Antioxidatives und Anti-Aging-Potenzial einer mit Gallussäure konjugierten Peptidformulierung (Gal2–Pep) Ⅱ

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Synthese und Konjugation von Gallussäure mit Peptid

Die synthetisierten Peptide TPPTTP, Galloyl-TPPTTP (Gal-Pep) und Gal2-Pep wurden unter Verwendung semipräparativer RP- erhalten und gereinigt.HPLC. Abb. 1a und Schema 1 zeigen die Konjugationsstrategie von Gallussäure mit KTPPTTP als Gal2-Pep. Bei der SPPS-Methode umfassen die während der Peptidsynthese erzeugten Verunreinigungen normalerweise nebenreagierte Peptide, Aminosäureschutzgruppen und Lösungsmittel, die für die Synthese und Reinigung verwendet werden. Es ist bekannt, dass das bei der Peptidsynthese verwendete HOBt die Racemisierung hemmt und die Effizienz der Peptidsynthese verbessert.17–19 Um Aminosäureschutzgruppen und für die Synthese verwendete Lösungsmittel zu entfernen, führten wir währenddessen mehrere Waschvorgänge mit Lösungsmitteln wie DMF und DCM durch der Peptidsyntheseprozess. Selbst nach dem letzten Waschschritt sind noch Spuren von Verunreinigungen, einschließlich Aminosäureschutzgruppen, vorhanden. Um die von mehreren Forschern20–22 angegebene Peptidreinheit von mehr als 90 Prozent zu erreichen, wurde als Polierschritt eine halbpräparative HPLC durchgeführt, um als Ergebnis der HPLC-Analyse das endgültige Peptid mit einer Reinheit von 99,2 Prozent zu erhalten (siehe Abb. S1†). Das gereinigte Peptidprodukt wurde mit Q-TOF analysiert, um die erfolgreiche Synthese erneut zu bestätigen (Abb. 1b – d).

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3.2. Zelllebensfähigkeitstests

3.3. Antioxidative Aktivität synthetisierter Peptide

TPPTTP hatte bei keiner Konzentration eine Radikalfängeraktivität, während GA, Gal-Pep und Gal2-Pep konzentrationsabhängig eine höhere Radikalfängeraktivität aufwiesen.

Ininsbesondere Gal2–Pep zeigte den EffektivstenAntioxidansAktivität; bei einer Konzentration von 10mM, GA, Gal–Pep und Gal2–Pephatte eine Radikalfängeraktivität von 13,6 Prozent, 24,23 Prozent und 26,{5}} Prozent.bzw. Dies weist darauf hin, dass die Bindung von TPPTTP an GA erfolgthemmen nicht die Radikalfängeraktivität. Abb. 3b coNFIrms dieStabilität der Proben als conFidurch die Beurteilung ihres Radikals gefestigtSpülaktivität bei Lagerung bei Raumtemperatur. GA beibehaltenseine Radikalfängeraktivität dauert bis zu einer Woche, aber aftähm zwei Wochen, diese Aktivität ging um mehr als 60 Prozent zurück. Auf dem anderenHand, Gal–Pep und Gal2–Pep setzte seine Plünderungstätigkeit fortseit über zwei Wochen. Insbesondere Gal2–Pep hatte einen radikalen Skandalbereits in der vierten Woche eine Antriebsaktivität von 50 Prozent. Diese Ergebnisselegen nahe, dass die Bindung von GA an TPPTTP dessen Radikalfänger stabilisiertAktivität. Einige Studien haben gezeigt, dass Ascorbinsäure stabilisiert istdurch Bindung mit Peptiden.12,25 Wir glauben, dass GA stabil sein könnteDies geschieht durch Bindung an ein Peptid auf die gleiche Weise.

Derantioxidative Wirkung der Peptidewurde auch mit DCF-DA-Assays in Gegenwart von durch H2O2 induziertem intrazellulärem oxidativem Stress getestet (Abb. 4). Nach 24-stündiger Behandlung der Proben auf den Zellen mit einer Konzentration von 100 mM wurde DCF-DA auf die Zellen geladen, und die Zellen wurden dann 30 Minuten lang mit H2O2 behandelt und die Fluoreszenzintensität von DCF bei Anregung beobachtet Wellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm. Zellen, die oxidativem Stress mit 1 mM H2O2 ausgesetzt waren, zeigten eine mehr als dreimal höhere Fluoreszenzintensität als die Negativkontrolle; Allerdings erzeugte die Gal2-Pep-Behandlung eine Fluoreszenz, die nur 67 Prozent der Fluoreszenz betrug, die von Zellen erzeugt wurde, die nur mit H2O2 behandelt wurden. In Gegenwart von TPPTTP, das keine Radikalfängeraktivität zeigte (Abb. 3a), wurde der durch H2O2 verursachte ROS-Stress um etwa 20 Prozent reduziert, was frühere Untersuchungen stützt, die berichtet haben, dass TPPTTP den ROS-Spiegel in Zellen senkt.24 Wenn die Zellen wurden nur mit GA behandelt, es gab keine signifikante Veränderung der ROS-Werte. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass Gal2-Pep, das zwei GA-Moleküle mit einem Peptid kombiniert, ein stabiles und wirksames Antioxidans ist.

3.4. Wirkung synthetisierter Peptide auf das Membranpotential der Mitochondrien

In dieser Studie wurde der Farbstoff JC-1 verwendet, um die Wirkung der synthetisierten Peptide auf das MmP (DJm) zu untersuchen. Das MmP fungiert als wichtiger Parameter für die Mitochondrienfunktion und ist bekanntermaßen mit mehreren Krankheiten wie Alzheimer und Huntington-Krankheit verbunden.26 Der JC-1-Farbstoff erzeugt aus grünen Emissionen ein Rothemd, indem er sich in Mitochondrien ansammelt und J-Aggregate bildet. Nach 24-stündiger Behandlung der HaCaT- und Fibroblastenzellen mit den synthetisierten Peptiden wurden die Zellen 10 Minuten lang JC-1-Farbstoff ausgesetzt, und dann wurde die Fluoreszenzintensität mit einem Mikroplattenlesegerät (grünes lEx=475 nm und lEm) gemessen ¼ 530 nm, rotes lEx ¼ 475 nm und lEm ¼ 590 nm). Das Verhältnis der roten zur grünen Fluoreszenz wurde als fache Änderung im Vergleich zur Negativkontrolle ausgedrückt (Abb. 5). HaCaT-Zellen, die unabhängig voneinander mit GA und dem Peptid behandelt wurden, zeigten keine signifikante Veränderung im Vergleich zur Negativkontrollgruppe, während Gal2-Pep einen signifikanten Unterschied aufwies und im Vergleich zur Kontrolle um das 1,45-fache zunahm. Die mit Gal2–Pep behandelten Fibroblastenzellen waren ebenfalls signifikant

Abb. 4 Intrazelluläre antioxidative Aktivitätstests mit DCF-DA bei Gallussäure- und Peptidkonzentrationen von 1 00 mM. Nach 24-stündiger Behandlung wurde H2O2 zugegeben und 3 0 Minuten lang inkubiert, gefolgt von der Messung der DCF-Fluoreszenzintensität. Sternchen kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001).

3.5. Elastase-hemmende Aktivität

3.6. Expression der Gene Typ I Kollagen, MMP-1 und PGC{3}}a

Abb. 7 Genexpressionsanalyse in dermalen Fibroblasten mittels RT-qPCR: (a) Typ-I-Kollagen, (b) MMP-1 und (c) PGC-1a.

Die Expression von PGC-1a war nach 8 Stunden bei allen Behandlungen am höchsten, wobei die Expressionsraten für GA, TPPTTP, Gal–Pep und Gal2–Pep um 2,06-, 1,{{6} anstiegen. }, 1.07- bzw. 2.05-fach. Im Gegensatz zu den anderen Behandlungen erhöhte Gal2-Pep jedoch den PGC-Ausdruck nach 24 Stunden um das -11-fache. PGC-1areguliert die Synthese und antioxidative Wirkung der Mitochondrienund wird gemeldetnehmen mit zunehmendem Alter ab.29–32 Daher hat Gal2–Pep das Potenzial, als wirksames Antioxidans eingesetzt zu werden, das wirksam vor ROS schützen kann.

Insgesamt erhöhte Gal2–Pep die Expression von PGC-1a und Kollagen im Vergleich zu den Wirkungen von GA und TPPTTP allein, während dieDer Ausdruck von MMP-1 nahm tendenziell abund verdeutlicht so sein EinsatzpotenzialAnti-Aging-Kosmetik. 

4. Fazit

Interessenskonflikte

Es sind keine Konflikte zu deklarieren.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch ein Stipendium der Korea Industrial Complex Corp. (KICOX, NTIS Nr. 1415165722) und das Forschungsstipendium der Inha University unterstützt.

Verweise

20 P. Song, W. Du, W. Li, L. Zhu, W. Zhang, X. Gao, Y. Tao und F. Ge, Nanomater. Nanotechnologie, 2020, 10, 1–10.

21 M. De Zotti, B. Biondi, Y. Park, K.-S. Hahm, M. Crisma, C. Toniolo und F. Formaggio, Amino Acids, 2012, 43, 1761–1777.

22 Z. Zhai, K. Xu, L. Mei, C. Wu, J. Liu, Z. Liu, L. Wan und W. Zhong, So Matter, 2019, 15, 8603–{{4 }}.

23 DJ Tobin, J. Tissue Viability, 2017, 26, 37–46.