Antitimelanogenese-Effekte von Blattextrakt und sekundären Pflanzenstoffen aus der Ceylon-Olive (Elaeocarpus serratus) im Zebrafisch-Modell
Mar 23, 2022
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Chi-Ya Huang 1, I-Hsuan Liu 2, Xiang-Zhe Huang 1, Hui-Jen Chen 1, Shang-Tzen Chang 1, Mei-Ling Chang 3, Yu-Tung Ho 1 und Hui-Ting Chang 1,*
Abstrakt:DasMelanogeneseHemmwirkung beim Zebrafisch (Danio rerio) uAntityrosinaseAktivität der ethanolischenExtraktund seine sekundären Pflanzenstoffe aus Blättern der Ceylon-Olive (Elaeocarpus serratus Linn.) wurden in dieser Studie untersucht. Unter dem Blattextrakt und den vier löslichen Fraktionen zeigt die in Ethylacetat lösliche Fraktion die beste Antityrosinase undAntimelanogeneseAktivitäten. Eine Phenolsäure, Gallinsäure, und zwei Flavonoide, Myricetin und bedeutet Zinn, werden aus den aktiven Subfraktionen durch die Bioassay-geführte Isolierung isoliert; ihre Strukturen werden basierend auf 1D- und 2D-NMR-, FTIR-, UV- und MS-spektroskopischen Analysen aufgeklärt. Diese Verbindungen haben erheblicheAntityrosinaseAktivität bei Verwendung von L-Tyrosin oder L-DOPA als Substrat; Mearnsentin zeigt die optimale Aktivität. In der enzymkinetischen Untersuchung sind sowohl Gallussäure als auch Mearnsetin die Inhibitoren vom kompetitiven Typ gegen Pilz-Tyrosinase, und Myricetin wirkt als MischtypTyrosinaseInhibitor. BlattExtraktund eine in Ethylacetat lösliche Fraktion zeigen eine wirksame Leistung bei der Hemmung der Melaninbildung in Zebrafischembryos. Mearnsetin besitzt auch eine vielversprechende antimelanogene Wirkung, die der Positivkontrolle überlegen ist,Arbutin. Die Ergebnisse zeigen, dass der Ceylon-Olivenblattextrakt und seine sekundären Pflanzenstoffe, insbesondere Mearnsetin, das Potenzial haben, als verwendet zu werdenAntimelanogeneseund hautaufhellende Inhaltsstoffe.
Schlüsselwörter: antimelanogenetische Wirkung; Elaeocarpus serratus; Melanin; Tyrosinase-Inhibitor; Zebrafisch
Herba-Zistanzenhemmt die Tyrosinase-Aktivität.
1. Einleitung
Melanin spielt eine wesentliche Rolle bei vielen biochemischen Funktionen; es schützt die Haut vor UV-Schäden, der Eliminierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und anderen biochemischen Reaktionen [1–3]. Die übermäßige Ansammlung von Melanin führt auch zu Hyperpigmentierung, Melasma, Altersflecken, Hautverdunklung usw. [4,5]. In der östlichen Welt interessiert sich die Frage nach dem Bleicheffekt der Haut; Die Kosmetikindustrie widmet sich der Entwicklung von hautaufhellenden Kosmetika gegen Melanogenese. Es gibt mehrere Mechanismen, einschließlichTyrosinaseHemmaktivität, Entfernung von Melanozyten und Störung der Melaninsynthese, um Melanogenese-Hemmaktivität zu zeigen. Die vielversprechenden Reagenzien zur Hemmung der Melanogenese wurden seit den 1940er Jahren untersucht [2,4,6,7]. Allerdings TeilMelanogeneseInhibitoren haben einige Nebenwirkungen, z. B. kann Hydrochinon exogene Ochronose und permanente Hypomelanose verursachen [5,8]. Überschüssige Kojisäure kann zu Allergien und Schilddrüsentumoren führen [9,10].
Kürzlich haben sich Forscher der Suche nach vielversprechenden melanogenen Reagenzien ohne/mit geringen Nebenwirkungen von pflanzlichen Naturprodukten gewidmet [11–13]. NatürlichTyrosinaseInhibitoren aus pflanzlichen Quellen wurden berichtet, darunter einfache Phenole, Phenolsäuren, Stilbene, Flavonoide, Lignane, Terpenoide, Chinoide usw. [2,14–16]. Solanoet al. stellten fest, dass phenolische Verbindungen und die anderen natürlichen Verbindungen das große Potenzial zur Hemmung von Formelanin haben, z ].Arbutinwird häufig als Hauptbestandteil kommerzieller Aufhellungsprodukte auf dem Markt verwendet [4,17].Gallocatechin-3-O-Gallat (GCG), Epigallocatechin-3-O-Gallat (EGCG) und Epicatechin {{6 }}O-Gallat (ECG) wurden im grünen Tee identifiziertExtrakt; diese Verbindungen besitzen eine gute tyrosinasehemmende Wirkung [17]. Arctigenin, ein aus Fructus arcticextract isoliertes Lignan, könnte den Melaningehalt von Zebrafischembryonen (Danio rerio) reduzieren [18]. Lee uMelanogenesedes Zebrafischembryos; Die aktiven Ginsenoside sind Ginsenosid Rh6, Vina-Ginsenosid R4, Vina-Ginsenosid R13, Ginsenosid Rh23 und Blumenginsenosid A [19–21].
Elaeocarpus serratus Linn. (Tiliaceae), allgemein als Ceylon-Olive bezeichnet, ist in Afrika, Australien und Südostasien verbreitet. Die Essiggurke aus der essbaren Frucht der Ceylon-Olive ist in Sri Lanka weit verbreitet [22]. In Sri Lanka wird es traditionell zur Vorbeugung von Kopfläusen und Schuppen eingesetzt. Bioaktivitäten von E. serratus-Extrakt wurden in den verwandten Studien bewertet [22,23]. E. serratus-Blattextrakt besaß eine antibakterielle Aktivität gegen Plesiomonas, Salmonella typhi und Proteus spp. bei einer Konzentration von 400 µg/ml durch den Platten-Loch-Diffusionsassay [23].E. Serratus-Blattextrakt hatte das Potenzial, ein Antitumor-, antimikrobielles und pestizides Reagenz in der Zytotoxizitätsuntersuchung von Salzgarnelen (Artemia salina)-Letalitätsassay zu sein; theLC50 des BlattesExtraktbetrug 40 µg/mL gegen die Salinenkrebse [23]. Antioxidative Flavonolglycoside, einschließlich Myricitrin, Mearnsetin 3-O- -D-Glucopyranosid, Mearnsitrin und Tamarixetin 3-O- -L-Rhamnopyranosid, wurden aus dem E. serratus-Blattextrakt isoliert und identifiziert [22].
Die Ziele dieser Studie sind die Bewertung der Wirkungen von E. serratus-BlätternExtraktandits Brüche aufAntityrosinaseAktivität (in vitro) undMelanogeneseHemmungsaktivität in Zebrabärblingen (in vivo). Bioassay-geführte Fraktionierungs- und Isolierungstechniken wurden durchgeführt, um die vielversprechenden Verbindungen als potenzielle Antimalanogenese-Inhaltsstoffe zu finden. Die Entwicklung wirksamer antimelanogeneser Inhaltsstoffe kann die optimale Verwertung pflanzlicher Naturprodukte in der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie steigern.
2. Materialien und Methoden
2.1. Pflanzenmaterial und Extraktion
Ceylon-Olive (Elaeocarpus serratus), etwa 50 Jahre alt, Blätter wurden im September von der National Taiwan University, Taipei, Taiwan, gesammelt. Frische Blätter (3,95 kg) wurden mit 95-prozentigem Ethanol 7 Tage lang bei Raumtemperatur extrahiert. Die gefiltertExtraktwurde am Rotationsverdampfer bei einer Badtemperatur von 50 ◦C im Vakuum getrocknet [24]. Die Ausbeute an Blattextrakt (0,32 kg) betrug 12,0 Prozent (w/w des Trockengewichts).
ZistancheExtrakt
2.2. Flüssig-Flüssig-Trennung
DasExtraktwurde einer sukzessiven Extraktion mit organischem Lösungsmittel in der Reihenfolge zunehmender Polarität durch Flüssig-Flüssig-Verteilung unterzogen [24,25]. Der Blattextrakt wurde in eine in Hexan lösliche Fraktion (HF, 9,1 Prozent), eine in Ethylacetat lösliche Fraktion (EF, 11,3 Prozent), eine in n-Butanol lösliche Fraktion (BF, 17,3 Prozent) und eine wasserlösliche Fraktion (WF, 31,0 Prozent) fraktioniert. {13}} Prozent ).
2.3. Säulenchromatographie und Dünnschichtchromatographie
Die in bioaktivem Ethylacetat lösliche Fraktion wurde weiter durch Kieselgel-Säulenchromatographie (CC) fraktioniert. Die Open-Column-Chromatographie wurde durch schrittweise Elution mit unterschiedlichen Verhältnissen von n-Hexan und Ethylacetat durchgeführt [26]. Neunzehn Subfraktionen (E1–E19) wurden durch Dünnschichtchromatographie (TLC) erhalten [27]. Die Ausbeuten der Unterfraktionen waren E1 (1,05 Prozent), E2 (8,21 Prozent), E3 (1,64 Prozent), E4 (0,74 Prozent), E5 (1,52 Prozent), E6 ({ {59}}.86 Prozent), E7 (1,51 Prozent), E8 (9,50 Prozent), E9 (7,78 Prozent), E10 (3,97 Prozent), E11 (2,65 Prozent), E12 (8,49 Prozent), E13 (5,58 Prozent), E14 (4,43 Prozent), E15 (5,31 Prozent), E16 (1,14 Prozent), E17 (1,87 Prozent), E18 (0,76 Prozent) und E19 (2,96 Prozent).
2.4. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Aktive Unterfraktionen der in Ethylacetat löslichen Fraktion wurden analysiert und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, L-2130, Hitachi, Tokio, Japan) mit einer präparativen RP-18-Säule (Purospher®, STAR RP{{ 3}} mit Endkappe, 25 0 × 10 mm, 5 µm). Die mobile Gradientenphase bestand aus Wasser (A) und Acetonitril (B). Die Flussrate betrug 3 ml/min. Das Elutionsprogramm umfasste einen linearen Gradienten von 30 bis 35 Prozent B in A für 0–15 Minuten, 35 bis 100 Prozent B in A für 15 bis 25 Minuten und gefolgt von 5 Minuten Gleichgewicht mit 100 Prozent B. Die eluierten Peaks wurden nachgewiesen durch einen UV-Detektor bei 254 nm [25,28].
2.5. Identifizierung isolierter Verbindungen
Die Strukturen isolierter Verbindungen wurden bestimmt und charakterisiert durch Spektralanalysen, einschließlich Ultraviolett-Vis-Spektroskopie (UV/VIS, V-550, Jasco, Tokio, Japan), Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR, FTS{{2} }, Bio-rad, Hercules, CA, USA) und Massenspektroskopie (MS, MAT-958, Finnigan, MA, USA). Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), einschließlich 1D (1H-NMR, 500 MHz; 13C-NMR, 125 MHz) und 2D-NMR (HSQC und HMBC), wurden mit einem Bruker AVIII NMR-Spektrometer (Bruker Avance, Rheinstetten, Deutschland) aufgenommen [ 29–32].
2.6. Antityrosinase-Assay und enzymkinetische Studie
In vitroAntityrosinaseDer Assay war eine spektrophotometrische Analyse basierend auf den zuvor beschriebenen Methoden [33–35]. Als Substrat wurden L-DOPA (3,4-Dihydroxyphenylalanin) bzw. L-Tyrosin verwendet. In den 96-Well-Mikroplatten wurden 40 µL Probenlösung und 70 µL Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 6,8) gemischt, gefolgt von der Zugabe von 50 µL 200 Einheiten/ml Pilz-Tyrosinase ( EC1.14.18.1) nach Inkubation bei 25 ◦C für 10 min. Dann gaben wir 40 &mgr;l 2,5 mM Substrat (L-Tyrosin/L-DOPA) in die Vertiefung und die Mischung wurde 10 min lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Extinktion bei 475 nm jeder Vertiefung mit dem ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-Lesegerät (SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, Offenburg, Deutschland) gemessen. Die positive Kontrolle warArbutin, und die Anzahl der Wiederholungen war drei. Die prozentuale Hemmung derTyrosinaseAktivität wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: Hemmung ( Prozent )=[(AKontrolle–AKontrolle-Leerwert)–(AProbe–AProbe-Leerwert)/(AKontrolle–AKontrolle-Leerwert)] × 100. Dann wird die halbmaximale Hemmkonzentration ( IC50) der Probe wurde aus der Konzentrations-Antwort-Kurve berechnet.
Die enzymkinetische Untersuchung wird anhand des reziproken Lineweaver-Burk-Diagramms der Reaktionsgeschwindigkeit und der Konzentration des Substrats analysiert, um die Wirkung der Probe auf die Affinität des Substrats und des Enzyms zu bewerten. Die Konzentration vonTyrosinasewurde konstant bei 2 00 Einheiten/ml gehalten, während die Substratkonzentration (L-Tyrosin/L-DOPA) bei 0,5, 0,75, 1,0 variiert wurde , 1,25 und 1,5 mM. Die Reaktion war dem oben beschriebenen Antityrosinase-Assay ähnlich; 40 &mgr;l Probenlösung und 70 &mgr;l Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 6,8) wurden gemischt, gefolgt von der Zugabe von 50 &mgr;l 200 Einheiten/ml Tyrosinase nach Inkubation bei 25°C C für 10 min. Dann gaben wir 40 &mgr;l des Substrats in die Vertiefung und mischten es gründlich, und kinetische Messungen der Lösung wurden sofort für einen Zeitraum von 3 Minuten bei der detektierten Wellenlänge (475 nm) gemessen. Beide kinetischen Parameter, die Michaelis-Menten-Konstante (Km) und die maximale Geschwindigkeit (Vmax), wurden aus der Lineweaver-Burk-Lineargleichung [36–38] berechnet.
2.7. Bewertung der Antitimelanogenese-Wirkung bei Zebrafischen
Zebrafische (Danio rerio) des Wildtyp-AB-Stammes wurden in einer gesunden aquatischen Umgebung bei 26–30 °C mit einem 14:10-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Nach 9 h nach der Befruchtung (hpf) wurden die Embryonen in eine 24--Well-Platte (3 Embryonen pro Well) gegeben, mit verschiedenen Endkonzentrationen der in 1 % DMSO gelösten Proben behandelt und 48 h bei 28 °C inkubiert (bei 57 PS). Das digitale Bild eines lebenden Zebrafischembryos wurde durch ein Stereomikroskop (Olympus SZ61, Tokyo, Japan) bei einer Gesamtvergrößerung von 40× aufgenommen; Anschließend wurde der Melaningehalt des Zebrafischembryos mit der ImageJ-Software analysiert. Positive Kontrollen warenArbutin(kommerzieller Hautaufheller) und 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU, ein Melaninsynthesehemmer). Die Anzahl der Wiederholungen betrug sechs [21,39,40].
2.8. Statistische Analyse
Die in der Studie erhaltenen Daten wurden mit dem Statistical Analysis System (SAS) v 9.2 (Cary, NC, USA) mit dem Scheffe-Test analysiert, der eine Post-hoc-Mehrfachvergleichsmethode ist. Das Konfidenzintervall wurde auf 95 Prozent festgelegt.
dr vita OPC imHautaufhellung
3. Ergebnisse und Diskussion
3.1. Antityrosinase-Aktivität von E. serratus-Blattextrakt und seinen Fraktionen
Das schematische Diagramm der Extraktion, Isolierung, Identifizierung,AntityrosinaseTätigkeit uAntimelanogeneseWirkung von E. serratus-BlattExtraktist in Fig. 1 gezeigt. Der Blattextrakt wurde weiter durch Flüssigkeit in eine in n-Hexan lösliche Fraktion (HF), eine in Ethylacetat lösliche Fraktion (EF), die in n-Butanol lösliche Fraktion (BF) und eine wasserlösliche Fraktion (WF) fraktioniert -flüssige Partition.
Die von Melanozyten produzierte Tyrosinase spielt eine Schlüsselrolle bei der Katalyse der komplizierten Melaninsynthese; die Erforschung vonTyrosinaseInhibitor ist eine der prominentesten Arten zu verzögernMelanogenese[2,5,41]. Tyrosinase-Inhibierungsaktivitäten von BlätternExtraktund vier Fraktionen sind in Fig. 2 gezeigt. Bei Verwendung von L-Tyrosin als Substrat hatte nur die in Ethylacetat lösliche Fraktion die hemmende Wirkung gegen Tyrosinase bei einer Konzentration von 400 ug/ml. Blattextrakt, in Ethylacetat lösliche Fraktion und in n-Butanol lösliche Fraktion zeigten die Antityrosinase-Aktivität, wenn L-DOPA als Substrat geändert wurde. Unter Blattextrakt und vier Fraktionen zeigte sich die in Ethylacetat lösliche Fraktion am bestenAntityrosinaseAktivität mit den IC50-Werten von 279,38 und 166,95 ug/ml bei Verwendung von L-Tyrosin bzw. L-DOPA als Substrat (Tabelle 1).
Tabelle 1. IC50-Werte aktiver Subfraktionen gegen Pilztyrosinase.
Die in Ethylacetat lösliche Fraktion wurde der Bioassay-geführten Fraktionierung unter Verwendung von präparativen säulenchromatographischen und dünnschichtchromatographischen Techniken unterzogen, und neunzehn Unterfraktionen (E1–E19) wurden erhalten. Unter diesen Subfraktionen zeigten die Subfraktionen E7–E10 die höhere Tyrosinase-Hemmwirkung in beiden Substratassays (L-Tyrosin und L-DOPA). Die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) aktiver Subfraktionen dagegenTyrosinasesind in Tabelle 1 angegeben. Die IC50-Werte aller E7–E10-Unterfraktionen lagen unter 200 µg/ml; E7- und E9-Subfraktionen zeigten im Vergleich sogar eine bessere LeistungArbutin, das ein kommerzieller Aufhellungsbestandteil ist.
3.2. Isolierung und Identifizierung von Verbindungen aus bioaktiven Subfraktionen
Drei Verbindungen (ES1–3) wurden aus bioaktiven Unterfraktionen (E7–E10) durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie isoliert. Gallussäure (ES1): weißes Pulver; Schmp. 257 Grad; UV (MeOH) λmax (log ε) 215,5 (3,94), 268,0 (3,46) nm; IR (KBr) νmax 3495, 3416, 3285, 1647, 1542 und 122 0 cm-1; EI-MS m/z 171 [M plus H] plus , in Übereinstimmung mit der Summenformel C7H6O5. Myricetin (ES2): gelbe Nadel; Schmp. 358 Grad; UV (MeOH) λmax (log ε) 252,5 (4,43) und 374,0 (4,50) nm; IR (KBr) νmax 3421, 1663, 1596, 1520, 1229, 1202 und 1171 cm –1 ; EI-MS m/z 319,36 [M plus H] plus , Summenformel C15H10O8. Mearnsetin (4′-O-Methylmyricetin, ES3): gelbes Pulver; Schmp. 184 Grad; UV (MeOH) λmax (log ε) 259,5 (4,21) und 364,5 (4,26) nm; IR (KBr) νmax 3409, 2960, 2927, 2853, 1661, 1599, 1507, 1208 und 1163 cm –1 ; EI-MS m/z 333,0 [M plus H] plus , Summenformel C16H12O8. Die NMR-Daten dieser Verbindungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die chemischen Strukturen der identifizierten Verbindungen sind in Abbildung 3 dargestellt.
Table 2. 1H-, 13C- und HMBC-NMR-Daten von Verbindungen.
Unter diesen Verbindungen ist Gallussäure eine Phenolsäure; Myricetin und Mearnsetin gehören zu den Flavonoiden. Die Gehalte jeder Verbindung in der in Ethylacetat löslichen Fraktion und den Unterfraktionen E7–E10 sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die Unterfraktion E7 war reich an Mearnsetin (433,38 mg/g); die primäre Unterfraktion E8 enthielt Gallussäure (417,64 mg/g). Der Hauptbestandteil der Unterfraktionen E9 und E10 war Myricetin (406,41 bzw. 336,41 mg/g). 22,66 mg/g (Mearnsetin).
3.3. Antityrosinase-Aktivität und enzymkinetische Untersuchung isolierter Verbindungen
Antityrosinasedie Aktivität dieser Verbindungen aus aktiven Unterfraktionen ist in Tabelle 4 dargestellt. Bei Verwendung von L-Tyrosin als Substrat war die Reihenfolge der Antityrosinase-Aktivität der untersuchten Verbindungen Mearnsetin > Myricetin > Gallussäure > Arbutin; Mearnsetin hatte mit dem IC50-Wert von 56,57 µg/mL (0,17 mM) die beste Hemmwirkung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei dem als Substrat verwendeten L-DOPA beobachtet; Die Wirksamkeit von drei sekundären Pflanzenstoffen war der von überlegenArbutin.
Ein echter Enzyminhibitor enthält vier Arten der Hemmung, einschließlich kompetitiv, nicht kompetitiv, gemischter Typ (sowohl kompetitiv als auch nicht kompetitiv) und nicht kompetitiv [12]. Kinetische Konstanten, Km und Vmax, werden durch die Anfangsgeschwindigkeit des Enzyms bei den verschiedenen Substraten bestimmt Konzentrationen im Lineweaver-Burk-Plot; sie schneiden sich auf der y-Achse gleich 1/Vmax, und sie schneiden sich auf der x-Achse gleich –1/Km. In der Enzymkinetikstudie von Terpenoidverbindungen aus dem ätherischen Öl der Zitrusschale gegenüberTyrosinase, Citral wirkte als nicht kompetitiver Inhibitor und Myrcen war ein kompetitiver Inhibitor [36]. Der Hemmungsmechanismus von 3,7-Dioleylquercetin gegen Pilztyrosinase beruhte auf dem kompetitiven Hemmungsmodell zur Unterdrückung der Melaninproduktion [42].
Tabelle 4. IC50-Werte von Verbindungen gegen Pilztyrosinase
Die Art der Hemmung der Tyrosinase von drei sekundären Pflanzenstoffen wurde durch eine in-vitro-Enzymkinetik-Studie aufgeklärt. Abbildung 4 zeigt das Lineweaver-Burk-Diagramm (doppelt reziprokes Diagramm) von Mearnsetin. Bei den Analysen beider Substrate, L-Tyrosin und L-Dopa, hatte die lineare Regressionslinie unterschiedlicher Konzentrationen von Mearnsetin denselben Schnittpunkt auf der y-Achse und die ansteigende Steigung. Die kinetischen Parameter von Gallussäure, Myricetin und Mearnsetin sind in Tabelle 5 zusammengefasst. In Gegenwart von Gallussäure oder Mearnsetin wurden ein Anstieg von Km und eine Konstante von Vmax beobachtet, was anzeigt, dass sowohl Gallussäure als auch Mearnsetin der kompetitive Inhibitor von Tyrosinase waren. Es deutete darauf hin, dass Gallussäure und Mearnsetin frei binden könntenTyrosinasemit hoher Affinität und verhindern die Bindung des Substrats (L-Tyrosin oder L-DOPA) an das aktive Zentrum der Tyrosinase. Es wurde festgestellt, dass Myricetin ein Inhibitor vom gemischten Typ ist, der eine kompetitive und nicht kompetitive Hemmung aufweist, da Km erhöht und Vmax verringert war. Die nicht kompetitive Hemmung zeigte, dass Verbindungen an den Tyrosinase-Substrat-Komplex, aber nicht an die freie Tyrosinase binden.
3.4. Antitimelanogenese-Effekte von Extrakten, Fraktionen und isolierten Phytochemikalien
Zebrafisch (Danio rerio) ist ein neuartiger und gültiger Modellorganismus für die Melanogeneseforschung in neueren Studien [18–21,40]. DasAntimelanogeneseDie Wirkungen von Blattextrakt und vier Fraktionen im In-vivo-Zebrafischtest sind in Abbildung 5 dargestellt. Das BlattExtraktund Ethylacetat-lösliche Fraktion zeigte eine gute Leistung bei der Hemmung der Melaninbildung in Zebrafischembryos. Bei einer Konzentration von 200 µg/ml hemmten der Blattextrakt und die in Ethylacetat lösliche Fraktion 27,72 Prozent bzw. 35,60 Prozent der Melaninproduktion von Zebrafischembryos. Alle Behandlungen hatten keinen Einfluss auf das Wachstum der Zebrafischembryos mit einer Überlebensrate von 100 Prozent.
Abbildung 6 zeigt die Wirkungen von Verbindungen und positiven Kontrollen, PTU und Arbutin, auf dieMelanogenesevon Zebrafisch in einer Konzentration von 50 µM. PTU ist starkTyrosinaseInhibitor zur Verhinderung der Melaninproduktion, währendArbutinist ein kommerzielles Hautaufhellungsmittel; beide Positivkontrollen konnten die Melaninbildung im Zebrafisch reduzieren. Unter den drei sekundären Pflanzenstoffen zeigte Myricetin eine leichte Hemmwirkung auf Melanin, während Mearnsetin die bessere Melanogenese-Hemmaktivität im Zebrafisch aufwies.
Die wirksamen Konzentrationen vonMelanogenese inhibition activity in zebrafish of compounds are listed in Table 6. IC50 values of PTU and arbutin were 26.29 µM and 323.69 µM, respectively. The order of antimelanogenesis activity of examined compounds was PTU >mearnsetin >Arbutinund Myricetin > Gallussäure. Unter den untersuchten sekundären Pflanzenstoffen zeigte Mearnsetin mit einem IC50-Wert von 121,01 µM die beste Wirksamkeit.
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4. Schlussfolgerung
DasMelanogeneseHemmwirkung uAntityrosinaseAktivität von Blattextrakt aus Ceylon-Olive (E. serratus) wurden in dieser Studie bewertet. Unter BlattExtraktund seine vier Fraktionen, die in Ethylacetat lösliche Fraktion, hatte die besteAntityrosinaseAktivität. Phytochemikalien, einschließlich Gallussäure, Myricetin und Mearnsetin, wurden aus den aktiven Subfraktionen durch Bioassay-geführte Chromatographie und Spektralanalysen isoliert und identifiziert. Die Reihenfolge der Antityrosinase-Aktivität dieser Verbindungen war Mearnsetin > Myricetin > Gallussäure. Die In-vitro-Enzymkinetikstudie zeigt, dass Gallussäure und Mearnsetin kompetitive Inhibitoren der Tyrosinase waren und Myricetin ein Inhibitor vom gemischten Typ war. Die Ergebnisse des Zebrafisch-In-vivo-Assays zeigten, dass eine in Ethylacetat lösliche Fraktion und drei Phytochemikalien signifikant vorhanden warenMelanogenesehemmende Wirkungen. Die antimelanogene Wirkung von Mearnsetin war der Positivkontrolle überlegen,Arbutin, im Zebrafisch.