Anti-Aging-Effekte von Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Kalluskultur-Extrakt durch Transkriptom-Profiling

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Abstrakt:Edelweiß (Leontopodium alpinum) in der Familie der Asteraceae ist eine Wildblume, die in felsigen Kalksteinstellen wächst. Hier untersuchten wir die Wirksamkeit von Edelweiss-Kalluskulturextrakt (Leontopodium Alpinum Kalluskulturextrakt; LACCE)unter Verwendung mehrerer Assays von in vitro bis in vivo sowie Transkriptom-Profiling. Mehrere In-vitro-Assay-Ergebnisse zeigten die starke antioxidative Aktivität von LACCE als Reaktion auf die UVB-Behandlung. Darüber hinaus unterdrückte LACCE Entzündungen und Faltenbildung; Die feuchtigkeitsspendende Aktivität wurde jedoch durch LACCE erhöht. Der klinische Test in vivo zeigte, dass die konstante Anwendung von LACCE auf das Gesicht und das Hautgewebe die antiperiorbitalen Falten, die Hautelastizität, die Hautdichte und die Hautdicke im Vergleich zum Placebo verbesserte. Die RNA-Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass mindestens 16,56% der menschlichen Gene in Keratinozytenzellen exprimiert wurden. LACCE up-regulierte Gene, die für mehrere KRT-Proteine kodieren; DDIT4, BNIP3 und IGFBP3 waren an der positiven Regulation des Entwicklungsprozesses, dem programmierten Zelltod, der Verhornung und der Verhornung der Hautbarrieren beteiligt, die der menschlichen Haut viele Vorteile bieten. Im Gegensatz dazu waren herunterregulierte Gene stressreaktionsschnelle Gene, einschließlich Metall, Oxidation, Wunde, Hypoxie und Virusinfektion, was darauf hindeutet, dass LACCE keinen schädlichen Stress auf der Haut verursachte. Unsere umfassende Studie hat gezeigt, dass LACCE ein vielversprechendes Mittel für Anti-Aging-Kosmetika ist.

Schlüsselwörter:Anti-Aging; Kallus; Edelweiß;hautzellen;Transkriptom

1. Einleitung

Edelweiss(Leontopodium noble sub sp. Alpinum(Cass.) Greuter) in der Familie der Asteraceae ist eine Wildblume, die an felsigen Kalksteinstellen in großen Höhen, wie den Schweizer Alpen, wächst [1,2]. Aufgrund der Seltenheit seiner kurzlebigen weißen Blüten repräsentiert Edelweiß Schönheit und Reinheit im Zusammenhang mit den Alpen und Karpaten. Darüber hinaus betrachten viele Länder, darunter Österreich, Bulgarien, Rumänien, Slowenien und die Schweiz, Edelweiss als nationales Symbol.

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Edelweiß wird seit langem als traditionelle Medizin gegen Bauchschmerzen, Bronchitis, Durchfall, Ruhr und Fieber eingesetzt [3, A]. In jüngster Zeit haben mehrere Studien die Wirksamkeit von Edelweißextrakten zur Entzündungshemmung bei Mäusen und Ratten [3] und menschlichen Keratinozyten und Endothelzellen [4] gezeigt. Darüber hinaus enthalten die Wurzelextrakte von Edelweiss Bestandteile, die die cholinerge Neurotransmission verbessern, was auf sein Potenzial für Antidemenzmittel [5] und Antioxidantien hinweist, wie z.B.

Leontopodsäure A und 35-Caffeoylchinsäure, die als Anti-Aging-Mittel eingesetzt werden können [6]. Darüber hinaus zeigten die Edelweißextrakte eine antibakterielle Aktivität gegen Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia und Streptococcus pyogenes, was auf ihre mögliche ethnomedizinische Verwendung bei Atemwegs- und Baucherkrankungen hindeutet [7].

Mehrere frühere Studien haben die Verbindungen von Edelweißextrakten analysiert. Zum Beispiel zeigte die Kapillarchromatographie-Methode 12 pharmakologisch wichtige Verbindungen, darunter Flavonoide, Kaffeesäuren und Leontopodsäure, aus den oberirdischen Teilen des Edelweißes [8]. Zur Extraktion von Antioxidantien aus Edelweißpflanzen wurden zentrifugale Trennchromatographie (CPC) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) entwickelt [6]. Es ist bekannt, dass die Wirkstoffe von Edelweißextrakten zwischen den oberirdischen Teilen und Wurzeln vielfältig sind[3]. Zum Beispiel produzieren die behaarten Wurzeln von Edelweiss pharmakologisch aktive Lignane, wie Login und 5-Methoxy-Login, die durch mehrere andere Komponenten wie Silbernitrat, Saccharose, Methyljasmonat und Hefeextrakt stimuliert werden können [9].Cistanche Extract VorteileDarüber hinaus wurden die Stoffwechselmuster von 11 verschiedenen Leontopodium-Spezies durch Kernspinresonanzspektroskopie (1H NMR) und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) in ihrer Taxonomie-Beziehung aufgedeckt [10].

Cistanche könnte Anti-Aging

Pflanzenkallus kann als unorganisierte oder undifferenzierte Zellmassen definiert werden, die leicht durch Verwundung dazu gebracht werden können, eine Pflanzenwunde zu bedecken oder künstlich ein In-vitro-System durchzuführen. Pflanzenkallus wird künstlich kultiviert, indem Nährstoffe und Pflanzenwachstumsregulatoren unter antiseptischen Wachstumsbedingungen hinzugefügt werden. Derzeit ist es möglich, eine hohe Anzahl spezifischer Pflanzenzellen mit gleicher Qualität in einem Bioreaktor herzustellen. Darüber hinaus hat eine Pflanzenzelle eine Fähigkeit, die als Totipotenz bezeichnet wird, was das genetische Potenzial einer Pflanzenzelle ist, die gesamte reife Pflanze zu produzieren [11]. So ist es möglich, aus dem spezifischen Pflanzenkallus eine reife Pflanze zu erzeugen. Darüber hinaus kann Kallus häufig zur Pflanzenregeneration verwendet werden, um seltene und gefährdete Pflanzen zu erhalten [12,13].

Wie tierische Zellen haben Pflanzenzellen die Fähigkeit, die Stimulation und Regeneration von Pflanzen nach Verletzungen zu erleichtern [14]. Obwohl pflanzliche Stammzellen als aufstrebende Materialien in der Kosmetikindustrie gelten, sind die verfügbaren Materialien begrenzt. Es ist wichtig, neue Pflanzenquellen zu identifizieren und ihre funktionellen Komponenten im Zusammenhang mit Kosmetika zu bewerten.

Edelweiss-Extrakte sind bekannt für ihre Verwendung in pharmazeutischen Wirkstoffen; Über die Wirkung von Edelweiss-Extrakt als naturkosmetische Quelle wird jedoch selten berichtet. Hier untersuchten wir die Wirksamkeit von Edelweiss-Kallus-Extrakt (Leontopodium Alpinum Kalluskulturextrakt; LACCE) aus Edelweißblättern unter Verwendung mehrerer Assays von in vitro bis in vivo gewonnen und den molekularen Mechanismus durch LACCE mittels Transkriptomprofiling aufgedeckt.

2. Materialien und Methoden

2.1. Herstellung von Edelweiss Callus

Edelweiss Samen wurden kommerziell eingekauft. Die Edelweißsamen wurden in den 30er Jahren in 70% Ethanol eingeweicht, gefolgt vom Waschen mit destilliertem Wasser. Auch hier wurden die Samen 20 min lang in 0,3% Natriumhypochlorit (Waco, Osaka, Japan) geschüttelt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Samen wurden auf einem basischen Murashige- und Skoog(MS)-Medium (Duchefa Biochemie, Haarlem, Niederlande) gekeimt. Die Edelweißblätter im aseptischen Zustand wurden in kleine Stücke (0,5 bis 1 cm) geschnitten. Wir induzierten das Frühstadium von Pflanzenzellen auf einem MS-Medium, das 0,5-3 mg/ml 6-Benzylaminopurin (6-BAP)(Duchefa Biochemie) und 0,3-1 mg/ml 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D)(Duchefa Biochemie) enthielt, bei Dunkelheit bei 25± 2°C [15]. Der pH-Wert des MS-Mediums wurde mit 1N NaOH (Duchefa Biochemie) auf 5,8 eingestellt. Der induzierte Kallus wurde in der Petrischale vermehrt. Die ausgewählte Kallusleitung wurde in einem Bioreaktor im Anti-Aging Research Institute of BIO-FD&C Co., Ltd., Incheon, Korea, kultiviert. Der kultivierte Kallus wurde geerntet und dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.Cistanche Dschingis KhanDer Kallus wurde mit dem Gefriertrockner (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Korea) gemäß den Anweisungen des Herstellers dehydriert. Der getrocknete Edelweiß-Kallus wurde in destilliertem Wasser bei 50 °C für 8 h gerührt. Kallusextrakte wurden durch Wärmeextraktion bei 98°C für 10 min gewonnen.

2.2. Kultur menschlicher Hautzellen

Die untersuchten Wirkungen von Edelweißextrakten auf menschliche Hautzellen, Keratinozyten(HaCaT)-Zellen und normale menschliche Detroit 551-Fibroblasten (ATCC, Manassas, VA, USA) wurden in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)(Welgene, Gyeongsan-si, Korea) kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und 1% antimykotisch (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bei 37 °C mit einem CO2-Zustand von 5%.

2.3. Beurteilung der Stoffwechselaktivität der Zellen durch MTT-Assay

Um die Zytotoxizität von LACCE auf das Zellwachstum, die Ausbreitung und das Überleben menschlicher Hautzellen zu beurteilen, wurde wie zuvor beschrieben ein MTT(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay durchgeführt[16,17]. Kurz gesagt, HaCaT- und Detroit 551-Zellen mit einer Dichte von 5×10* Zellen pro Well wurden 24 Stunden lang in einer 96-Well-Platte inkubiert.Danach wurden Endkonzentrationen von 0,1%, 0,5% und 1% LACCE für 24 Stunden behandelt. Destilliertes Wasser wurde als Kontrolle verwendet. Nach der Behandlung von LACCE wurde das Medium entfernt, gefolgt von der Zugabe von 4 μL 5 mg / ml MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und für 4h inkubiert. Nach dem Entfernen des Mediums wurden 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO)(Sigma) zugegeben und für 10 min gelöst.Cistanche LebensverlängerungDie Wellenlängenabsorption wurde bei 570 nm mit einem Thermo Scientific Multiskan GO Mikroplatten-Spektralphotometer (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Finnland) gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit der folgenden Formel erhalten. Zelllebensfähigkeit (%)=(die Menge der Absorption für behandelte Zellen/die Menge der Absorption von Kontrollzellen)× 100.

2.4. Beurteilung der antioxidativen Aktivität durch DPPH-Assay

Die antioxidative Aktivität von LACCE wurde in einem DPH-Assay (2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazin-hydrat) gemessen, wie zuvor beschrieben [18]. Kurz gesagt, 0,1 ml Endkonzentrationen von 0,1%, 0,5% und 1% LACCE wurden in 0,1 ml 0,1 mM DPPH (Sigma-Aldrich) in Gegenwart von 0,4 ml Ethanol behandelt. Wir verwendeten 0,001% Ascorbinsäure (Vitamin C)(Sigma-Aldrich) als Positivkontrolle. Die Proben wurden für 10s gut gemischt und bei Raumtemperatur bei Dunkelheit für 30 min inkubiert. Die Wellenlängenabsorption wurde bei 517 nm mit einem Thermo Scientific Multiskan GO Mikroplatten-Spektralphotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. Die radikale Fängeraktivität wurde mit der folgenden Formel berechnet. Fängeraktivität (%)=[1-(Absorption der Probe / Absorption der Kontrolle)]×100.

2.5. Bewertung der antioxidativen Aktivität durch Wasserstoffperoxid(H2O2)-Assay

Wasserstoffperoxid produziert sauerstofffreie Radikale in Zellen, was zum Zelltod führt. Wir testeten die durch Wasserstoffperoxid verursachte Zellsterblichkeitsrate in LACCE-behandelten Proben. HaCaT-Zellen mit einer Dichte von 5×105 Zellen pro Bohrloch wurden 24 Stunden lang in einer 24-Well-Platte inkubiert. Danach wurden Endkonzentrationen von 0,1%, 0,5% und 1% LACCE in Gegenwart von 1 mM H, O, für 8h behandelt. Als Positivkontrolle wurden 0,033% NAC (Sigma-Aldrich) verwendet. Ein MTT-Assay wurde verwendet, um die Zellüberlebensrate von LACCE-behandelten Proben zu messen, die durch HO2 verursacht wurden. Darüber hinaus beobachteten wir die Zellmorphologie durch Methylenblaufärbung (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

2.6. Real-Time Reverse Transcription (RT)-PCR

Um die Wirkung von LACCE auf Anti-Falten-, Feuchtigkeits- und entzündungshemmende Mittel zu untersuchen, haben wir eine Echtzeit-RT-PCR mit bekannten Primern durchgeführt, die Markergene unter Verwendung von QuantiTect Primer Assays (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifizieren. Detroit 551 Zellen mit einer Dichte von 5×104 Zellen pro Bohrloch wurden in einer 96-Well-Platte für 24 Stunden inkubiert. Danach wurden endgültige Konzentrationen von 0,1%, 0,5% und 1% LACCE für 24 h behandelt. cDNA wurde aus den jeweiligen Detroit 551-Zellen synthetisiert, die mit unterschiedlichen LACCE-Konzentrationen behandelt wurden, wobei ein SuperPrep Cell Lysis & RT Kit für qPCR (Toyobo, Osaka, Japan) verwendet wurde, das Lysereagenzien und RT-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers enthielt. Für die Anti-Falten-Wirkung bei der LACCE-Behandlung wurde die Expression des Gens, das für die Matrix-Metalloproteinase-2 (MMP-2) kodiert, mittels Echtzeit-RT-PCR unter Verwendung eines Thunderbird SYBR qPCR Mix-Kits (Toyobo) basierend auf den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Für die Bewertung der Befeuchtung durch LACCE-Behandlung wurde die Expression des Gens, das für Aquaporin 3 (AOP3) kodiert, mittels Echtzeit-RT-PCR untersucht. Im Falle des entzündungshemmenden Assays wurden HaCaT-Zellen mit einer Dichte von 5×104 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte für 24h inkubiert. Nach dem Entfernen des Mediums wurde UVB auf die HaCaT-Zellen bestrahlt. Für die UVB-Bestrahlung wurden 5 mJ/cm' von einer CL-1000 UV-Box (Analytik Jena AG, Jena, Deutschland) verwendet. Danach wurden endgültige Konzentrationen von 0,1%, 0,5% und 1% LACCE für 4 Stunden behandelt. Wir verwendeten Dexamethason(Dex)(Sigma-Aldrich) als Positivkontrolle. Für die entzündungshemmende Wirkung der LACCE-Behandlung wurde die Expression von Genen, die für COX2 bzw. iNOS kodieren, durch Echtzeit-RT-PCR quantifiziert. Die Expression einzelner Gene wurde auf GAPDH-Genexpression normalisiert. 2.7. Klinische Bewertung von LACCE als Wirkstoff für Kosmetika in Vioo

Eine klinische Studie zur Bewertung der Wirksamkeit von LACCE auf das Gesichtslifting und die Verbesserung der periorbitalen Falte, der Hautelastizität, der Hautdichte und der Hautdicke wurde von der Firma Ellead nach der Zulassung von Ellead IRB auf der Grundlage von Standardarbeitsanweisungen (Ver. 3.0) (Ellead, Seongnam, Korea) gemäß der Korea Good Clinical Practices-Richtlinie (B1-2015-4-002), die vom Ministerium für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit (MFDS) beschrieben wurde, und Ellead Standard Operating Procedures (EL-P-7400) durchgeführt.

Um die Wirkung von LACCE in vivo zu untersuchen, führten wir eine klinische Bewertung von LACCE für vier verschiedene Faktoren durch: Gesichtslifting und Verbesserung der periorbitalen Falten, Hautelastizität, Hautdichte und Hautdicke. Dazu nahmen insgesamt 21 weibliche Freiwillige mit durchschnittlich 48,04 ± 4,28 Jahren, die weiter in 12 Freiwillige im Alter von 40 Jahren und neun Freiwillige im Alter von 50 Jahren unterteilt wurden, über vier Wochen an der klinischen Bewertung teil.

Der klinische Test wurde zu drei verschiedenen Zeitpunkten, dem Ausgangswert, 2 Wochen und 4 Wochen, für alle Freiwilligen durchgeführt. Von einer Woche vor Beginn der Studie bis zum Ende unterzogen sich alle Freiwilligen keinen zusätzlichen Behandlungen zur Verbesserung von Haut, Kosmetika und Hygienehilfen, die die Ergebnisse hätten beeinflussen können. Nach dem Waschen der Gesichter der Freiwilligen mit dem Reinigungsschaum standen die Freiwilligen mindestens 30 Minuten in einem kontrollierten Raum mit konstanter Temperatur (20-24 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40% -60% relative Luftfeuchtigkeit). Wir führten die Messung zufällig auf der linken oder rechten Seite der Gesichter der Freiwilligen durch. Unser Test war ein Doppelblindtest, bei dem weder die Probanden noch die Forscher wussten, welches Produkt ein Testmuster war. Formulierungen zur Berechnung der verringerten und erhöhten Raten wurden in Tabelle 1 beschrieben.

2.8. Messung des Gesichtsliftings und Verbesserung der periorbitalen Falten

Zu Beginn wurden periorbitale Falten, Hautelastizität, Hautdichte, Hautdicke auf der Wange und Gesichtslifting im Mundwinkel für alle Freiwilligen gemessen. Danach wurden zwei verschiedene Proben, LACCE und Placebo (Kontrolle), zweimal täglich (morgens und abends) auf den vorgesehenen Bereich des Gesichts aufgetragen. Die Freiwilligen wurden in zwei verschiedene Gruppen eingeteilt, eine Gruppe I (LACCE wurde auf den linken Gesichtsbereich angewendet, während das Placebo auf den rechten Gesichtsbereich aufgetragen wurde) und Gruppe II (das Placebo wurde auf den linken Gesichtsbereich aufgetragen, während LACCE auf den rechten Gesichtsbereich aufgetragen wurde). Zwei und vier Wochen nach der Behandlung wurden die gleichen Messungen durchgeführt, um die Wirkung von LACCE im Vergleich zu der des Placebos zu bewerten.

Periorbitale Falten wurden mit dem optischen 3D(dimension) Hautmesssystem PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, USA) analysiert, das sich ideal für die Untersuchung der Hautmikrostruktur und -falten eignet. Zwei verschiedene Rauheitsparameter, Ra (durchschnittliche Rauheit), der der Durchschnitt der absoluten Werte der Profilhöhen des Rauheitsprofils ist, und Rg (Root Mean Square Roughness), der der mittlere quadratische Durchschnitt der Profilhöhen des Rauheitsprofils ist, wurden gemessen.

Dieser Artikel ist extrahiert aus Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes