Ein Oenothera Biennis-Zellkulturextrakt, der mit Anti-Aging-Wirkung für die Haut ausgestattet ist, verbessert die mechanischen Eigenschaften der Zellen

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Abstrakt:Die Hautalterung ist ein sehr bekannter Prozess, der eine allmähliche Verschlechterung der mechanischen Eigenschaften der Haut aufgrund einer Abnahme der Produktion der extrazellulären Matrixmaschinerie und einer gleichzeitigen Veränderung des Kontraktionsprozesses bewirkt. Um dieses Fortschreiten zu verlangsamen, ist es entscheidend, die Expression mehrerer Proteine ​​zu induzieren, die in der Lage sind, die Bildung elastischer Fasern und die Gewebereparatur zu fördern. Dabei wurde der wässrige Zellkulturextrakt von Oenothera bi-Ennis aus chemischer Sicht untersucht und anschließend in vitro, in der Zelle und in ex vivo-Experimenten als Adjuvans gegen Hautalterung getestet zeigten, dass der Extrakt von Oenothera biennis durch Erhöhung der MYLK-Genexpression in der Lage war, die Kollagenkontraktion der Matrix, die Aktinpolymerisation und die Produktion von essentiellen ECM-Proteinen zu fördern.

Schlüsselwörter:Metabolomik; molekulare Netzwerke; hydrophiler Extrakt aus Zellkulturen von Oenothera biennis; Matrixkollagenkontraktion; Hautalterung

1. Einleitung

Die Hautalterung ist ein sehr bekannter Prozess, der durch endogene und exogene Faktoren induziert wird. Während der Seneszenz degenerieren alle kutanen physiologischen Funktionen unaufhaltsam, und diese fortschreitende Verschlechterung schädigt die Haut [1]. Tatsächlich verliert die Haut allmählich ihre mechanischen Eigenschaften, was sowohl auf eine Abnahme der Produktion der extrazellulären Matrixproteine ​​als auch auf die gleichzeitige Änderung des Kontraktionsprozesses zurückzuführen ist [2]. Die wichtigsten Bestandteile der extrazellulären Matrix der Dermis sind Proteine ​​wie Kollagen I und IIl, Laminin, Periostin, Tenascin, Elastin, Fibronektin und Proteoglykane, da ihre relative Menge und ihr Faltungszustand eine Schlüsselrolle bei der Wechselwirkung zwischen den Zellen und der Haut spielen Matrix, die die richtige Textur der Dermis garantiert [3]. Beispielsweise spielt Fibronektin im extrazellulären Raum eine Schlüsselrolle beim Matrixaufbau, da es eine Brücke zwischen Zelloberflächenrezeptoren (z. B. Integrinen) und Kollagen, Proteoglykanen und anderen fokalen Adhäsionsmolekülen bildet. Laminine tragen zur Struktur der extrazellulären Matrix bei und modulieren Adhäsion, Differenzierung, Migration, Stabilität des Phänotyps und Resistenz gegen Apoptose. Elastin ist auch wichtig für die Zelladhäsion und Zellmigration und hat die Fähigkeit, an der Zellsignalisierung teilzunehmen. Fibrillin interagiert in ähnlicher Weise eng mit Tropoelastin und Integrinen und sie sind wichtig für den Zusammenbau von Elastinen zu elastischen Fasern. Fabulous ist eng mit Basalmembranen, elastischen Fasern und anderen Komponenten der extrazellulären Matrix verbunden und an der Bildung elastischer Fasern beteiligt. Tenascine sind polymorphe Glykoproteine ​​der extrazellulären Matrix (ECM), die fibrotische Prozesse vermitteln, um eine effektive Gewebereparatur zu ermöglichen. Sie sorgen für die richtige Spannung der Haut und fördern die Kontakte zwischen den Matrixkomponenten, die wiederum für die Kompaktheit, Dichte und Widerstandsfähigkeit der Dermis verantwortlich sind. Die Aktin-Myosin-Maschinerie bildet die Grundlage ihrer zellulären Zytoskelett-Organisation, die mögliche Veränderungen ihrer Form und ihrer Struktur bestimmt. Tatsächlich induziert die Bindung von Aktin und Myosin eine kompaktere Zellkonformation, bringt die Fasern näher zusammen, garantiert die Entwicklung von gesundem und kompaktem Gewebe und verhindert Faserzerfall, der zu Falten führt. Die Fähigkeit der Fibroblasten, sich zusammenzuziehen und zu dehnen, geht jedoch teilweise über Jahre verloren, weil die gealterten Zellen nicht mehr richtig und vollständig arbeiten können. Aufgrund einer geringeren mechanischen Kraft nehmen Fibroblasten eine rundere und verzerrte Morphologie an als die längliche [5]. Einige Hinweise deuten darauf hin, dass während des Alterns die Synthese eines Proteins namens MYLK (Myosin Light Chain Kinase) signifikant abnimmt. MYLK besitzt eine Kinaseaktivität, die durch die Phosphorylierung einer spezifischen Myosindomäne ausgeübt wird, die als regulatorische leichte Kette von Myosin bezeichnet wird und in der Lage ist, die Aktinbindung zu induzieren und somit die Zellkontraktilität zu fördern [6].BioflavonoideWenn eine geringe Aktivität dieses Proteins festgestellt wurde, beispielsweise aufgrund einer geringeren Proteinexpression, wurde eine entsprechende Verringerung der Matrixkollagenkontraktion [7] und der Aktinpolymerisation [8] gemessen. Der Zusammenbau des Aktin-Zytoskeletts ist nicht nur mit der Zellbewegung und der Fähigkeit zur Kontraktion verbunden, sondern auch mit der Produktion von ECM-Matrixprotein durch die Aktivierung des TGF-II-Rezeptors (TGFBRII)[9]. TGFBRII gehört zum TGF-Zelloberflächenrezeptorkomplex, der durch die Aktivierung von Smad-Transkriptionsfaktoren die Expression vieler Gene reguliert, die Komponenten der ECM codieren, darunter Kollagen, Laminine, Fibronektin und Proteoglykan [10]. Der Abbau des Aktin-Zytoskeletts reguliert den TGF-II-Rezeptor herunter. Diese Herunterregulierung verringert wiederum die Produktion von Kollagen und anderen ECM-Proteinen, was zu einem Verlust der Hautmasse und Hautbrüchigkeit führt.

Tatsächlich zielen viele kosmetische Inhaltsstoffe darauf ab, die Synthese mehrerer Schlüsselfaktoren zu stimulieren, die für die Aufrechterhaltung der korrekten Kompaktheit der dermalen Matrix und einer guten Hautkontraktion verantwortlich sind. In diesem Szenario sind die Extrakte aus der Art Oenothera biennis (Nachtkerze), die zur Familie der Onagraceae gehört, aufgrund ihres Gehalts an bioaktiven Verbindungen wie Fettsäuren, Phenolen, Triterpenen und Flavonoiden von großem Interesse in der Behandlung verschiedener pathologischer Hauterkrankungen getestet [11]. Von einigen dieser Metaboliten wiederum wird berichtet, dass sie Entzündungsmediatoren wie Interleukin 1 (IL-1), Interleukin 6 (IL-6), Zytokine und den Tumornekrosefaktor (TNF-) unterdrücken[12 ]. Darüber hinaus schützten Extrakte aus oberirdischen Teilen von Oenothera biennis HaCaT-Zellen vor H, O,-induzierten DNA-Schäden und Zelltod, indem sie Zellschäden aufgrund von oxidativem Stress durch einen Mechanismus blockierten, der die ROS-Eliminierung und den Nrf2/HO-1-Signalweg beinhaltete [ 13]. Darüber hinaus wurde Oenothera biennis-Öl, das reich an Lipiden ist, aufgrund seiner Fähigkeit, leicht in die Haut einzudringen, als guter Feuchtigkeitsspender für Ekzempatienten vorgeschlagen [14]. Extraktzubereitungen aus Kulturpflanzen, die in der Kosmetik eingesetzt werden, können leider einige Nachteile aufweisen: Erstens können sie mit toxischen oder allergenen Stoffen wie Pestiziden, Düngemitteln oder Schadstoffen verunreinigt sein; dann sind die Pflanzen unvorhersehbarem Stress und saisonalen Bedingungen oder Schwankungen in der Nährstoffverfügbarkeit ausgesetzt, die die Synthese unerwarteter Metaboliten induzieren können. Außerdem können die Extrakte pathogene Mikroorganismen enthalten, die die Qualität der Endprodukte mindern. All diese Nachteile laufen wiederum auf das Risiko eines variablen Gehalts an sekundären Metaboliten und einer geringen Reproduzierbarkeit hinaus. Um diese Schwächen zu überwinden, wird die Verwendung von Pflanzenzellkulturen in der Kosmetik immer beliebter und sehr geschätzt, da sie viele der oben genannten Nachteile überwindet [15].

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In dieser Studie wurde ein hydrophiler Extrakt aus Zellkulturen von Oenothera biennis (ObHEx) vollständig durch fortschrittliche massenspektrometriebasierte Ansätze charakterisiert, unterstützt durch Bioinformatik, und in mehreren biochemischen und biologischen Assays getestet. Die Mischung enthält bioaktive Verbindungen hauptsächlich aus Lignanen und Triterpenen wie Arjunol- und Asiatsäure, die zuvor mit der Produktion von Pro-Kollagen I in menschlichen Fibroblasten in Verbindung gebracht wurde [16,17]. Der Extrakt wurde auf seine Fähigkeit untersucht, die Expression von MYLK zu erhöhen, die Matrixkollagenkontraktion, die Aktinpolymerisation und die Produktion von TGF-regulierten ECM-Proteinen zu fördern, die die Kontraktion der Dermis begünstigen und so die Hautalterung verlangsamen.

2. Ergebnisse

2.1. Qualitative und quantitative Analyse des wasserlöslichen Extrakts der Zellkultur von Oenothera biennis

Es wurde eine UPLC-MS/MS-Analyse von ObHEx durchgeführt und hochauflösende spektrometrische Daten wurden für die chemische Charakterisierung mit Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), einem webbasierten Massenspektrometriesystem, das bei der Identifizierung und Annotation von Naturstoffen hilft, genutzt (NPS)[18]. Es zielt darauf ab, eine Open-Access-Wissensdatenbank für gemeinschaftsweite Organisationen und für den Austausch von rohen, verarbeiteten oder kommentierten Fragmentierungs-Massenspektrometriedaten (MS/MS) zu sein. Insbesondere wurden GNPS-Spektrenbibliothekssuchen und ein Feature-Based Molecular Networking (FBMN)-Job durchgeführt: Die erste Analyse ermöglichte es uns, natürliche Verbindungen zu identifizieren, indem wir ihre MS/MS-Spektren mit denen von strukturell charakterisierten Metaboliten verglichen, die zweite gruppenbezogene NPs innerhalb eines Netzwerks, da ähnliche MS/MS-Fragmentierungsmuster von strukturell ähnlichen Molekülen gezeigt wurden [19]. Wie in Abbildung 1 und Tabelle 1 gezeigt, wurden viele NPS zweifellos als zu mehreren Klassen sekundärer Metaboliten gehörend identifiziert, hauptsächlich Lignane (Salvador aside und Liriodendron) und Triterpene (Muriatsäure, Ariunolsäure, Asiatsäure und Hederagenin). Von GNPS nicht identifizierte chemische Spezies wurden entsprechend der Literatur zugeordnet.

Als Beispiel für die Verwendung von GNPS wurde das aus der FBMN-Analyse abgeleitete Netzwerk in Abbildung 2a dargestellt, das zeigt, dass ObHEx viele andere nicht charakterisierte Triterpene enthielt, die mit Salzsäure verwandt sind (18, m/z 503,3389, RT 21,89 min: Salzsäureidentifikation hat wurde durch einen Vergleich mit seinem analytischen Standard bestätigt). Beispielsweise wurden verschiedene zuvor nicht charakterisierte Spezies bei m/z 701 und 665 als glykosylierte Formen identifiziert, die mit Salzsäure oder ihren Isomeren verwandt sind, jeweils hydratisiert oder nicht mit zwei Molekülen HO

Darüber hinaus stammen die berichteten Ionen bei m/z 729, 703, 699,687,685, 683 jeweils aus der Glykosylierung plus zwei Moleküle H, O von Spezies bei m/z 531, 505,501, 489,487 und 485: ihre eindeutige Identifizierung wurde nicht erreicht, aber sie alle sollen Triterpene sein, die aufgrund ihres MSMS-Fragmentierungsweges mit Salzsäure oder ihren Kongeneren verwandt sind. Kürzlich wurden viele Triterpene mit m/501 und 485 aus einer anderen Art von Oenothera, Oenothera Maritima, isoliert und ihre Struktur hat wurden anhand spektroskopischer Daten aufgeklärt und korrelieren somit gut mit unseren Ergebnissen [20].

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Die FBMN-Analyse lieferte auch Informationen zu den Metaboliten bei m/z 617,3862 (MS2-Ionen bei m/z 453,145 und 119), die in den in Abbildung 2b gezeigten molekularen Netzwerken vorhanden sind und in der Literatur für Oenothera-Spezies nicht berichtet wurden. Dieser m/z-Wert und seine Fragmentierung stimmen mit 2-OEp-Cumaroylapostolsäure oder ihren Isomeren überein, was zumindest das Vorhandensein von Triterpen-Cumaroyl- und auch Caffeoylestern im Extrakt beweist. Tatsächlich zeigten MS-Spektren von Spezies bei m/z 649 (RT 25,72 und 27,19) das Vorhandensein von Ionen bei m/z 179, 161 und 135 aufgrund der Spaltung der Kaffeesäureeinheit, während die MS2-Spektren der anderen Spezies die in Abbildung 2b bei m/z 633 (RT 26,88, 27,20, 28,12 und 28,43), 649 (RT 24,18, 24,65, 24,83) und 661 (RT 30,28) berichtet wurden, zeigten Ionen bei m/z 145 und 119, die charakteristisch waren für die Cumaroyleinheit.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911) innerhalb der getesteten Bereiche. Darüber hinaus zeigten die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOO), dass sich die verwendeten Methoden durch eine hohe Sensitivität auszeichneten. Die erhaltenen Ergebnisse aus der quantitativen Analyse (Tabelle 3) zeigten, dass Liriodendron und Hederagenin die am häufigsten vertretenen Lignane bzw. Triterpene waren.

2.3. Analyse der MYLK-Genexpression in HDF

Die Aktivität von ObHEx wurde in HDF auf die Expression des MYLK-Gens getestet, das für die Kinase kodiert, die für die Phosphorylierung der leichten Kette von Myosin verantwortlich ist (Abbildung 3a). Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit dem Extrakt in beiden Konzentrationen die MYLK-Genexpression um etwa 50 Prozent erhöhte, ähnlich wie bei der Positivkontrolle TGF-.

2.4. Analyse der Kontraktionsfähigkeit einer Kollagenmatrix

Um die Aktivität von ObHEx auf die Kontraktionsfähigkeit von Kollagenfasern zu bewerten, haben wir HDF verwendet, das in Kollagengelscheiben dispergiert ist [21]. Wie in Abbildung 3b gezeigt, induzierte der Extrakt bei der niedrigeren Konzentration eine signifikante Zunahme der Kontraktion der Kollagenscheibe, was auf eine mögliche Wirkung auf die Kollagenfestigkeit hindeutet. Die Behandlung mit ML7(1-(5-Iodonaphthalin-1-sulfonyl)-1H-Hexahydro-1,4-Diazepin), einem MYLK-Hemmer, hob diese Erhöhung auf, was darauf hinweist, dass sowohl der Extrakt als auch TGF – durch MYLK auf die Kontraktion der Kollagenscheibe wirken.

2.5. Messung des Aktin-Polymerisationsgrads

Die Fähigkeit von ObHEx, die Aktinpolymerisation zu stimulieren, wurde untersucht, indem der Gehalt an polymerisiertem Aktin in den Zellen gemessen wurde, die mit dem Extrakt und der Positivkontrolle TGF – allein und in Gegenwart von ML7 behandelt wurden. Wie in Fig. 3c gezeigt, ergab die Behandlung mit beiden Konzentrationen der Extrakte eine Erhöhung der Menge an polymerem Aktin um etwa 50 Prozent, verglichen mit 33 Prozent TGF-.Cistanche kaufenAuch hier beseitigte die Vorinkubation mit ML7com diesen Effekt vollständig, was auf die Beteiligung von MYLK an der Polymerisation von Aktinfilamenten hindeutet.

2.6. Analyse des TGF RII/SMAD-Signalwegs in HDF

Um zu überprüfen, ob die Zunahme der Aktinpolymerisation und der Kollagenkontraktion von mit ObHEx behandelten Zellen auch mit einer Aktivierung des durch TGF RII vermittelten Signaltransduktionswegs assoziiert war, beobachteten wir zunächst die Expression des TGF RII-Gens und transfizierten dann HDF mit dem SMAD{{ 0}}Luciferase-Reporterplasmid und bewertete die Zunahme der Luciferase-Aktivität als Reaktion auf die ObHEx-Behandlung. Die in Abbildung 3d, e dargestellten Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit ObHEx bei 0,002 Prozent und 0,006 Prozent die Expression von TGF RII in ähnlicher Weise wie bei TGF-RII erhöhte, das als positive Kontrolle verwendet wurde, und parallel dazu Die mit SMAD verbundene Luciferase-Aktivität wurde um 80 bzw. 40 Prozent erhöht. Eine signifikante Signalreduktion wurde erhalten, wenn die Zellen mit ML7 behandelt wurden, was auch zeigt, dass diese Aktivität mit MYLK verbunden war.

2.7. Analyse von Pro-Kollagen I, Tropoelastin und Periostin

Als Folge der TGF-RII-Signaltransduktionsaktivierung analysierten wir die Synthese der wichtigsten extrazellulären Matrixproteine ​​wie Prokollagen Typ I, Tropoelastin und Periostin in HDF, das mit ObHEx bei 0,002 Prozent behandelt wurde. Wie in Fig. 3f gezeigt, steigerte ObHEx die Produktion der angegebenen Proteine ​​um etwa 98 Prozent, 75 Prozent bzw. 51 Prozent, ähnlich wie die Positivkontrolle TGF-. Die Messungen wurden mittels ELISA-Assay durchgeführt, wobei spezifische Antikörper gegen Prokollagen I, Tropoelastin und Periostin verwendet wurden.

2.8. Analyse von MYLK, Phospho-Myosin, Collagen I und Tropoelastin auf Ex-vivo-Hautexplantaten

Wie in Abbildung 4a-c gezeigt, führte ObHEx zu einer signifikanten Steigerung der Produktion von MYLK und phosphoryliertem Myosin in menschlichen Hautexplantaten.

Die Kollagen-I- und Tropoelastin-Induktion wurde auch in Hautexplantaten analysiert, die mit ObHEx vorbehandelt und dann 8 Tage lang mit Hydrocortison behandelt wurden, um die chronologische Alterung zu simulieren [22]. Die Behandlung mit Hydrocortison reduzierte die Menge an Kollagen I und Tropoelastin um mehr als 10 %, und die Anwesenheit von 0,002 % ObHEx stellte die Menge an Tropoelastin um fast 91 % und die Menge an Kollagen um 120 % wieder her, verglichen mit der Ascorbat als Positivkontrolle verwendet (Abbildung 4d-f). Dies deutet auf eine potenzielle Anti-Aging-Wirkung von ObHEx hin, die besonders wirksam bei der Erhöhung der Festigkeit der Haut ist, indem sie auf die dermalen Matrixkomponenten einwirkt.

2.9. Rasterkraftmikroskopie (AFM) in Hautexplantaten

Um mehr Informationen über die biomechanischen Eigenschaften der Haut zu sammeln, die durch die Behandlung mit ObHEx gefördert werden, haben wir die Elastizität, eine intrinsische mechanische Eigenschaft von Hautproben, in Bezug auf ihre Elastizitätsmodule bewertet [23]. Wie in Abschnitt 4 beschrieben, haben wir zur Berechnung des Elastizitätsmoduls sowohl an behandelten als auch an unbehandelten Hautproben Kraftkurven mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) gesammelt und sie mit dem Hertz-Modell angepasst [24,25]. Wie in Fig. 5 gezeigt, hatte die Behandlung der Hautproben mit dem Extrakt im Vergleich zu unbehandelten Proben niedrigere Young-Modul-Werte, was auf eine Verbesserung der Hautelastizitätseigenschaften hindeutet. Insbesondere zeigten unbehandelte Hautproben einen mittleren Wert des Elastizitätsmoduls von 0.37±0.15 GPa, während mit ObHEx behandelte Hautproben einen niedrigeren Mittelwert von 0 aufwiesen.{{11 }}7 ± 0,02 GPA. Die Elastizitätsmodulwerte der Hautproben entsprachen der Literatur [26-28].

3. Diskussion

Pflanzenzellkulturen stellen den vielversprechendsten Ansatz für die nachhaltige Produktion von pflanzlichen Sekundärmetaboliten von kommerziellem Interesse dar, bieten eine kontinuierliche Materialversorgung durch groß angelegte Kultur und bilden ein nachhaltiges und umweltfreundliches System [29,30]. Extrakte aus Pflanzenzellkulturen haben vielversprechende Anwendungen im Gesundheits- und Kosmetiksektor gefunden, da sie einige relevante Vorteile aufweisen; (i) sie enthalten Metaboliten, die unter Laborbedingungen mit kontrolliertem Wachstum biosynthetisiert wurden; (i) sie stammen aus standardisierten Produktionsprozessen, die die dieselben qualitativen und quantitativen Eigenschaften der erhaltenen Arten; (ii) die Extrakte sind frei von Verunreinigungen wie Mikroorganismen, Herbiziden, Pestiziden und Fungiziden; (iv) sie sind unabhängig von geografischen oder umweltbedingten Schwankungen und die Pflanzenart kann für die Zukunft konserviert werden Generationen. In diesem Wettbewerb wurde ein wässriger Zellkulturextrakt von Oenothera biennis (ObHEx) als vielversprechende Quelle für bioaktive Moleküle mit Anti-Aging-Wirkung für die Haut untersucht. Tatsächlich wurde ObHEx durch hochauflösende UPLC-MSMS-Analysen in Verbindung mit bioinformatischen Ansätzen untersucht, um eine breite strukturelle Charakterisierung zu erreichen. Die Charakterisierung von Verbindungen wurde hauptsächlich durch die Verwendung von GNPS realisiert, um den Identifizierungsprozess zu beschleunigen, die MS/MS-Spektren mit denen von strukturell charakterisierten Metaboliten zu vergleichen und darüber hinaus neue unerwartete Spezies aufzudecken, indem ähnliche NPs innerhalb eines Netzwerks gruppiert werden. Darüber hinaus wurden auch Retentionszeit, genaue Massenmessungen und MS2-Analysen mit denen von Standards verglichen, und alle Daten wurden mit der Literatur abgeglichen. Bioaktive Lignane und Triterpene wie Salvador Aside, Liriodendron, My-Anthemic-Säure, Arjunolsäure, Asiatische Säure und Hederagenin wurden identifiziert. Liriodendron [31] und Salzsäure [32] zeigten eine starke antioxidative Aktivität, während Hederagenin aufgrund einer Verringerung der zellulären Oxidation und der Aktivierung der Proteasomfunktion Anti-Aging-Eigenschaften der Haut zeigte [33]. Arjunol- und asiatische Säuren wurden jedoch als hauptverantwortlich für einige der folgenden getesteten Aktivitäten angesehen, da sie die Collagen-I-Synthese stimulieren. Tatsächlich wurde gezeigt, dass ObHEx die biomechanischen Eigenschaften der Haut verbessert, die hauptsächlich von der relativen Menge der verschiedenen Komponenten der ECM abhängen und davon, wie die Fibroblasten in der Lage sind, sich zusammenzuziehen und den Hautfasern die richtige Spannung zu verleihen.ZistanchTatsächlich fördert ObHEx die Kontraktion der Kollagenmatrix und die Aktinpolymerisation, indem es die Expression des MYLK-Gens erhöht und die Kontraktionskraft der Hautfibroblasten verstärkt. Der Aufbau des Aktin-Zytoskeletts reguliert den TGF-Typ-II-Rezeptor hoch und erhöht im Einklang mit der Stimulation der TGF-/Smad-Signalgebung die Spiegel der TGF-regulierten ECM-Proteine. Tatsächlich induziert ObHEx die Produktion von Kollagen Typ I, Periostin und Tropoelastin. All diese Eigenschaften machen es daher zu einem vielversprechenden Kandidaten für den Einsatz in kosmetischen Formulierungen, um den altersbedingten Verlust der Hautfestigkeit und -elastizität zu bekämpfen. Diese Annahme wurde durch die in der AFM-Analyse erhaltenen Ergebnisse gestützt, die zeigten, dass die Behandlung von Hautscheiben mit ObHEx eine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften der Haut bewirkte, die als Abnahme des Elastizitätsmoduls nachgewiesen wurde, was auf eine signifikante Verringerung der Hautsteifheit und -starrheit hinweist.

4. Materialien und Methoden

4.1.Pflanzengewebekulturen und Extraktherstellung

Oenothera biennis-Pflanzen wurden von GEEL Floricultura ss bereitgestellt und waren italienischen Ursprungs (unter Vermeidung der Anwendung des Nagoya-Protokolls). Zellkulturen wurden aus Blättern von Oenothera biennis-Pflanzen erhalten, indem die Proliferation von meristematischen Zellen auf festen Agarplatten induziert wurde, bis Callusse erhalten wurden. Die Zellen wurden in das flüssige Wachstumsmedium (Gamborg B5, ergänzt mit 24 Dichlorphenoxyessigsäure (1 mg/l), Adenin (1 mg/l) und Kinetin (0,01 mg/l)) überführt wurden die Zellen als Suspensionskulturen unter orbitalem Schütteln gezüchtet. Sobald die Kulturen von etwa 150 g/l erhalten waren, wurden die Zellen gesammelt und in einem Phosphatpuffer (PBS) bei pH 7,4 lysiert, um einen wasserlöslichen Extrakt herzustellen, der lyophilisiert wurde. Das Pulver wurde in Wasser oder Zellkulturmedien in den geeigneten Konzentrationen zum Testen gelöst.

4.2. UPLC-MSMS-Analyse zur chemischen Charakterisierung

ObHEx(5{{10}} mg/ml) wurde hergestellt und einer zweiphasigen Butanol/Wasser-Extraktion unterzogen. Die Butanolfraktion wurde getrocknet und vor der UPLC-MS/MS-Analyse in Methanol (1 0 mg/ml) gelöst. Sie wurde auf einem Massenspektrometer Q-Exactive Classic von Thermo-Scientific (Waltham, MA, USA) durchgeführt, das mit einem Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC-System ausgestattet war. Alle chromatographischen Läufe wurden unter Verwendung einer Phenomenex Luna③C18 100 A （150 × 2,0 mm, Partikelgröße 3 μm）-Säule bei 40 °C und einer Flussrate von 0,200 ml/min durchgeführt. Das Injektionsvolumen betrug 5 μl. Die mobile Phase bestand aus A (Wasser von ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK mit 0,1 Prozent Essigsäure) und B (100 Prozent Acetonitril von ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK) unter Verwendung einer Gradientenelution von 5 Prozent B bei 0-5 Min., 5-14 Prozent B bei 5-8 Min., 14-32 Prozent B bei 8-11 Min., 32-95 Prozent Fledermaus {{ 26}} Min., 95-98 Prozent Bat32-33 Min., 98 Prozent B bei 33-38 Min., 98-5 Prozent Bat38-39 Min. und 5 Prozent B bei { {34}} min. Alle MS- und MSMS-Analysen wurden im negativen ESI-Modus mit einer Mantelgasflussrate von 30 (willkürliche Einheiten), einer Hilfsgasflussrate von 5 (willkürliche Einheiten), einer Sprühspannung von 3,2 kV und einer Kapillartemperatur von und durchgeführt die Zusatzgasheizungstemperatur bei 300 Grad. Die Daten wurden mit einem Full MS/dd-MS2 (Top5)-Modus erfasst. Vollständige MS-Einstellungen waren: die Auflösung von 70.000, AGC-Ziel von 1 × 106, maximale IT von 200 ms und können von 100 bis 800 m/z reichen. dd-MS2-Einstellungen waren: Auflösung von 17.500, AGC-Ziel von 2 × 105, maximal IT von 65 ms, Isolationsfenster von 1,5 m/z und NCE von 35.

wurden manuell verifiziert. mzXML-Daten wurden mit Mzmine 2.53 vor dem Job Feature-Based Molecular Networking (FBMN) auf GNPS verarbeitet. Der Massendetektionsschritt wurde unter Verwendung des Massenschwerpunktdetektors durchgeführt, während der Rauschpegel bei 5 × 1{{10}}3 gehalten wurde. Die Chromatogrammbildung der Automated Data Analysis Pipeline (ADAP) wurde mit folgenden Einstellungen realisiert: min. Gruppengröße in einer Anzahl von Scans von 5, Gruppenintensitätsschwelle von 5 × 1{{20}}³, min. höchste Intensität von 5× 10 plus ,m/z-Toleranz von 0.01 m/z oder 10 ppm. Die Dekonvolution des Chromatogramms wurde unter Verwendung von Wavelets (ADAP) als Algorithmus, S/N-Schwellenwert von 3, minimale Merkmalshöhe von 1 × 105, Koeffizienten-/Flächenschwelle von 5, Spitzendauerbereich von 0 erreicht.{{ 18}}.00 min und RT-Wavelet-Bereich von 0.00-0.05. Chromatogramme wurden unter Verwendung des Isotopenpeaks-Grouper-Algorithmus mit einer m/z-Toleranz von 0,001 m/z oder 5,0 ppm und einer RT-Toleranz von 0,10 min deisotopisiert. Der FBMN-Job wurde unter Verwendung einer Elternmassentoleranz von 0,02 Da und einer MS4-Fragmentionentoleranz von 0,02 Da durchgeführt. Die Kanten wurden so gefiltert, dass sie einen Bewertungsschwellenwert von 0,7 und mindestens 2 übereinstimmende Peaks aufwiesen. Darüber hinaus wurde die maximale Anzahl von Nachbarknoten für jeden Knoten auf 10 festgelegt.

4.4. Quantitative Analyse von Lignanen und Triterpenen

Die gleichen UPLC-Bedingungen, die für die qualitative Analyse berichtet wurden, wurden für die quantitative Analyse von Lignanen verwendet, während sie für die von Triterpenen optimiert wurden, um zwei Isomerenpaare, Arjunolsäure und asiatische Säure, zu trennen. Die Analyse wurde wie zuvor beschrieben auf einem Q-Exactive Classic Massenspektrometer durchgeführt. Die Trennung erfolgte mit einem Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2,1 mm, Partikelgröße 5 μm）. Die mobile Phase bestand aus A (5 mM wässrige Ammoniumacetatlösung, pH 9,00 eingestellt durch Ammoniumhydroxid) und B (100 Prozent Acetonitril) unter Verwendung einer Gradientenelution von 17-28 Prozent B bei 0-18 min, 28-65 Prozent B bei 18-22 min, 65-75 Prozent B bei 22-26 min, 75-95 Prozent bei {{17 }}, 5 Min., 95 Prozent bei 26,5-30 Min., 95-17 Prozent bei 30-30, 1 Min., 17 Prozent bei 30,1-42 Min. Die Flussrate betrug 0,450 ml/min und das Injektionsvolumen betrug 5 &mgr;l. Sowohl für Lignane als auch für Triterpene wurden Daten mit einem vollständigen MS-SIM- und PRM-Modus erfasst. Vollständige MS-SIM-Einstellungen waren: die Auflösung von 70,000, AGC-Ziel von 3×106, maximale IT von 200 ms und kann von 200 bis 800 m/z für Lignane und von 400 bis 850 m/z reichen für Triterpene. PRM-Einstellungen waren: die Auflösung von 70,000, AGC-Ziel von 2×10 Grad, maximale IT von 100 ms, Isolationsfenster von 1,0 m/z und NCE von 35 im Fall von Lignanen und 50 in diesem Fall von Triterpenen.Cistanche AustralienWir kauften Salvador Aside (#{{0}}XS172930) von Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Schweiz), Liriodendron (#SMB00181) und Arjunolsäure (#SMB00119) von Sigma -Aldrich (St. Louis, MO, USA), Asiatische Säure (#0027) von Extrasynthese (Genay, Lyon, Frankreich) und Hederagenin (#89706) von PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Deutschland). Myrianthinsäure war ein Geschenk von Prof. Maria Valeria D'Auria, Universität Neapel. Die Kalibrierungskurven wurden durch Injektion von Standardlösungen im Konzentrationsbereich von 0,25-25 μM für Lignane und 0,1-25 μM für Triterpene erhalten. Sowohl reines Salvador als auch Liriodendron zeigten zwei LC-MSMS-Peaks, wahrscheinlich aufgrund des in der Lösung eingestellten chemischen Gleichgewichts. Die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOO) für Standards wurden auf der Grundlage des Signal-Rausch-Verhältnisses (S/N) bestimmt.

4.5. Hautzellkulturen und Explantate

Humane dermale Fibroblasten (HDF) wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gehalten, das mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ergänzt war ) in 95 Prozent Luft, 5 Prozent CO und befeuchteter Atmosphäre bei 37 Grad. Hautexplantate, die aus der Haut gesunder weiblicher Spender (im Alter von 44-47) im Operationszentrum Villa Cinzia (Neapel, Italien) gewonnen wurden, wurden in 24-Transwell-Platten in DMEM/FBS plus Antibiotika in Luft kultiviert. flüssige Bedingungen bei 37 Grad Grad in5 Prozent CO2 befeuchteter Luft. Alle Spender hatten gemäß der Deklaration von Helsinki ihr schriftliches Einverständnis zur Verwendung der Hautgewebe gegeben.

4.6. Zytotoxizitätstest

Zytotoxizitätstests basierten auf der Verwendung der MTT-Verbindung [{{0}}(45-Dimethylthiazolyl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid][34]. Die Zellen wurden in 96--Well-Platten im DMEM-Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium), ergänzt mit 1 0 Prozent fötalem Rinderserum, für ungefähr 8 Stunden gezüchtet. Nach der Behandlung mit ObHEx zwischen 0.05 Prozent und 0,0004 Prozent (500 ug/ml und 4 ug/ml) für 48 Stunden wurden die Zellen in PBS gewaschen und mit 100 μl/Vertiefung inkubiert "Reaktionspuffer", enthaltend ∶ 10 mM Hepes, 1,3 mM CaCl 2 , 1 mM MgSO, 5 mM Glucose und 0,5 mg/ml kolorimetrisches MTT-Substrat in PBS-Puffer bei pH 7,4. Nach 3-stündiger Inkubation bei 37 Grad C in 5 % CO wurden 100 &mgr;l Solubilisierungslösungen, die 10 % Triton-X100, 0,1 N HCl in absolutem Isopropanol enthielten, zu jeder Vertiefung gegeben. Nach 16 h Inkubation wurde die kolorimetrische Reaktion bei 595 nm mit dem Victor3-Plattenlesegerät (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) gemessen.

4.7. Analyse der Expression des MYLK- und TGF6RII-Gens in HDF

Pro Well wurden 1 × 1 0 Grad HDF in 6- Well-Platten in DMEM mit 2 Prozent FBS gezüchtet, nach 24 h wurde FBS weiter auf 0,5 Prozent verdünnt, und die Zellen wurden mit Konzentrationen von 0,002 Prozent und 0,006 Prozent von ObHEx und TGF- 2,5 ng/ml behandelt, gefolgt von einer Inkubation von 2 Stunden für MYLK und 48 für TGFRII. Für die RNA-Extraktion wurde das von der Firma Merck (Darmstadt, Deutschland) erworbene "GenEluteM Total RNA Purification"-Kit verwendet. Nach den angegebenen Behandlungen wurden die Zellen mit PBS gewaschen, in Lysepuffer gesammelt und dem angegebenen Extraktionsverfahren unterzogen. Die Proben wurden mit DNase I (Ambion, Austin, TX, USA) bei 37 Grad für 30 Minuten behandelt, um die genomische DNA-Verunreinigung zu entfernen. Von jeder Probe wurden 2 &mgr;l auf Gel 1 % Agarose in Gegenwart von denaturierendem Ladefarbstoff zum Zweck der Quantifizierung der RNA-Menge in Bezug auf einen spezifischen Marker für RNA (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) geladen. Als Software für die Quantisierung wurde GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) verwendet. Als nächstes wurden 300 ng Gesamt-RNA unter Verwendung des Enzyms reverse Transkriptase (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) retro-transkribiert. Semiquantitative RT-PCR wurde unter Verwendung des Universalprimerpaars 18S-Primer/Kompetitor (Ambion, Austin, TX, USA) als interne Standards durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5-prozentigem Agarosegel getrennt, unter Verwendung des Reliance-Tools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) betrachtet und durch Densitometrie unter Verwendung der Genetools-Software analysiert. Die Sequenzen der für die Amplifikation verwendeten Primer waren die folgenden: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.

4.8. Analyse der Kontraktionsfähigkeit einer Kollagenmatrix

In Bezug auf HDF-Zellen wurden 2,0× 10 Grad in 5x DMEM-Wachstumsmedium (Gibco, Waltham, MA, USA) in einer 24-Well-Platte resuspendiert und eine 2 mg/ ml Lösung von Kollagen aus Rinderhaut (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde zu jeder Vertiefung gegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7,2 eingestellt. Die Platte wurde 45 min lang bei 37°C inkubiert, um eine Verfestigung des Kollagengels zu ermöglichen. Später wurde DMEM, ergänzt mit 10 Prozent FBS und/oder ML7 25 uM, als MYLK-Protein-Inhibitor hinzugefügt. Nach 16 h wurde ML7 geklärt und ObHExat in einer Konzentration von 0,002 Prozent in DMEM mit 2 Prozent FBS wurde hinzugefügt. TGF- 2,5 ng/ml wurde als positive Kontrolle verwendet. Die gebildete Kollagenscheibe wurde sofort von der Vertiefung gelöst, indem ein steriler Mikrospatel verwendet wurde, um ihre Kontraktion zu fördern. Die Bereiche der Scheibe jeder Behandlung wurden zum Zeitpunkt 0 und 5 h gemessen und unter Verwendung von Image-Software analysiert.

4.9. Analyse des Aktinpolymerisationsgrades

Als nächstes wurden 1,5 × 1 0 Grad HDF-Zellen pro Well in einer 24- Well-Platte gezüchtet und am nächsten Tag wurde das Medium mit 2 Prozent FBS und dem Cytochalasin B, das ein Inhibitor von Aktin ist, versetzt Polymerisation, bei 2 μM für 3{{1{{20}}}} min. Nach 30 Minuten wurde den Zellen ObHEx (0,002 Prozent und 0,006 Prozent) zusammen mit TGF- 2,5 ng/ml als Positivkontrolle und ML7 25μM als Positivkontrolle zugesetzt Negativkontrolle des MYLK-Enzyms. Nach 30 min Behandlung wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in Phosphatpuffer für 30 min auf Eis fixiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit einer Lösung aus Phosphatpuffer und Triton-X100 bei 0,2 Prozent für 30 Minuten permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen mit einer Lösung von 0,4 µM Phalloidin konjugiert mit Rhodamin (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) für 1 h im Dunkeln inkubiert.Cistanche-VorteileZum Zeitpunkt 0 und nach 18 h wurde die Fluoreszenz bei 540/570 nm unter Verwendung des Victor3-Plattenlesegeräts (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) gemessen. 4.10. Analyse des SMAD2-Signalwegs

HDF-Zellen wurden mit einer Dichte von 3 × 10 3 in 96--Well-Platten ausgesät und nach 16 h mit X-tremeGene TM HP-DNA-Transfektionsreagenz (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) mit Smad2-Reportervektor gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen mit ObHEx oder TGF- 2,5 ng/mL allein oder in Kombination mit ML7 25 μM für 24 h behandelt. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und die Aktivität von Luciferase wurde unter Verwendung des SteadyGlo-Luciferase-Testsystems (Promega Corporation, Madison, WI, USA) in dem Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA , VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA).

4.11. Analyse der Synthese von Pro-Kollagen I, Tropoelastin und Periostin

Pro Well wurden 8 × 103 HDF in 96-Well-Platten gezüchtet und mit 0.002 % ObHEx oder TGF 2,5 ng/mL behandelt. Nach 24 h wurden die Zellen für den ELISA unter Verwendung des monoklonalen primären Antikörpers Anti-Prokollagen Typ I (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) verarbeitet, gefolgt von einer Inkubation mit dem markierten sekundären Anti-Maus-Antikörper mit Peroxidase (170-6516, Biorad, Hercules, CA, USA). Die Überstände der Zellen wurden auf eine andere Platte zum Nachweis von Tropoelastin und Periost unter Verwendung des Anti-Tropoelastin-Kaninchen-Antikörpers (ab21600, Abcam, Cambridge, U) oder des Anti-Periostin-Maus-Antikörpers (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology) aufgetragen , Dallas, TX, USA), gefolgt von einer Inkubation mit sekundärem Anti-Kaninchen-Antikörper, markiert mit Peroxidase (170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA）). Die kolorimetrische Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl einer wässrigen Lösung von entwickelt OPD(O-Phenylendiamin), 0,35 mg/ml in 50 mM Citratpuffer und 0,012 Prozent Wasserstoffperoxid (H2O2).Nach 30 min wurde die Extinktion bei 490 nm unter Verwendung des Mehrfachlesers Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA).

4.12. Ex-vivo-Tests

Die Immunhistofluoreszenz (IHF) von MYLK und phosphoryliertem Myosin wurde in Hautexplantaten von {{0}}-jährigen Spendern untersucht. Menschliche Hautexplantate wurden mit Stanzbiopsie-Küretten von 8 mm geschnitten und in 24-Well-Platten in DMEM mit 10 Prozent FBS und Antibiotika kultiviert. Die erhaltenen Stempel wurden mit 0.002 Prozent und 0,006 Prozent ObHEx für 24 Stunden behandelt. Sie wurden in 15 Prozent Saccharose, dann in 30 Prozent Saccharose inkubiert und schließlich eingefroren. Als nächstes wurden 10 &mgr;m-Schnitte unter Verwendung des CM1520-Kryostaten (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) erhalten. Objektträger mit Kryoschnitten wurden für 30 min in PBS hydratisiert und für 1 h in eine "blockierende" Lösung (6 % BSA, 5 % Serum, 20 mM MgCl, 0,2 % Tween) gegeben. Kryoschnitte wurden mit dem primären Anti-MYLK-Kaninchen-Antikörper (1:100, GeneTex, Irvine, CA, USA) und dem primären Anti-Phospho-Myosin-Antikörper (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) für 16 h inkubiert 4 Grad. Die Objektträger wurden 30 min lang mit PBS gewaschen und dann 1 h lang mit dem sekundären Anti-Kaninchen-Antikörper Alexa-Fluor 546 (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) inkubiert. Die Zellkerne wurden mit DAPI(4',6-5-Diamidino-2-phenylindol) 1 ug/ml in PBS für 10 Minuten gefärbt. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und mit der ImageJ-Software analysiert. Für die IHF von Tropoelastin und Kollagen I wurden Hautexplantate von 36--jährigen weiblichen Spendern verwendet. Hautbiopsien wurden wie oben beschrieben erhalten und mit 0,002 % und 0,006 % ObHEx für 24 h vorbehandelt. Stress mit Hydrocortison bei 10 ug/ml für 8 Tage wurde in Gegenwart von ObHEx hinzugefügt. Danach wurden die Biopsien wie oben beschrieben eingefroren und die Schnitte wurden mit dem primären Antikörper Anti-Tropoelastin Kaninchen (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, UK) und Anti-Kollagen I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Deutschland) inkubiert 16h bei 4 Grad . Die Objektträger wurden wie oben beschrieben analysiert, und die Bilder wurden mit der ImageJ-Software aufgenommen und analysiert.

4.13. Rasterkraftmikroskopie (AFM) in Hautexplantaten

Die Elastizität von unbehandelten und mit ObHEx behandelten Hautproben wurde bewertet, um ihre Elastizitätsmoduln durch eine Methode im Nanometerbereich basierend auf Rasterkraftmikroskopie (AFM) zu gewährleisten, die nicht nur für biologische Proben, sondern auch für anorganische Proben entwickelt wurde. Diese Ansätze basieren auf den Annahmen der Hertz-Modelle und betrachteten die Probe und den Cantilever als zwei Federn in einer Reihe in einer AFM-Experimentumgebung. Kurz gesagt, mit 0.006 Prozent ObHEx behandelte Haut ab der Pflanze und unbehandelte Hautproben wurden mit einem Kryostaten in 10 um dicke Scheiben geschnitten. Die Proben wurden bei 12 Grad gelagert, dann mit PBS gewaschen und bei einer festgelegten Temperatur und relativen Luftfeuchtigkeit von 22 Grad bzw. 55 Prozent untersucht. Jede Probe wurde mit einem NanoScope IIA AFM im Force Spectroscopy Single Mode unter Verwendung einer Pyramidenspitze (RESP-20) mit einer Federkonstante von 0,9 N/m untersucht. Um den Elastizitätsmodul zu berechnen, wurden zehn Kraftkurven an zehn verschiedenen Punkten derselben Probenoberfläche aufgenommen. Jede Kraftkurve ist eine Kurve der Durchbiegung (Volt) gegenüber der Verschiebung (nm) und kann in Kurven der Kraft (N) gegenüber dem Abstand (nm) umgewandelt werden. Tatsächlich zeigt jede Kraftkurve Belastungs- und Entlastungskurven an. Sie stellen den Trend der Spitze in Bezug auf die Probe dar: wenn die Spitze weit von der Probe entfernt ist, wenn sie sich berühren und die Spitze beginnt auszulenken, und wenn sie sich wieder entfernt. Nur der erste Teil dieser Kurven kann untersucht werden. Jeder dieser Teile der Kurven wurde mit einem standardmäßigen Hertzschen Modell, insbesondere der typischen Hertze-Gleichung für eine Pyramidenspitze, angepasst, um den Elastizitätsmodul zu extrahieren, der als Elastizitätsmodul in GPa bekannt ist.

4.14. Statistische Analyse

Alle angegebenen Werte waren der Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten, von denen jedes dreifach durchgeführt wurde. Die Sternchen geben die statistische Signifikanz an, die in Übereinstimmung mit dem t-Test berechnet wurde: *Mittelwert Kleiner als oder gleich 0.05;** p-Wert Kleiner als oder gleich 0. 01;***p-Wert Kleiner oder gleich 0,001.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites