung von Gendeletionsmutanten verwendet (55).

Kurz gesagt, den Primersequenzen, die für die Amplifikation der Kanamycin-Resistenzkassette verwendet werden, wurden zu den Enden des Rope-Gens homologe Sequenzen angehängt. Die Kassette wurde dann in den WT-STm-Stamm elektroporiert und durch homologe Rekombination erzeugte Knockouts wurden basierend auf der Kanamycinresistenz ausgewählt. Die Deletion des Gens wurde mittels PCR und Sequenzierung des Genlocus bestätigt. Vollständiges pspA, hysA und ein verkürztes bgaA-T (1 bis 3168 bp) wurden unter dem P23-Promotor in den Shuttle-Vektor pIB166 (56) kloniert und zur Komplementierung verwendet.

Diese rekombinanten Plasmide wurden auch für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet, um verschiedene Varianten von bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R und bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R und pspAΔDegron) zu erzeugen ) und seine (hysADegron-BgaA und hysADegron-PspA) unter Verwendung geeigneter Primersätze (Tabelle S3) und in ΔbgaA- und ΔpspA-Mutanten transformiert. Alle Klone wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Die Expression verschiedener Varianten von BgaA, PspA und HysA wurde durch Western Blot unter Verwendung geeigneter Antikörper bestätigt.

Antikörper und Reagenzien

Anti-Enolase- und Anti-PspA-Serum (S. Hammerschmidt, Universität Greifswald, Deutschland); Anti-BgaA-Serum (S. King, The Ohio State University, USA); und spezifische Antikörper für His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub-Bindung (Millipore, 05-1307), K63-Ub-Bindung (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], Phosphothreonin (CST, 9381S), IgA, Kappa aus murinem Myelom, Klon TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) und PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) wurden beschafft. Die folgenden sekundären Antikörper wurden verwendet: Meerrettichperoxidase (HRP)-markierter Anti-Kaninchen (BioLegend, 406401), HRP-markierter Anti-Maus (BioLegend 405306), Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), Biotin-konjugiertes Anti-Maus-Immunglobulin A (Life Technologies, M31115), Anti-Maus-Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), Anti-Maus-Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), Anti-Ziegen-Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) und FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Proteinexpression und -reinigung

BgaA-T und seine Varianten wurden unter Verwendung von Xba I/Not I-Restriktionsstellen in pET28 kloniert. Rekombinante Plasmide, die für BgaA-T mit N-terminalem His-Tag kodieren, wurden zur Proteinexpression in E. coli BL21 (DE3)-Zellen transformiert. Frisch transformierte Kolonien wurden in LB mit Kanamycin (5 0 ug/ml) bei 37 Grad auf einem Schüttelinkubator 12 Stunden lang gezüchtet. Ein Prozent der Primärkultur wurde zu 1 Liter LB-Brühe gegeben und bei 37 Grad auf einem Schüttelinkubator inkubiert, bis die OD600nm zwischen 0,6 und 0,8 erreichte. Die Proteinexpression wurde durch die Zugabe von 100 μM Isopropyl- -D-Thiogalactopyranosid (IPTG) und das weitere Wachstum der Kultur bei 37 Grad für 5 bis 6 Stunden unter Rühren bei 150 U/min induziert.

Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 6000 U/min für 10 Minuten bei 4 Grad geerntet. Das Zellpellet wurde in Puffer A [25 mM Tris (pH 8,0) und 300 mM NaCl] resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (14, 000 U/min, 50 Min., 4 Grad) abgetrennt und der Überstand auf eine mit Puffer A äquilibrierte Ni-NTA-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina Puffer gewaschen A und die His-markierten Proteine ​​wurden mit Imidazol (250 mM) in Puffer A eluiert. Alle Varianten von BgaA-T wurden mit dem gleichen Verfahren exprimiert und gereinigt. FBXW7 wurde in den Vektor pGEX-4 T-1 mit einem N-terminalen Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag aus dem Vektor pCMV6-Entry-FBXW7 unter Verwendung des Restriktionsenzyms Eco RI subkloniert.

GST-markiertes FBXW7 wurde in E. coli BL21 (DE3)-Zellen nach Induktion der Proteinexpression mit 0,1 mM IPTG und Wachstum bei 30 Grad für 4 Stunden exprimiert. GST-FBXW7 aus E. coli-Rohextrakt wurde mittels Glutathion-Sepharose-Säulenchromatographie (GE HealthCare) gereinigt. Fraktionen, die gereinigte Proteine ​​enthielten, wurden gepoolt und unter Verwendung eines 10-kDa-Molekulargewichts-Cutoff-Filters (Amicon) durch Zentrifugation bei 4700 U/min bei 4 Grad auf bis zu 0,5 mg/ml konzentriert. Die Reinheit der Proteine ​​wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und anschließender Färbung mit Coomassie-Blau überprüft.

Wirtszelltransfektionen

BgaA-T wurde mit einem Infusionsklonierungskit (Takara) in den Doxycyclin-induzierbaren Vektor pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgen-Nr. 130261) kloniert. Ein positiver Klon wurde durch Sanger-Sequenzierung bestätigt. Die FBXW7R505C-Mutation wurde durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von pMRX-GFP-FBXW7 als Matrize durchgeführt und durch Sanger-Sequenzierung bestätigt. Alle Transfektionen wurden mit dem Reagenz Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt und die Selektionen erfolgten in Gegenwart von Blasticidinhydrochlorid (2 ug/ml; HiMedia).

siRNA-gesteuerter Gen-Knockdown

Für den durch RNA-Interferenz vermittelten Abbau spezifischer Gene wurden die folgenden siRNAs verwendet: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) und siGSK3 (Dharmacon ONTARGET). SMARTpool L-003010-00-0005). Kurz gesagt, A549-Zellen, die in einer 24--Wellplatte gezüchtet wurden, wurden vorübergehend mit genspezifischen siRNAs oder Scramble (siControl) (150 pmol) unter Verwendung von Lipofectamine 3000 gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen für Western Blot und Immunfluoreszenz- oder Penicillin-Gentamycin-Schutztests verarbeitet.

Strukturvorhersage und Modellierung

Alle Strukturen wurden von AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) vorhergesagt und mit PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC) visualisiert. Strukturen wurden in PyMol basierend auf IUPred (54)-Scores farbcodiert, die von geordnet (blau) über ungeordnet (rot) bis hin zu Weiß reichten.

Western Blot

SPN-Kulturen, die auf {{0}},4 OD600 nm gezüchtet wurden, wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert und Rohextrakte wurden nach Zentrifugation (15,000 U/min, 30 Min., 4 Grad) gesammelt. Für A549s wurden Monoschichten mehrmals mit PBS gewaschen und in eiskaltem Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer [50 mM Tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1 Prozent Triton X-100, 0,5 Prozent Natrium lysiert Desoxycholat und 1 Prozent SDS] mit Proteaseinhibitor-Cocktail (Promega), Natriumfluorid (10 mM) und EDTA (5 mM). Die Zellsuspension wurde kurz beschallt und zentrifugiert, um Zelllysate zu sammeln. In Bakterien- oder A549-Zelllysaten vorhandene Proteine ​​(10 oder 20 µg) wurden auf 12-prozentigen SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und auf eine aktivierte Polyvinylidendifluoridmembran übertragen. Nach der Blockierung in 5-prozentiger Magermilch wurden die Membranen mit geeigneten Primär- und HRP-markierten Sekundärantikörpern sondiert. Die Blots wurden schließlich unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenzsubstrats (Bio-Rad) entwickelt.
Penicillin-Gentamicin-Schutztest

SPN-Stämme, die bis OD600nm 0,4 in Todd-Hewitt-Brühe, ergänzt mit 0,2 Prozent Hefeextrakt (THY), gezüchtet wurden, wurden pelletiert und in PBS resuspendiert ( pH 7,4) und in Testmedium zur Infektion von A549-Monoschichten mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 verdünnt. Nach einer Stunde Infektion wurden die Monoschichten mit DMEM gewaschen und mit einem Testmedium inkubiert, das Penicillin (10 μg/ml) enthielt ) und Gentamicin (400 ug/ml) für 2 Stunden, um extrazelluläres SPN abzutöten. Anschließend wurden die Zellen mit 0,025 Prozent Triton X-100 lysiert und das Lysat auf Brain Heart Infusion-Agarplatten ausplattiert, um lebensfähige SPN zu zählen. Die prozentuale Invasion wurde als [koloniebildende Einheiten (KBE) im für die Infektion verwendeten Lysat/KBE] × 100 berechnet. Um das intrazelluläre Überleben zu beurteilen, wurden 9 Stunden nach der Infektion (ab Beginn der Penicillin-Gentamycin-Behandlung) Zelllysate wie folgt hergestellt oben erwähnt, und die ausgebreiteten und überlebenden Bakterien wurden gezählt. Die Überlebenseffizienz (Prozent) wurde als fache Änderung der prozentualen Überlebensrate im Vergleich zur Kontrolle zum angegebenen Zeitpunkt (normalisiert auf 0 Stunden) dargestellt.

Immunfluoreszenz

Für den Immunfluoreszenztest wurden A549- oder HeLa-Zellen auf Glasdeckgläsern gezüchtet und 1 Stunde lang mit SPN- oder STm-Stämmen bei einer MOI von ~25 infiziert, gefolgt von einer Antibiotikabehandlung für 2 Stunden. Zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion (9 Stunden für die SPN-Infektion bei A549s und 3 Stunden für die Infektion mit STm bei HeLa) wurden die Zellen mit DMEM gewaschen und mit eisgekühltem Methanol bei –20 Grad für 10 Minuten fixiert. Darüber hinaus wurden die Deckgläser mit 3 Prozent Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Die Zellen wurden dann über Nacht bei 4 Grad mit einem geeigneten Primärantikörper in 1 Prozent BSA in PBS behandelt, mit PBS gewaschen und mit einem geeigneten Sekundärantikörper in 1 Prozent BSA in PBS 1 Stunde bei RT inkubiert. Zuletzt wurden die Deckgläser mit PBS gewaschen und zusammen mit VECTASHIELD mit oder ohne 4‘-6-Diamidino-2-phenylindol (Vector Laboratories) auf Glasobjektträger montiert, um sie mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 780, Carl Zeiss) sichtbar zu machen ) unter 40× oder 63× Ölobjektiven. Die Bilder wurden nach dem optischen Schnitt aufgenommen und dann mit der ZEN lite-Software (Version 5.0) verarbeitet. Die hochauflösende Mikroskopie wurde in ähnlicher Weise mit Elyra 7 (Carl Zeiss) im SIM-Modus durchgeführt. Für die Kolokalisierungsanalyse wurden die Bakterien durch visuelle Zählung von n > 100 Bakterien pro Replikat bewertet.

Transmissionselektronenmikroskopie

Nach der Infektion mit SPN und STm wurden die Zellen mit {{0}},1 M Natriumkakodylatpuffer gewaschen und mit 2,5 Prozent Glutaraldehyd (Sigma-Aldrich) in 0,1 M Natriumkakodylatpuffer fixiert ( Sigma-Aldrich) für 3 Stunden bei 4 Grad. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit einem Zellschaber gesammelt und 10 Minuten lang bei 2 {15}}00 U/min pelletiert. Die Zellen wurden dann mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer gewaschen und mit 1 Prozent Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für 20 Minuten bei 4 Grad nachfixiert. Nach anschließenden Wäschen mit Cacodylatpuffer und destilliertem Wasser wurden die Zellen dann 30 Minuten lang in steigenden Konzentrationen von Ethanol (50, 70, 95 und 100 Prozent) und Propylenoxid dehydriert und schließlich in Epoxidharz (Electron Microscopy Sciences, 14300) eingebettet Polymerisation bei 75 Grad für 45 Minuten. Anschließend wurden die Kapseln für 45 Minuten in einen 95-Grad-Ofen gegeben. Ultradünne Schnitte (70 nm) wurden mit einem Diamantmesser auf einem Leica EM UC7 Ultramikrotom geschnitten, mit 2 Prozent Uranylacetat und 1 Prozent Bleicitrat gefärbt und mit einem Transmissionselektronenmikroskop (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) bei 120 KV betrachtet.

Ex-vivo-Ubiquitinierung

A549-, das BgaA-T und seine Varianten exprimiert, wurde mit MG132 (5 μM) behandelt und die Proteinexpression wurde 24 Stunden lang mit Doxycyclin (100 μg/ml) induziert. Die Zellen wurden dann in RIPA-Puffer lysiert und die Proben wurden mittels SDS-PAGE (8 Prozent) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Bestätigung der Proteinexpression und Ubiquitinierung von BgaA-T und seinen Varianten wurde durch Western Blot nach Sondierung mit Anti-BgaA- bzw. Anti-K{10}}Ub-Antikörpern nachgewiesen.

In-vitro-Ubiquitinierung

Für In-vitro-Ubiquitinierungstests wurden rekombinante Proteine ​​wie zuvor beschrieben gereinigt (58). Der SCFFBW7-E3-Ligasekomplex wurde mit rekombinantem 0,1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0,25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) und Ubiquitin (2,5 ug/ml; Boston) inkubiert Biochem) in Gegenwart von gereinigtem BgaA-T und seinen Varianten. Ubiquitylierungsreaktionen wurden in Testpuffer [50 mM Tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM Adenosintriphosphat (ATP), 1 mM -Mercaptoethanol und 0,1 Prozent Tween 20] für 2 Stunden bei 25 Grad durchgeführt . Die Reaktionen wurden mit 5× Laemmli-Puffer gestoppt, auf SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und durch Immunblotting unter Verwendung eines Anti-BgaA-Antikörpers analysiert.

In-vitro-Kinase-Assay

Zur Durchführung des In-vitro-Kinase-Assays wurde das GSK3-Kinase-Enzymsystem (Promega) gemäß dem Protokoll des Herstellers mit den folgenden Modifikationen verwendet. Kurz gesagt, 3 μg rekombinantes BgaA-T wurden zu 0,5 μg aktivem GSK3 mit 400 μM ATP in Reaktionspuffer hinzugefügt, der aus 40 mM Tris (pH 7,5) und 20 mM MgCl2 bestand , BSA (0,1 mg/ml) und 50 μM Dithiothreitol. Die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei 30 Grad inkubiert und durch Zugabe von 1× Laemmli-Puffer gestoppt. Die Proben wurden dann wie zuvor erwähnt gekocht und für den Western-Blot einer Elektrophorese unterzogen. Phosphoryliertes BgaA-T wurde mit einem Anti-Phosphothreonin-Antikörper nachgewiesen.

In-vivo-Modell

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 Prozent Ausgangskörpergewicht und ausgeprägter Nasen- oder Augenausfluss. Blutproben wurden durch Herzpunktion unter Endanästhesie entnommen und die Milzen wurden postmortal zur Bakterienzählung herausgeschnitten. Gewebeproben wurden mit einem handgehaltenen Gewebehomogenisator verarbeitet und Homogenate wurden seriell in PBS verdünnt, bevor sie auf Blutagarplatten aufgetragen wurden. Die Platten wurden über Nacht bei 37 Grad und 5 Prozent CO2 inkubiert und die Anzahl der Bakterienkolonien wurde am folgenden Tag bestimmt.

statistische Analyse

Für die statistische Analyse wurde GraphPad Prism Version 5 verwendet. Die für die einzelnen Experimente durchgeführten statistischen Untersuchungen sind in den jeweiligen Abbildungslegenden aufgeführt. P < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Daten wurden auf Normalität getestet und um die Varianz jeder getesteten Gruppe zu definieren. Alle Multiparameteranalysen umfassten Korrekturen für mehrere Vergleiche und die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt, sofern nicht anders angegeben.

REFERENZEN UND ANMERKUNGEN

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