Antiallergische und entzündungshemmende Wirkung von Neferin auf RBL-2H3-Zellen Plus

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3. Diskussion

Die Pathogenese der atopischen Dermatitis (AD) ist nicht vollständig geklärt, aber die Krankheit wird durch eine abnormale Immunantwort des Immunglobulins E (IgE) bei einer Dysfunktion der Hautbarriere vermittelt. Unter ihnen können Mastzellen (MC) IgE-vermittelte allergische Erkrankungen, einschließlich AD, verursachen. Wenn Mastzellen aktiviert werden, setzen sie ihre membrangebundenen zytoplasmatischen Partikel frei, was zur Freisetzung einer Vielzahl von Molekülen führt. Diese Moleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von AD und der Wirtsabwehr [27]. Da die Hemmung der Aktivierung oder Degranulation von Mastzellen hilft, verschiedene IgE-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktionen zu regulieren, sind Mastzellen eines der idealen Ziele für die Erforschung antiallergischer Medikamente. In unserer Studie werden Mastzellen als Reaktion auf die Verbindung 48/80 und das Calciumionophor A23187 und Anti-DNP/IgE plus DNP/HSA degranuliert. Wir fanden heraus, dass die Referenz den Degranulationseffekt von Mastzellen wirksam hemmte, was ihre antiallergische Reaktion zeigt. Darüber hinaus wurde der Anstieg des intrazellulären Calciums und die Aktivierung von MAPK durch Referenz gehemmt. Darüber hinaus wurde auch die durch DNCB verursachte Haut-Mastzell-Infiltration und das durch Verbindung 48/80 verursachte Kratzverhalten reduziert. Daher hat der Mechanismus der antiatopischen Dermatitis von Neferin eine Multiplikatorwirkung auf Keratinozyten und Mastzellen.

La patogenia de la Dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de the inmunoglobulina E (IgE) en the disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades aérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variiertad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. In nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en repuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracellular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la Dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

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Das Zytoplasma von Mastzellen in Geweben ist mit großen, dichten Partikeln vorgeformter Entzündungsmediatoren gefüllt[28]. Der Prozess der Freisetzung dieser Mediatoren aus den sekretorischen Granula in Mastzellen wird als Degranulation bezeichnet. Da die Hemmung der Mastzelldegranulation verschiedene IgE-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktionen regulieren kann, sind Mastzellen eines der idealen Ziele für die Erforschung antiallergischer Medikamente [29,30]. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Referenz unabhängig von der Verwendung von Antigen, Rezeptorstimulator oder Ionophor eine sehr gute Wirkung auf die Degranulation von Mastzellen hat. Dies zeigt, dass es sich bei der Referenz um ein potenzielles Antiallergikum handelt (Abbildung 2).

Alle vorgelagerten Granulate, neu synthetisierte Mediatoren und sogar Granulate und ihre Bestandteile können als MC-Aktivierungsindikatoren verwendet werden [31]. Darüber hinaus ist die Standardmethode die Messung der intrazellulären Ca4t-Konzentration. Die meisten im Labor allgemein verwendeten MC-Sekretagoga (z. B. Antigen, Verbindung 48/80) bewirkten eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Tatsächlich kann der Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration auch eine MC-Degranulation auslösen. Normalerweise wird der Anstieg des intrazellulären Ca4t durch die Aktivierung von MC mit Verbindungen wie Thapsigargin (blockiert speziell Sarco/endoplasmatisches Ca2 plus ATPase, SERCA) und Ionophoren (dh Ionomycin und A23187) [32,33] induziert. Daher wird bei der Ca2t-abhängigen MC-Aktivierung die Messung des Ca2t-Einstroms auch als Methode zur Bestimmung der MC-Aktivierungsbedingungen angesehen. In der MC-Forschung wird Fura-2 häufig zur Bestimmung intrazellulärer Ca2-Plus-Änderungen verwendet. In unseren Experimenten fanden wir heraus, dass die Fluoreszenzintensität von aktivierten Mastzellen signifikant unterdrückt wurde, nachdem sie mit Referenz behandelt wurden (Abbildung 3). Frühere Berichte zeigten, dass der Anstieg der intrazellulären Ca4t-Konzentration mit der Freisetzung von Histamin einherging [34]. Daher schließen wir, dass die Freisetzung von Histamin auch durch die Referenzbehandlung gehemmt wird. Weitere Experimente sind gerechtfertigt, um diese Hypothese zu verifizieren.

Mastzellen haben signifikant unterschiedliche funktionelle Ausgänge.Cistanche-Dosierung redditDazu gehören Degranulation, Bildung von Arachidonsäure-Vorläufern, Chemotaxis und Zytokinproduktion, die alle bis zu einem gewissen Grad von den Calciumsignalen abhängig sind, unabhängig von Stimulanzien [32] Aktivierte MC setzt Zytokine frei, die die Hauptmediatoren von Allergien und entzündlichen Erkrankungen sind [ 35]. Die Produktion von Zytokinen durch aktivierte Mastzellen ist das Ergebnis der Induktion der Zytokin-Gentranskription in diesen Zellen. Die Stimulation von Mastzellen führt zur Aktivierung von NF-kB und AP-1 und zur Produktion vieler Zytokine [36]. MAPK-Kaskaden-Signalwege spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulation der Expression von Zytokinen. Die Aktivierung dieser Signalwege durch die Aktivierung von PKC durch PI führt zur Aktivierung verschiedener Gene, einschließlich entzündlicher Zytokin-Gene wie IL-1 , IL-6 und TNF [37]. Unsere jüngsten Studien haben gezeigt, dass Referenz die durch die Aktivierung von Keratinozyten freigesetzten Zytokine hemmen kann. Gleichzeitig fanden wir auch heraus, dass die Signalwegaktivierung von MAPK auch durch die Referenzbehandlung gehemmt wird [18]. In unserer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass die Referenz auch die Expression von Zytokinen durch die Hemmung der MAPK-Aktivierung in Mastzellen reduzieren kann (Abbildungen 4 und 5). Auch die Aktivierung von NFkB wird durch die Hemmung der MAPK-Aktivierung reduziert (Abbildung 6).

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Eine Reihe von Studien haben berichtet, dass eine Vielzahl von Zytokinen bei AD-Patienten erhöht sind, was zu einer Funktionsstörung der Hautbarriere führt, einschließlich Zytokine, die von Keratinozyten ausgeschieden werden, und von Th2- abgeleitete Zytokine [38,39]. Darüber hinaus wird berichtet, dass diese sezernierten Zytokine auch die Expression von Tight Junction (T)-Proteinen und terminalen Differenzierungsgenen, einschließlich Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) und Involucrin (IVL) herunterregulieren können [39,40 Die ](Pro)filaggrin-Expression ist bei AD verringert und steht in umgekehrtem Zusammenhang mit MC-Tryptase und IL-6[41]. IL-1 vermittelt chronische Entzündungen bei Mäusen mit gestörter Hautbarriere [35]. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass die Expression von FLG, IVL und LOR nach der Anwendung von DNCB auf der Rückenhaut von NC/Nga-Mäusen herunterreguliert wurde [42,43]. In der vorliegenden Studie waren die Expressionen von FLG, IVL und LOR in der Rückenhaut der Kontrollgruppe erheblich reduziert, was auf eine Beeinträchtigung der epidermalen Barriere hinweist. Die Referenzverabreichung stellte die verminderten Expressionen von FLG, IVL und LOR nach der Behandlung mit DNCB signifikant wieder her, während die Referenzverabreichung die Expressionen von IVL und LOR im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht erhöhte ( 8 ). Es ist bekannt, dass Verbindung 48/80 ein wirksamer Aktivator von Hautmastzellen ist. Die durch die Verbindung 48/80 stimulierte Hautreaktion kann durch die Freisetzung von Histamin aus Mastzellen ein Kratzverhalten induzieren [44]. Aus aktivierten Mastzellen freigesetztes Histamin spielt eine wichtige Rolle bei der durch Verbindung 48/80 verursachten Erhöhung der Gefäßpermeabilität. Bei menschlichem Juckreiz wird auch Histamin berücksichtigt, das durch verschiedene Stimuli aus Mastzellen freigesetzt wird. hat sich zu einem wichtigen Vermittler entwickelt. Daher ist die Hemmung der Degranulation von Mastzellen ein wichtiger Schritt bei der Regulierung der Histaminfreisetzung während des Kratzverhaltens. In dieser Studienverbindung verursachte 48/80 eine effektive Aktivierung von Hautmastzellen. Die Vorbehandlung mit Referenz reduzierte jedoch signifikant den Degranulationsgrad von Mastzellen (Abbildung 2).Cistanche-Extrakt VorteileDiese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der kratzfeste Verhaltenseffekt der Referenz auf die Verringerung der Gefäßpermeabilität durch Regulierung der Mastzellendegranulation zurückzuführen sein kann (Abbildung 9).

Es ist allgemein bekannt, dass AD-Patienten an Hautbarrierestörungen, Hautentzündungen oder beidem leiden, so dass es schwierig ist, geeignete Behandlungsmethoden zu finden. Daher wird in der Regel eine Kombinationstherapie empfohlen. Unsere jüngsten Forschungen haben bewiesen, dass es niemals eine immunmodulatorische Funktion und Barrierereparaturfähigkeit hat. Daher ist die Aufrechterhaltung der Hautfunktion und die Verbesserung der Hautfeuchtigkeit und Barrierereparatur ein wichtiges Referenzmerkmal in der AD-Behandlung in der Zukunft. Die Referenz kann auch das durch Allergene und Reizstoffe induzierte Kratzverhalten reduzieren. Darüber hinaus ist der atopische Marsch eine phänomenbedingte Erkrankung, die Schritt für Schritt auftritt und fortschreitet. Atopische Dermatitis tritt häufig im Säuglingsalter auf. Nahrungsmittelallergien treten häufig nach dem 1-2 Lebensjahr auf. Allergische Rhinitis kann oft vor und nach der Schule beginnen. Asthmasymptome treten zu unterschiedlichen Zeiten auf, die meisten treten jedoch nach allergischer Rhinitis auf. Nach der Kindheit können sich atopische Dermatitis und bestimmte Nahrungsmittelallergien bessern oder verschwinden. Allergische Rhinitis und Asthma sind nicht leicht zu heilen [45,46]. Daher sind sie komorbide Phänomene bei Krankheiten. Naturstoffe, einschließlich Referenzen, haben das therapeutische Potenzial von Komorbidität, und ihre Wirksamkeit bei verwandten Krankheiten ist es wert, in Zukunft untersucht zu werden.

4. Materialien und Methoden

4.1. Basophile Leukämiezellen der Ratte

Basophile Leukämiezellen der Ratte (RBL-2H3) waren ein Geschenk von TLHwang, Chang Gung University, Taoyuan, Taiwan. RBL-2H3-Zellen sind mukosale Mastzellen, die verwendet werden, um Antigen- oder Calciumionophor-induzierte Degranulation, intrazelluläres Ca4t und Signaltransduktion zu untersuchen [29]. Die Zellen wurden in EMEM kultiviert, das 10 Prozent FBS enthielt, mit Penicillin und Streptomycin bei 37 Grad, 5 Prozent CO2. Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IM) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, USA) bezogen.

4.2.MTT-Assay

Zur Messung wird der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl-2H-Tetrazoliumbromid (MTT)-Assay verwendet die Stoffwechselaktivität der Zellen. RBL-2H3-Zellen wurden in einer 24-Well-Kulturplatte mit 5 × 10 plus/Well ausgesät. Nach 24-stündiger Arzneimittelbehandlung wurden 30 ul MTI pro Vertiefung zugegeben und für 2-4 h in einen Zellinkubator mit 37 Grad gestellt, dann wurden violette Formazan-Kristalle mit DMSO gelöst. Ein ELISA-Lesegerät wurde verwendet, um die Absorptionsintensität bei einer Wellenlänge von 550 nm als Zelllebensfähigkeitstest zu messen.

4.3.Messung des intrazellulären Ca2 plus-Spiegels

[Ca2t] I wurde wie zuvor beschrieben mit Fura-2 gemessen[47]. RBL-2H3-Zellen wurden in IMDM, das 5 uM Fura 2-AM und 1,2 mM CaClz enthielt, bei 37 Grad für resuspendiert 30 Minuten. Nach Fura-2-Beladung wurden Keratinozyten pelletiert und in frischem DMEM resuspendiert. Ein Aliquot (2 ml) wurde in eine gerührte Küvette überführt, die 1,2 mM CaClz enthielt. Die Fura-2-Ca-Fluoreszenz wurde bei den Anregungswellenlängen von 340 und 380 nm (Emissionswellenlänge 505 nm) in einem PerkinElmer LS{{19) untersucht }} Spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Die Daten wurden in 5s-Intervallen aufgezeichnet[47].

4.4. Quantitative Polymerkettenreaktion (qPCR)

RBL{{0}}H3-Zellen wurden in eine 3,5-cm-Kulturschale gepflanzt. Nachdem die Zellen zu 90 Prozent voll gewachsen waren, wurden die Zellen 24 h in einem statischen Zustand gezüchtet. Nachdem die Zellen 20 min lang mit Referenz vorbehandelt worden waren, wurden sie mit TNF-a/IFN-y für 1 bzw. 24 h stimuliert. Die Zellen wurden abgekratzt, zentrifugiert (16,000×g, 10 min, 4 Grad) und der Überstand wurde extrahiert. RNA wurde unter Verwendung eines Gesamt-RNA-Isolierungskits (GeneDirex®, Vegas, NV, USA) gereinigt. Gemäß dem Betriebsverfahren des Skript-cDNA-Synthesekits (BIO-RAD) wurden die Reagenzien der Reihe nach hinzugefügt und gemäß den angegebenen Bedingungen betrieben, um RNA in cDNA umzuwandeln. Darüber hinaus wurde PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM) verwendet. Insgesamt 7,5 ul ddH20, 2 ul cDNA, 0,25 ul Forward- und Reverse-Primer und 10 ul SYBR GREEN wurden zugegeben und gleichförmig gemischt. Die Primersequenzen sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Anschließend wurde die RNA mit dem ABI StepOnePlusTM Real-time PCR System quantifiziert.

4.5. Western-Blot-Assay

Western Blotting wird verwendet, um die Veränderungen verschiedener Proteine ​​in Zellen zu analysieren. RBL{{0}}H3-Zellen wurden in eine 3,5-cm-Kulturschale ausgesät. Nachdem die Zellen zu 90 Prozent voll gewachsen waren und 24 Stunden lang hungern gelassen wurden, wurden sie 20 Minuten lang mit Referenz vorbehandelt und dann 30 Minuten lang bzw. 1 Stunde lang mit TNF-a oder IFN-y stimuliert. Nach dem Schaben wurden sie durch Ultraschall pulverisiert und zentrifugiert (13.200 U/min, 10 min, 4 Grad). Nach der Zentrifugation wurde der Überstand genommen und das Protein wurde mit einem Pierce Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) quantifiziert. Es wurde auf 10 % SDS-Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und dann mit einer PVDF-Membran elektroporiert. Nachdem der Transfer abgeschlossen war, wurde die PVDF-Membran in eine TBS-T-Lösung (Tris-gepufferte Kochsalzlösung/0,05 Prozent Tween 20) gegeben, die 5 Prozent Magermilchpulver enthielt, und 1 Stunde lang geschüttelt, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. Dann wurde TBS-T verwendet, um 3 Mal für jeweils 10 Minuten zu waschen. Dann wurden primäre Antikörper (Verdünnung 1:1000) zugegeben und über Nacht bei 4 Grad gehalten und dann alle 10 min dreimal mit TBS-T gewaschen. Nach Zugabe von sekundären Antikörpern (1:1000 verdünnt) für 1 h wurde die PVDF-Membran 3 mal mit TBS-T für jeweils 10 min gewaschen. Abschließend wurde der Entwickler zugegeben und die Membran zum Schießen in ein chemisches Lumineszenz-Extraktionssystem (BIOSTEP Celvin") gegeben.

4.6.Dinitrochlorbenzol(2,4-Dinitrochloroben2ene, DNCB)induzierte atopische Dermatitis-ähnliche Hautentzündung bei Mäusen

Zuerst wurden die Mäuse in vier Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe, DNCB-Gruppe (negative Gruppe), Referenz (3 mg/kg und 1 0 mg/kg) mit DNCB-Gruppe und Dexamethason (0,2 mg/kg) mit DNCB-Gruppe (positive Gruppe). Dexamethason ist ein Kortikosteroidhormon, das Schwellungen und allergische Reaktionen reduzieren kann. In diesem In-vivo-Experiment wurden sowohl Referenz als auch Dexamethason in DMSO gelöst, während DNCB durch Ultraschallschock in 75-prozentigem Ethanol gelöst wurde. Ersteres wurde durch intraperitoneale Injektion verabreicht, und für letzteres wurden 100 &mgr;l auf die hintere Haut und 20 &mgr;l auf das rechte Ohr aufgetragen. Drei Tage vor dem Experiment wurden die Mäuse betäubt, die Rückenhaare entfernt und ein kleiner Messmagnet (SCT-MAG-TF) auf der Rückseite der Hinterfüße der Maus eingebettet.Cistanche Dschingis KhanNach drei Tagen Ruhen wurde bestätigt, dass die Mäuse in guter körperlicher Verfassung waren und die Haut auf dem dorsalen Enthaarungsbereich normal war, und das Experiment wurde gestartet. Während des Experiments wurden Fotos gemacht, um die Erscheinungsveränderungen der Haut aufzuzeichnen. Das erste Stadium ({{0}} Tage) war der Zeitraum der allergischen atopischen Dermatitis. Nach Messung der Grundwerte von Mäusen in der DNCB-Gruppe, der Referenz- (3 und 10 mg/kg) und DNCB-Versuchsgruppe und der Dexamethason-0,2-mg/kg- und DNCB-Versuchsgruppe wurde 1 Prozent DNCB gleichmäßig auf die Rückenhaut aufgetragen und rechtes Ohr. Am fünften Tag wurden die Arzneimittelreferenz und Dexamethason intraperitoneal injiziert. Die zweite Stufe (Tag 5 bis Tag 14) war die Reinduktion der atopischen Dermatitis.cistanche lebensverlängerungIn den 3 Versuchsgruppen wurde 0,5 % DNCB gleichmäßig auf die Rückenhaut und das rechte Ohr der Mäuse geschmiert. Am nächsten Tag wurden die physiologischen Werte und Bilder der Haut aufgenommen und protokolliert. Nachdem die Mäuse am 15. Tag mit überschüssigem Kohlendioxid (CO2) eingeschläfert worden waren, wurde das Rückenhautgewebe für die anschließende experimentelle Analyse entfernt.

4.7.Verbindung 48/80-induziertes Kratzverhalten bei BALB/c-Mäusen

Das Haar der Haut auf dem Rücken der Maus wurde geschnitten und 2 0 μl der Lösung der Verbindung 48/80 wurden intrakutan injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten stattdessen Kochsalzinjektionen. Unmittelbar nach der Injektion wurde das Tier in einen Beobachtungskäfig (Durchmesser 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokio, Japan) gesetzt und das Kratzverhalten der Maus automatisch und objektiv erfasst und ausgewertet. Das Kratzverhalten wurde für 60 min gemessen. MicroAct verwendet die folgenden Analyseparameter, um Wellen zu erkennen, die dem kontinuierlichen Kratzverhalten von Mäusen entsprechen: Schwelle, 0,05 V; Ereignislücke, 0,05 s; Mindestdauer 0,25 s; maximale Frequenz 30 Hz; minimale Frequenz, 5Hz. 4.8.Statistische Analyse

Für die statistische Analyse wurde die Sigma-Plot-Software (Version 10.0) verwendet.cistanche nzDie Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt, mit (*) und (#) als Anmerkungen. Die statistische Signifikanz der Daten wurde durch ungepaarte, zweiseitige Student-t-Tests analysiert. p-Werte kleiner als 0.05 und 0,01 wurden als signifikant betrachtet.

5. Schlussfolgerungen

In dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Referenz die Degranulation von Mastzellen wirksam hemmt und die Expression von entzündungsfördernden Zytokinen reduziert, die atopische Dermatitis-ähnliche Symptome reduzieren, die Hautbarriere wiederherstellen und Hautkratzer reduzieren können. Wir haben weiterhin bewiesen, dass Referenz nicht nur auf die Keratinozyten der Haut einwirken kann, sondern auch die Aktivierung von Mastzellen beeinflussen kann. Es hat ein größeres Anwendungspotenzial bei allergischen und entzündlichen Hauterkrankungen.

Dieser Artikel ist aus Int. J.Mol. Wissenschaft. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms