Anti-Aging-Wirkung von Urolithin A auf Rinderoozyten in vitro 2

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2.8.Statistische Analyse

Daten aus der Embryoproduktion und Qualitätssitzungen wurden unter Verwendung von Proc Glimmix von SAS (Statistical Analysis Systems, SAS Inst., Inc., Cary, NC, USA) unter Verwendung der binären Verteilung und des Logit als Verknüpfungsfunktionen analysiert. Das verallgemeinerte lineare gemischte Modell umfasste die Behandlung (UA-Dosen, Alterungseffekt und weibliches Alter und ihre Wechselwirkung) als festen Effekt und Wiederholungen als zufälligen Effekt. Zusätzlich wurden die Mittelwerte für jede Behandlung berechnet und Vergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung des PDFF-Tests durchgeführt. Die JC-1-Daten, die mRNA-Transkriptspiegel und die Anzahl der mt-DNA-Kopien wurden unter Verwendung des Proc Mixed von SAS mit einem Modell einschließlich Behandlung (UA-Effekt, Alterungseffekt und/oder weibliches Alter und deren Wechselwirkung) analysiert. als fester Effekt. Die Sitzung wurde als Zufallseffekt betrachtet. Die Daten der chromosomalen Konfigurationen wurden zwischen den Gruppen unter Verwendung des exakten Fisher-Tests in einer 2 x 2-Kontingenztabelle verglichen. Die Analyse der Ergebnisse wurde als statistisch signifikant angesehen, wenn p<>

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3. Ergebnisse

3.1.Vorheriger Assay – Dosis-Wirkungs-Studie

Der Oozytenreifungsstatus, der während der Dosis-Wirkungs-Studie von mit dem Reifungsmedium ergänztem UA beobachtet wurde, ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese Ergänzung beeinflusste signifikant die Kernreifungsstadien von Oozyten. Die 50 UA-Gruppe (38,9±0,5 Prozent) zeigte eine höhere Oozytenrate im AI/TI-Phasenstatus im Vergleich zur Kontrollgruppe (10,8±{{ 15}},5 Prozent ,P=0.03)und 10 UA(0.0±0.{{ 45}} Prozent, p=0.0006)-Gruppen die 10 UA-Gruppe wurde ebenfalls identifiziert. Darüber hinaus wurde ein Trend zwischen der 50 UA-Gruppe und 1 UA (14,3 ± 2,0 Prozent, p=0.08) festgestellt. Die höchste Dosis zeigte auch eine schädliche Wirkung, indem sie die Anzahl der in der Metaphase-II klassifizierten Eizellen reduzierte (MII)-Stadium (50 UA, 44,4 ± 2,0 Prozent) im Vergleich zur Kontrolle (86, 5 ± 7,0 Prozent, p =0, 003), 1 UA (82,1 ± 2,5 Prozent, p {{ 53}}.01), 10 UA (89,3 ± 6,5 Prozent, p=0.002) und 25 UA (82,8 ± 9,0 Prozent, p=0.01) Gruppen. Zwischen den verbleibenden wurden keine Unterschiede beobachtet Stadien der Eizellreifung. Die GV- und CCl-Reifungsphasen wurden in Abbildung 1 nicht dargestellt, da in diesen Kategorien keine Eizellen bewertet wurden.

Der Dosis-Wirkungs-Test zeigte keine signifikante Wirkung der UA-Konzentrationen auf die Teilungsrate und die Rate geschlüpfter Embryonen. Allerdings wurde die Rate der an Tag 7 produzierten Embryonen durch die unterschiedlichen Konzentrationen von UA ​​beeinflusst. Die 5 0 UA-Gruppe (7,2 ± 2,7 Prozent) hatte niedrigere Embryonenraten am 7. Tag im Vergleich zu der 1 UA (28,5 ± 4,8 Prozent, p =0 0,004), 10 UA (20,4 ± 4,0 Prozent). , p=0,03) und 25 UA(18,5±4,7 Prozent, p=0,05)Gruppen. Obwohl keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe mit 50 UA gefunden wurden, wurde ein Trend (p=0,06) identifiziert. Darüber hinaus sind die Embryoraten am 7. Tag tendenziell (p =0 0,07) nach einer Supplementation mit einer UA-Dosis im Vergleich zur Kontrolle höher. Darüber hinaus verdoppelte die 1 UA-Gruppe die Anzahl ausgezeichneter/guter Embryonenqualität (68,9 Prozent der Grad-1-Embryonen, n=20) im Vergleich zur Kontrollgruppe (34,6 Prozent, n=10) und 10 UA (26,8 Prozent, n=10). Eine geringe Anzahl von Embryonen Grad 1 wurde mit den höheren Dosen erhalten: 25 UA-Gruppe (15,4 Prozent, n=4) und 50 UA (35,4 Prozent, n=3). Basierend auf den oben erwähnten Ergebnissen wurde das 1 &mgr;M UA ausgewählt, um mit den folgenden Studien fortzufahren.

3.2.Experiment 1——Eizellenqualität und Entwicklungspotential gealterter und physiologisch gereifter Eizellen

3.2.1.Kernreifung

Wir untersuchten die Wirkung einer UA-Supplementierung auf den chromosomalen Reifungsstatus von gealterten und physiologisch gereiften Eizellen, die von präpubertären und erwachsenen Frauen gesammelt wurden. Unabhängig vom UA-Effekt hat die Oozytenalterung und das weibliche Alter einen signifikant schädlichen Einfluss auf die Reifung. Höhere Raten der MII-Phase wurden in Kontrolloozyten im Vergleich zu gealterten identifiziert (22 h=93,2±5,4 % vs. 30h=77,6 ±4,1 %, p {{11 }}.02). Darüber hinaus wurde bei älteren Gameten und präpubertären Frauen mit mehr Oozyten in der AI/TI-Phase eine Verzögerung des Reifungsfortschritts festgestellt (22 h =3,4 ± 0,5 % vs. 3 0 h). =17,9±0,6 Prozent, p=0,01 und präpubertär=21,1±1,1 Prozent vs. Erwachsener=6,8±0,7 Prozent p =0.03). Darüber hinaus wurde eine höhere Anzahl degenerierter Eizellen nach 30 h IVM identifiziert als nach 22 h (7,1 ± 1,39 Prozent vs. 4,1 ± 0,89 Prozent, p =0.02). . Das weibliche Alter und die UA-Supplementierung hatten keinen Einfluss (p 0,05) auf die Anzahl der degenerierten Eizellen.

Sowohl die In-vitro-Alterung als auch die UA-Ergänzung zum Reifungsmedium beeinflussten signifikant die chromosomale Konfiguration von Eizellen bei präpubertären und erwachsenen Frauen (S<0.05, figure="" 2).="" on="" the="" al/ti="" phase="" of="" the="" maturation="" status,="" higher="" rates="" of="" oocytes="" were="" found="" in="" this="" stage="" in="" the="" control="" aged="" 30="" h="" prepubertal="" group="" (46.7±0.5%)="" when="" compared="" to="" control="" prepubertal="" (0.0±0.0%,p="0.05)" and="" ua="" aged="" 30h="" prepubertal="" (0.0="" ±0.0%,p="0.02),and" both="" adult="" control="" (5.6±0.5%,p="0.01" and="" ua="" adult,0.0±0.0%,="" p="0.0002)and" control="" aged="" 30h="" adult="" (9.1±10%,p="0.02)groups." a="" trend="" was="" also="" identified="" between="" ua="" adults="" and="" ua="" aged="" 30="" h="" adult="" (p="">

Bezüglich der MII-Phase, die der vollständigen Kernreifung entspricht, wurden ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen gefunden (Abbildung 2). Niedrigere Oozytenraten im MII-Stadium wurden bei der Kontrollgruppe im Alter von 30 Stunden vor der Pubertät (53,3±2,0 Prozent) im Vergleich zur Kontrollgruppe vor der Pubertät (10{{2{ {27}}}}.0±1,5 Prozent, p=0,05), UA im Alter von 30 Stunden vor der Pubertät (100,0±2,5 Prozent, p=0,02) und UA für Erwachsene (100,0 ±10,5 Prozent, p=0,0002) und Kontrollgruppen im Alter von 30 Jahren (86,0±5,5 Prozent, p =0,056). Darüber hinaus zeigte die Gruppe der UA-Erwachsenen höhere Raten an reifen Oozyten (MII) im Vergleich zu der UA-Erwachsenen im Alter von 30 Stunden (76,2 ± 11,3 Prozent, p=0.01), der Kontrollgruppe im Alter von 30 Stunden (86). 0±5,5 Prozent, p=0,08) und Kontrollerwachsener (83,3±4,5 Prozent, p=0,057).

Zwischen den verbleibenden Stadien der Oozytenreifung wurden keine Unterschiede beobachtet.Flavonoide,Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die UA-Supplementierung den Fortschritt der In-vitro-Reifung in Eizellen verbesserte, die dem Alterungsprozess unterzogen wurden, insbesondere bei präpubertären Frauen. Damit wurde ein wichtiger Anti-Aging-Effekt von UA ​​identifiziert.

3.2.2.Mitochondriales Membranpotential

Um die Beteiligung der mitochondrialen Dysfunktion an weiblichen gealterten Oozyten und die Auswirkung von UA ​​und mütterlichem Alter zu analysieren, wurde das mitochondriale Membranpotential (MMP) in Oozyten verschiedener Gruppen bewertet.

Cistanche kann Anti-Aging

Unabhängig vom weiblichen Alter und den UA-Effekten hatte die Oozytenalterung eine signifikante schädliche Wirkung auf MMP, bewertet als Verhältnis der gemessenen roten und grünen Fluoreszenz (22-Stunden-Verhältnis =0,54 ± 1,8 Prozent vs. 30-Stunden-Verhältnis{{6} }.47±1.5 Prozent, p=0.002).

Die Kombination aus weiblichem Alter, Alterungseffekt und der Supplementierung mit UA während der Reifung beeinflusste signifikant (p{{0}}.{{10}}07) den MMP (Figur 3). Wie in Abbildung 3 zu sehen ist, wurden höhere MMP-Raten in den UA-Gruppen vor der Pubertät (Verhältnis =0 0,55 ± 0,04) und UA-Erwachsenen (Verhältnis =0 0,63 ± 0,04) erzielt, in denen die Eizellen 22 Stunden lang gereift waren , verglichen mit der Kontrolle im Alter von 30 h Erwachsener (Verhältnis =0.45±0.04, p=0.04 bzw. p=0.0007) und UA im Alter von 30 h Erwachsener (Verhältnis { {23}}.45±0.03, p=0.03 bzw. p=0.0003) Gruppen.Hesperidin verwendetDarüber hinaus wurde ein signifikanter Anstieg des JC{{0}}-Aggregat/Monomer-Verhältnisses beobachtet, was auf einen signifikanten Anstieg von MMP hinweist, in der UA-Erwachsenengruppe im Vergleich zu Kontroll-Erwachsenen (Verhältnis =0,47 ±0.04,p =0.0031),Kontrolle präpubertär (Verhältnis=0.52±0,04, p=0). 03), Kontrolle im Alter von 30 Std. Erwachsener (Verhältnis=0.48±0.03, p=0.003) und UA im Alter von 30 Std. Erwachsener (Verhältnis=0.47±0,03, p{{25 }}.001) Gruppen. Ein Trend wurde auch zwischen UA präpubertär und UA im Alter von 30 h präpubertär identifiziert (p=0.07).

Zusammenfassend verbesserte UA die MMP während der physiologischen Reifung, war jedoch nicht in der Lage, die negativen Auswirkungen des Alterns sowohl in präpubertären als auch in erwachsenen Eizellen zu überwinden.

3.2.3.Embryonale Entwicklung

Das embryonale Entwicklungspotential wurde anhand der Teilungs-, D7- und geschlüpften Embryoraten bewertet, die mit den verschiedenen Behandlungen (Alterung und UA-Ergänzung) erhalten wurden, die auf die COCs der präpubertären und erwachsenen Weibchen während der Reifung angewendet wurden. Unabhängig vom weiblichen Alter und den UA-Effekten hatte die Oozytenalterung eine signifikante schädliche Wirkung auf die Spaltung (22 h =79,5 ± 1,7 Prozent vs. 3 0 h=68, 6 ± 2,0 Prozent). p=0.0001) und D7-Embryoraten (22h=18.6±1,9 Prozent).

vs.30h=12.1±1,7 Prozent, p=0.01).Es wurde auch gezeigt, dass die UA-Supplementierung die D7-Embryonenraten verbessert (Kontrolle{ {8}}.1±1.5 Prozent vs. UA=20.0±2.0 Prozent, p=0.0009).

Die Kombination aus weiblichem Alter, Alterungseffekt und der Supplementierung mit UA während der Reifung beeinflusste signifikant (p {{0}}.{{30}}1) die Embryonalentwicklung, nämlich die Spaltung und D7-Embryoraten (Tabelle 2). Höhere Teilungsraten wurden erreicht, wenn die erwachsenen Oozyten 22 Stunden lang mit oder ohne UA-Ergänzung gereift waren (Kontroll-Erwachsener =1,4 ± 3,2 Prozent und UA-Erwachsener =80). 9±3,4 Prozent) und präpubertäre Oozyten reiften 22 Stunden lang mit UA-Supplementierung (UA präpubertär=80,6±3,2 Prozent), verglichen mit UA im Alter von 30haedult (66,5±4,2 Prozent, p Weniger als oder gleich 0,01), Kontrollgruppe im Alter von 30 Stunden vor der Pubertät (66,9 ± 3,9 Prozent, p kleiner oder gleich 0,02) und UA im Alter von 30 Stunden vor der Pubertät (67,2 ± 4,0 Prozent, p kleiner als oder gleich 0,01) (Tabelle 2). Ein Trend (p=0,09) wurde auch zwischen der erwachsenen Kontrollgruppe und der erwachsenen Kontrollgruppe im Alter von 30 Stunden identifiziert.

Another parameter that was significantly (p=0.01) influenced by the combination of the female age, the supplementation with UA, and COCs aging was the rate of embryos produced at day 7(Table 2). Exceptions were made for the UA prepubertal and UA 30 h prepubertal groups, the UA adult group presented the highest rates of the embryo at day7 (26.8±4.3%,p≤0.05). Moreover, lower D7 embryo rates were produced from aged oocytes from both adult and prepubertal females without the supplementation of UA (control aged 30hprepubertal=7.7±2.6% and control aged 30h adult=7.7±2.6%)compared to those that were supplemented with UA, respectively (UA aged 30 h prepubertal=18.9±4.0%,p=0.03 and UA aged 30 h adult=15.9±4.0%,p=0.09). The supplementation of UA to the maturation medium did not significantly (p>0.05) beeinflussten die Qualitätsraten produzierter Embryonen der Grade 1, 2 und 3 noch der Alterungseffekt oder alle untersuchten Effekte zusammen (Tabelle 3). Jedoch verdoppelte sich die Anzahl an Embryonen von ausgezeichneter/guter Qualität, die produziert wurden, wenn die UA zu 22 h gereiften Oozyten ergänzt wurden (Tabelle 3).

3.3.Experiment 2

3.3.1. Genexpressionsniveaus

Um den UA-Effekt und den Einfluss des mütterlichen Alters auf den Nrf2-Signalweg zu untersuchen, wurde die Analyse der NFE2L2- und NQO1-Genexpressionsniveaus in GCs-Kulturen von präpubertären und erwachsenen Kühen durch RT-qPCR bewertet. Unabhängig von den anderen untersuchten Faktoren beeinflusste das Alter der Frau die NFE2L2-Genexpression signifikant, was sich in der höheren Menge an NFE2L2-Transkripten in GCs von präpubertären Frauen widerspiegelt (mRNA-Level präpubertär=0.00015 ±0,0012 Prozent vs. Erwachsener=0,00011±0,0012, p=0,048).

The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly(p>0.05) beeinflussen die Genexpressionsniveaus der NFE2L2-, NQO1- und mt-ND5-Gene. Abbildung 4 stellt die Expressionsniveaus dieser Gene dar, die mit der jeweiligen Kontrolle normalisiert wurden, sowohl in UA-behandelten präpubertären als auch in erwachsenen GCs.

3.3.2.mt-DNA-Kopiennummer

Analysis of mt-ND5 DNA content in GC culture from prepubertal and adult cows was assessed by qPCR. The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly (p>0.05) beeinflussen die Kopienzahl des mt-ND5-Gens.verlorenes Reich cistancheAbbildung 5 stellt die Kopienzahl dieses Gens dar, normalisiert mit den jeweiligen Kontrollen, sowohl in UA-behandelten präpubertären als auch erwachsenen GCs.

4. Diskussion

In den letzten Jahrzehnten wurde eine steigende Nachfrage nach ART-Anwendungen bei Nutztieren beobachtet [8,46,47]. Darüber hinaus ist die verzögerte Geburt im Zusammenhang mit dem fortgeschrittenen Alter der Mutter inzwischen der Hauptfaktor, der Frauen dazu veranlasst, auf ART zurückzugreifen [5]. Die Qualität der Oozyten ist entscheidend für das Auftreten einer erfolgreichen Empfängnis, und die Alterung der weiblichen Gameten ist ein Hauptanliegen für den Erfolg von ART. Trotz der zunehmenden Fortschritte auf diesem Gebiet sind die angewandten Technologien noch nicht in der Lage, die Fruchtbarkeit wiederherzustellen und die biologische Uhr umzukehren [7]. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell zur Untersuchung der altersassoziierten Unfruchtbarkeit in Oozyten von Rindern entwickelt. Aufgrund der Ähnlichkeiten mit menschlicher Schwangerschaft, follikulären und endokrinen Ereignissen[48,49] kann dieses Modell auch für die Humanforschung nützlich sein, wobei die ethischen und physikalischen Einschränkungen vermieden werden, die diese Studien an menschlichen Eizellen behindern. Unser Modell für alternde weibliche Gameten erwies sich als sehr effizient und geeignet, um verschiedene Probleme im Zusammenhang mit reproduktivem Altern und Fruchtbarkeitsstörungen zu untersuchen, die derzeit eine der kritischsten Herausforderungen der Welt sind. Darüber hinaus ist die Suche nach neuen aufkommenden antioxidativen Therapien mit dem Potenzial, die durch die Alterung der weiblichen Gameten hervorgerufene Unfruchtbarkeit zu verhindern, wie sie in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde, gleichermaßen von größter Bedeutung.

Die vorgestellten Ergebnisse berichteten zum ersten Mal über die vorteilhafte Wirkung von UA ​​auf ART-Ergebnisse. UA ist ein Nahrungsmetabolit, der in der Lage ist, die Ansammlung von altersbedingt funktionsgestörten Mitochondrien zu verhindern, indem er deren Mitophagie und eine verlängerte Lebensdauer der Zellen induziert [28]. Da UA noch nie zuvor in der Rinderreproduktion getestet wurde, wurden Dosen erfolgreich in verschiedenen Zelllinien angewendet, die seine krebshemmenden, entzündungshemmenden und Anti-Aging-Wirkungen zeigten [28,35,39]. In unserer Studie wurde eine frühere Dosis- Response Assay wurde durchgeführt und die Konzentration von 1 uM UA wurde eindeutig als die vielversprechendste identifiziert. Darüber hinaus wurde bei höheren Dosen, insbesondere bei der Dosis von 50 uM UA, eine schädliche Wirkung gezeigt, die das Fortschreiten der Kernreifung bis zum MII beeinträchtigt. Dieser Effekt spiegelte sich in der Beeinträchtigung der embryonalen Entwicklung wider. Dementsprechend stellten Liu und Kollegen (2019) bei einer UA-Konzentration von 50 uM eine signifikant verringerte Zelllebensfähigkeit und Proliferation von menschlichen seneszenten Hautfibroblasten fest. Sie wiesen darauf hin, dass hohe UA-Dosen zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit führen, wodurch die Anzahl der im G/M-Zellzyklus angehaltenen Zellen zunimmt [35]. Im Gegensatz dazu wurden am 7. Tag nach der Zugabe von 1 uM UA zum Reifungsmedium im Vergleich zu den anderen Dosen höhere Embryonenraten produziert. Um die potenziellen Wirkungsmechanismen von UA ​​bei der weiblichen Fortpflanzung weiter zu untersuchen, wurde eine Studie während der Oozytenalterung und unter Verwendung von Frauen unterschiedlichen Alters als Eizellspender durchgeführt. Yamamoto und Mitarbeiter (2010) berichteten über einen altersbedingten Rückgang der Befruchtungsrate alter Kühe, was zeigt, dass diese Eizellen eher dazu neigten, die erste meiotische Teilung während der Reifung wieder aufzunehmen, und die meiotische Reifung oft bereits bei der Eizellentnahme eingeleitet hatten [50]. Diese Daten deuten darauf hin, dass Oozyten von älteren Kühen aufgrund einer geringeren Oozytenkompetenz einen schnelleren Fortschritt der Kernreifung aufweisen und die MII-Phase schneller erreichen als Oozyten von jungen Weibchen [51]. Dementsprechend zeigt unsere Studie, dass das Alter weiblicher Spenderinnen und der Alterungsprozess der Oozyten die chromosomale Konfiguration der Oozyten während des Reifungsfortschritts signifikant beeinflussen. Tatsächlich zeigten Oozyten von präpubertären Kühen eine höhere Rate an verzögerten Stadien, wie z. B. Al/TI-Phasen (präpubertär =21,1 Prozent vs. ausgewachsene =6,8 Prozent), was auf ein langsameres Fortschreiten des Zellkerns hindeutet Reifung, was auf eine geringere Oozytenkompetenz zurückzuführen sein könnte, wie von Soto-Heras und Kollegen (2018) vorgeschlagen. Gealterte Eizellen weisen auch geringere Raten von Eizellen auf, die die MII-Phase während eines 30-Stunden-Zeitraums (7,6 Prozent) im Vergleich zum physiologischen Zeitraum (93,2 Prozent) erreicht haben. Darüber hinaus wurde eine positive Wirkung der UA-Behandlung während des physiologischen Reifungsprozesses sowie Anti-Aging-Effekte sowohl bei präpubertären als auch bei erwachsenen Frauen festgestellt.

In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen hat eine Studie gezeigt, dass eine Melatonin-Supplementierung während der In-Oitro-Reifung die Wiederaufnahme der Meiose in Rinder-COCs stimulieren könnte, während Kontrolloozyten, die ohne Hormone kultiviert wurden, langsamere Wiederaufnahmeraten der Meiose aufwiesen [52]. Im Gegensatz dazu zeigte die Supplementierung mit anderen Antioxidantien wie Quercetin, Vitamin C oder Resveratrol keine Wirkung auf die Kernreifungsraten, selbst wenn ein reduzierter ROS-Spiegel oder ein erhöhter Gehalt an antioxidativen Enzymen beobachtet wurde [53,54].mikronisierte gereinigte Flavonoidfraktion 1000 mg verwendetUmgekehrt zeigen unsere Ergebnisse, dass UA Oozyten sowohl bei älteren erwachsenen als auch bei präpubertären Frauen, die eine geringere Kompetenz aufweisen, vor Alterungseffekten retten und die Reifungsraten verbessern könnte.

Einer der Hauptfaktoren für schlechte Fertilitätsergebnisse, die die Eizellenqualität beeinträchtigen, hängt mit mitochondrialen Funktionen zusammen, die mit fortgeschrittenem Alter der Mutter und postovulatorischer Alterung beeinträchtigt werden [21,55]. Die MMP wurden in verschiedenen Modellen umfassend untersucht und zeigten, dass sowohl gealterte Gameten nach dem Eisprung als auch die mütterliche Alterung den Verlust der mitochondrialen Funktion induzieren [56]. Folglich wirkte sich der Verlust von MMP negativ auf die Entwicklung von Eizellen und Embryonen aus [26,57]. Gemäß diesen Ergebnissen wurde in unserer Studie ein reduziertes MMP-Verhältnis in gealterten Eizellen sowohl von präpubertären als auch von erwachsenen Kühen gefunden. Darüber hinaus induzierte die UA-Ergänzung zum Kulturmedium einen Anstieg der MMP von präpubertären und erwachsenen Oozyten, die 22 Stunden lang reiften, was sich in höheren Spaltungsraten widerspiegelte. Diese Daten stimmen mit den Ergebnissen von Liang und Mitarbeitern (2017) überein, die eine MMP-Verstärkung beobachteten, wenn Rinderoozyten 22 Stunden lang mit Melatonin ergänzt wurden [26]. Wir haben jedoch auch eine Verringerung von MMP in gealterten Eizellen festgestellt, die mit UA ergänzt wurden, was darauf hinweist, dass UA möglicherweise nicht in der Lage ist, die negativen Auswirkungen des Alterns auf MMP umzukehren. Es wurden widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der MMP nach der Supplementierung gealterter Eizellen mit antioxidativen Verbindungen beobachtet. Tatsächlich berichteten mehrere Autoren über höhere MMP-Spiegel auf Oozyten nach einer Supplementierung mit Melatonin [26] und Laminarin [21], während andere das Gegenteil beobachteten, nämlich eine Abnahme von MMP in gealterten Oozyten, die mit L-Carnitin behandelt wurden [58] und Melatonin [38]. Darüber hinaus zeigten Ryu und Kollegen (2016) eine Reduktion von MMP in mit UA kultivierten Mäusemyoblasten [28]. In Bezug auf unsere Ergebnisse sollten weitere Studien in Angriff genommen werden, um das Wissen über den Wirkmechanismus von UA ​​in den Mitochondrien der Eizelle zu vertiefen und die identifizierten unterschiedlichen Auswirkungen auf gealterte und physiologisch ausgereifte Eizellen zu erklären.

Die intrinsische Qualität von Oozyten wurde weithin als Hauptdeterminante der späteren embryonalen Entwicklung beschrieben. Gehäufte Beweise zeigten, dass mehrere zelluläre und molekulare Anomalien während verlängerter In-vitro-Reifungsperioden sowie während der postovulatorischen Alterung in oivo auftreten [57]. Darüber hinaus können diese Anomalien relevante Auswirkungen auf die Oozytenqualität haben, die sich auf die Embryonenproduktion auswirken [52]. Um zu demonstrieren, dass UA als Anti-Aging-Verbindung wirken und die Oozytenqualität verbessern kann, wodurch die Oozytenalterung verzögert wird, haben wir die Entwicklungsfähigkeit gealterter Oozyten nach In-vitro-Fertilisation untersucht. In unserer Studie wurde ein signifikanter (p kleiner oder gleich 0,01) schädlicher Effekt der Gametenalterung auf die Spaltung und die Produktionsraten von Embryonen am Tag 7 beobachtet. Dementsprechend weisen mehrere Autoren darauf hin, dass alte Frauen einen altersbedingten Rückgang der Fortpflanzungsfähigkeit aufweisen, der sich in niedrigeren Fertilitätsraten und schlechter Embryoqualität widerspiegelt [44,55]. Andererseits haben frühere Studien, in denen andere antioxidative Moleküle getestet wurden, um gealterte Eizellen zu retten, über die vorteilhafte Wirkung einiger dieser Verbindungen während der In-vitro-Reifung auf die Embryonalentwicklung von gealterten Weibchen verschiedener Arten wie Rind [58], Schwein [58] berichtet. 38] und Mäuse [6]. Beispielsweise wurde L-Carnitin an Oozyten im Rinderalter getestet und es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den erhaltenen Spaltungsraten gefunden. Allerdings wurde im Vergleich zu gealterten Eizellen ohne L-Carnitin eine signifikante Erhöhung der Zygotenrate, die sich bis zum Blastozystenstadium entwickelt hat, festgestellt [59]. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass die UA-Supplementierung während der physiologischen Reifung die Teilungsrate bei präpubertären und erwachsenen Frauen verbesserte. Obwohl sich die Teilungsraten von Oozyten im UA-Alter nicht signifikant von Oozyten im Kontrollalter unterschieden, wurden höhere D7-Embryoraten in Oozyten im UA-Alter sowohl von präpubertären als auch von erwachsenen Frauen identifiziert. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die zuvor in verschiedenen Zellkulturen identifizierte Anti-Aging-Wirkung von UA ​​[28,35] für Eizellen und Embryonen gültig ist. Die Eizellalterung ist ein multifaktorieller Prozess, der die Entwicklung des Embryos beeinträchtigt, und die Wiederherstellung der Entwicklungsfähigkeit gealterter Eizellen ist ein wichtiges Ziel, das in der vorliegenden Studie erreicht wurde.

Darüber hinaus bewerteten wir auch die präventive Rolle von UA ​​bei der altersbedingten Verschlechterung der Embryoqualität. Obwohl in dieser Studie keine signifikanten Unterschiede in den Embryoqualitätsraten festgestellt wurden, erhöhten die mit UA ergänzten Eizellen die Anzahl der übertragbaren Embryonen im Vergleich zu den unbehandelten. Eine frühere Studie berichtete, dass die Behandlung mit L-Carnitin die Qualität von Embryonen, die aus gealterten Rinderoozyten entwickelt wurden, durch die Verringerung der ROS-Spiegel und höhere Spiegel von Glutathion sowie anderen antioxidativen Enzymen verbessern könnte [58]. Die Unterschiede zwischen diesen Ergebnissen und unseren können auf die unterschiedlichen Techniken zurückzuführen sein, die zur Beurteilung der Embryoqualität angewendet werden. Die morphologische Bewertung der Embryoqualität bleibt eine subjektive Methode, die von der Erfahrung des Beobachters abhängt. In Zukunft sollten weitere Studien mit anderen Techniken durchgeführt werden, um die Embryoqualität genau zu beurteilen.

Es ist allgemein bekannt, dass oxidativer Stress eine entscheidende Rolle bei der altersbedingten Abnahme der Fruchtbarkeit spielt. Oxidativer Stress ist einer der Hauptverursacher einer geringen Eizellreifungseffizienz und einer Verschlechterung der Eizellqualität, wodurch die nachfolgende Embryonalentwicklung beeinträchtigt wird [11]. Die interzelluläre Kommunikation zwischen Gameten und somatischen Zellen ist entscheidend für die ordnungsgemäße Entwicklung hochwertiger Eizellen. Es wurde über Veränderungen in der Mikroumgebung gealterter Eierstöcke berichtet, wie z. B. eine verringerte antioxidative enzymatische Aktivität, die zu einer beeinträchtigten ROS-Abfangeffizienz führt.OteflavonoidDarüber hinaus wurde gezeigt, dass GCs von jungen und älteren Frauen unterschiedlich exprimierte Gene aufweisen, die mit antioxidativen Aktivitäten und dem Alter der Mutter in Verbindung stehen [2,13]. Daher ist es von großer Bedeutung, dass gefundene Mechanismen oxidativen Stress bewältigen, um Eizellen vor dem Altern zu retten und Unfruchtbarkeitsprobleme zu überwinden. Der Nrf2-Keapl-Weg wurde aufgrund seiner Fähigkeit, mit den schädlichen Auswirkungen von oxidativem Stress fertig zu werden und antioxidative Eigenschaften auszuüben, ausgiebig untersucht [60]Um die Aktivierung des Nrf2-Signalwegs in Rinder-GCs weiter zu untersuchen, bewerteten wir die mRNA-Expressionsniveau von NFE2L2 und seinem nachgeschalteten Antioxidans (NQO1). Unsere Ergebnisse zeigten einen signifikanten Einfluss des weiblichen Alters auf die Menge an NFE2L2-Transkripten, die mit zunehmendem Alter abnimmt. Tatsächlich wurden bei präpubertären Kühen im Vergleich zu erwachsenen Kühen höhere mRNA-Expressionsniveaus beobachtet. Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die eine hohe Expression von Nrf2-Protein und mRNA auf Ovarialgeweben von gebärfähigen jungen Mäusen und Frauen im Alter von 22 bis 49 Jahren berichteten, während bei älteren Mäusen und Frauen eine geringere Expression gefunden wurde. Es wurde vermutet, dass eine verringerte Expression von Nrf2 am Rückgang der Fortpflanzungsfähigkeit älterer Frauen beteiligt sein könnte und seine Kontrolle wichtige Auswirkungen auf die Verzögerung der Alterung der Eierstöcke haben könnte [15,61]. Darüber hinaus zeigten Akino und Mitarbeiter (2019), dass die Aktivierung des Nrf2-Keapl-Signalwegs durch die Verabreichung von Dimethylfumarat die ROS-Spiegel senken und zu einer verzögerten Unfruchtbarkeit führen kann [18]. Ähnliche Ergebnisse bezüglich der Wirkung von UA ​​bei der Reduzierung von ROS in seneszenten menschlichen Hautfibroblasten wurden berichtet. Wenn diese Zellen mit UA behandelt wurden, wurde ein signifikanter Anstieg der mRNA-Expression von Nrf2-Zielgenen wie SOD1, NQ01, GCLC und HMOX1 berichtet. [35]. In unserer Studie beobachteten wir, dass das Expressionsniveau der NFE2L2- und NQO1-Gene in GCs durch die UA-Supplementierung nicht signifikant beeinflusst wurde. Es sollten jedoch weitere Studien durchgeführt werden, um die Verringerung der ROS und die anschließende Verbesserung der produzierten Blastozyste sowie die UA-Wirkung auf die mRNA-Expression der oben genannten Gene bei gealterten Eizellen zu bestätigen.

Neben der Schädigung der mitochondrialen DNA (mt-DNA) [25,57] wurde auch gezeigt, dass die Störung der mitochondrialen Genexpression zur mitochondrialen Dysfunktion mit zunehmendem Alter beiträgt. Zhang und Kollegen (2019) berichteten, dass einige Gene, die an OXPHOS beteiligt sind, nämlich mt-ND2, mt-ND3, mt-ND4, mt-ND4L und mt-ND5, im GV-Stadium von Oozyten von gealterten Mäusen signifikant herunterreguliert wurden. verglichen mit denen von jungen Mäusen[62]. In unserer Studie wurde kein signifikanter Unterschied in der mt-ND5-mRNA-Expression zwischen den GCs gefunden, die von präpubertären und erwachsenen Kühen stammen. Darüber hinaus haben wir auch die mt-DNA-Kopienzahl bewertet, da der Gehalt an mt-DNA in GCs positiv mit der Oozytenqualität und der Embryonalentwicklung in Verbindung gebracht wurde [63,64]. Obwohl in unserer Studie keine signifikanten Unterschiede zwischen der mt-DNA-Kopienzahl in GCs von präpubertären und erwachsenen Kühen oder bei Behandlung mit UA festgestellt wurden, beobachteten wir im Vergleich zu den unbehandelten Gruppen eine größere Anzahl von Oozyten, die sich bis zum Blastozystenstadium entwickelten. Darüber hinaus berichteten Ryu und Mitarbeiter (2016), dass sich der mt-DNA-Gehalt und der Proteinspiegel aus den Atmungskomplexen in mit UA ergänzten Maus-Myoblasten nicht veränderten [28]. Weitere Studien sollten durchgeführt werden, um den Wirkungsmechanismus von UA ​​bei der Verbesserung der weiblichen Fruchtbarkeit aufzudecken.

5. Schlussfolgerungen

Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse bestätigten die schädliche Wirkung der Oozytenalterung auf ihre Entwicklungskompetenz. Darüber hinaus erwies sich unser Modell für alternde weibliche Gameten als sehr effizient und nützlich, um verschiedene Probleme im Zusammenhang mit reproduktivem Altern und daraus resultierender Beeinträchtigung der Fruchtbarkeit zu untersuchen. Darüber hinaus verbesserte die UA-Ergänzung während des Reifungsprozesses gealterter Eizellen die Reifungsraten und produzierte Embryonen. Daher wurde erstmals eine Anti-Aging-Wirkung von UA ​​bei der Rettung gealterter Gameten identifiziert, die die Blastozystenentwicklung verbessert, was zu einer erhöhten Anzahl von Embryonen für den Transfer auf weibliche Empfänger führt. Ein positiver Effekt von UA ​​auf die physiologische Reifung, MMP und die embryonale Entwicklung wurde ebenfalls identifiziert. Zusammenfassend stellt die UA-Behandlung einen neuen therapeutischen Ansatz dar, um die Gametenalterung zu verhindern oder zu verzögern und die nachfolgende Blastozystenbildung und die Fruchtbarkeitsergebnisse bei ART zu verbessern.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals