Antioxidative Wirkungen von Phenylethanoiden aus Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Quanbo Xiong/ Shigetoshi Kadota," Tadato Tani,6 und Tsuneo Namba"

Der Aceton-H2O (9:1)-Extrakt aus dem Stängel von Cistanche deserticola zeigte eine starke Radikalfänger-Aktivität. Neun Phenylethanoid-Hauptverbindungen wurden aus diesem Extrakt isoliert. Sie wurden durch NMR als Acteosid, Isoacteosid, 1^Acetylacteosid, Tubulosid B, Echinacosid, Tubulosid A, Syringalid A, 3z-a-Rhamnopyranosid, Cistanosid A und Cistanosid F identifiziert. Alle diese Verbindungen zeigten stärkere Radikalfängeraktivitäten als A -Tocopherol auf 1,1 -Diphenyl-2-picrylhydrazy 1 (DPPH)-Radikal und Xanthin/Xanthinoxidase (XOD) erzeugten Superoxid-Anion-Radikal (Oj). Unter den neun Verbindungen zeigten Isoacteosid und Tubulosid B, deren Caffeoyl-Einheit sich an der d'-Position der Glucose befindet, eine hemmende Wirkung auf XOD. Wir untersuchten weiter die Wirkungen dieser Phenylethanoide auf die Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen, die durch enzymatische und nicht-enzymatische Methoden induziert wurden. Wie erwartet zeigte jedes von ihnen eine signifikante Hemmung sowohl der durch Ascorbinsäure/Fe2 plus als auch durch ADP/NADPH/Fe3 plus induzierten Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen, die wirksamer waren als a-Tocopherol oder Kaffeesäure. Es wurde festgestellt, dass die antioxidative Wirkung durch eine Erhöhung der Anzahl an phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül potenziert wird.

Schlüsselwörter: Cistanche Deserticola; Phenylethanoide;Antioxidans; DPPH (1 ,1 -Diphenyl-2-picrylhydrazyl)-Radikal; Superoxid-Anion-Radikal; Lipidperoxidation

Stamm von Cistanche deserticola

Der Stamm von Cistanche spp. (Cistanche Herba, Familie Orobanchaceae) ist ein Tonikum in der traditionellen chinesischen Medizin, das bei Niereninsuffizienz verwendet wird, die durch Impotenz, Kältegefühl in den Lenden und Knien, weibliche Sterilität und Verstopfung aufgrund von Darmtrockenheit bei senilen Menschen gekennzeichnet ist.Aus diesen Pflanzen wurden eine Reihe von Bestandteilen isoliert, darunter Phenylethmoide (manchmal auch als Phenylpropanoide bezeichnet),2) Iridoide3* und Polysaccharide4). Sato et al.5} berichteten, dass einige Phenylethanoide aus diesem rohen Medikament eine schützende Wirkung gegen die Abnahme sowohl des Sexual- als auch des Lernverhaltens bei hängenden, stressbelasteten Mäusen zeigten. Phenylethanoide sind die Hauptbestandteile dieser Pflanzen und tragen vermutlich zu den verschiedenen Wirkungen dieses Medikaments bei.6)

Phenylethanoide sind im Pflanzenreich weit verbreitet, und bei einigen wurde festgestellt, dass sie Anti-Anoxie,7) Anti-Neoplasmen,8) Enzymhemmung,9* Entzündungen,10) Antinephritis,1 n Anti-Mikroorganismen und Anti-Anoxie wirken Immunmodulation.12) Es wurde auch über Studien zur antioxidativen Aktivität einiger Phenylethanoide aus Pedicularis berichtet,13 -15), aber es wurde kein Bericht gefunden, der sich mit der antioxidativen Aktivität von Phenylethanoiden aus Cistanche-Arten befasste.

Es ist allgemein anerkannt, dass freie Radikale entscheidend an verschiedenen Pathogenesen wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Arthritis, Entzündungen sowie an degenerativen Prozessen im Zusammenhang mit dem Altern beteiligt sind.16™18) In unserem Screening nach Anti-Aging-Wirkstoffen aus natürlichen Ressourcen , fanden wir heraus, dass jeder der Extrakte aus CHC13 (C), EtOAc (E), Aceton (A), Aceton-H2O (9:1) (AH) und Wasser (H) des Stammes von Cistanche deserticola einen starken DPPH zeigte Radikalfänger-Aktivität (Fig. 1), unter denen die stärkste von Aceton-H&sub2;.(9:1)-Extrakt (AH) gezeigt wurde. Der Aceton-H2O (9:1)-Extrakt enthielt einen hohen Anteil an Phenylethanoiden, die wahrscheinlich aktive Bestandteile der Radikalfängerwirkung waren. Wir isolierten die wichtigsten Phenylethanoide aus diesem Extrakt und untersuchten die antioxidativen Wirkungen durch ihr Abfangen von DPPH-Radikalen und Xanthin/XOD-erzeugten Superoxid-Anion-Radikalen und ihre Hemmung von Ascorbinsäure/Fe2 plus und ADP/NADPH/Fe3 plus induzierter Lipidperoxidation in Rattenleber Mikrosomen.

Cistanche Deserticola

MATERIALEN UND METHODEN

Reagenzien Polyamid C-200 (75一150/zm) und Kieselgel (Wakogel C-200, 75—150^m) Pulver für die Säulenchromatographie, DPPH (1,1 -diphenyl{{ 8}}Picrylhydrazyl), Xanthin, XOD (Xanthinoxidase), NBT (Nitroblautetrazolium), ADP, g-NADPH, Kaffeesäure und a-Tocopherol wurden von Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan bezogen. Malonaldehydbis(dimethylacetal) stammte von Tokyo Kasei, Tokyo, Japan. BSA (Rinderserumalbumin) und Allopurinol stammten von Sigma,St. Louis, USA Andere Chemikalien waren analysenrein.

Die UV-Absorption von Instrumenten wurde gemessen an aShimadzu UV-2200-Aufzeichnungsspektrophotometer, NMR-Spektren wurden auf einem JEOL GX-400- oder einem JEOL JNM-LA 400WB FT-NMR-System aufgenommen.

Pflanzenmaterial Eine kommerzielle Rohdroge (hergestellt in Nei Monggol, gekauft auf dem Bozhou Crude Drug Market, Provinz Anhui, China, 1995; das Belegexemplar, TMPW Nr. 15479, hinterlegt im Museum of Materia Medica, Analytical Research Center for Ethnomedicine, Research Institute for Wakan-Yaku, Toyama Medical and Pharmaceutical University) wurde als Stängel von Cistanche deserticola YC Ma identifiziert, indem seine morphologischen und anatomischen Merkmale mit einer authentischen Probe verglichen wurden, die von Professor Dawen Shi, Department of Pharmacognosy, Shanghai Medical University, China, zur Verfügung gestellt wurde.

Extraktion und Isolierung Die pulverisierte Rohdroge (5,87 kg) wurde nacheinander mit CHC13 (12, 9 1 x 2) und EtOAc (9 1 x 3) bei Raumtemperatur extrahiert und mit Aceton (9 1 x 3), Aceton-κ0 (9:1,91x3) und H2O (7,5 1x4), um die Extrakte von CHC13 (C) (28,7 g), EtOAc (E) ( 13,4 g), Aceton (A) (95 g), Aceton-H2O (9:1) (AH) (175 g) bzw. H2O (H) (2,51 kg). Ein Teil von 100 g des Aceton-H2O (9:1)-Extrakts wurde auf eine Polyamid-C-200-Säule (4{{5{0}}0 g) gegeben und mit H2O ({{41 }}) und dann MeOH (5 1). Das MeOH-Elutionsmittel (20 g) wurde auf eine Kieselgelsäule (600 g) gegeben und mit CHCl3-MeOH-H2O (8:3:0,3) (5 1) eluiert, um 10 Fraktionen zu ergeben. Jede Fraktion wurde einer Sephadex LH-20-Säule unterzogen und mit verschiedenen Verhältnissen von MeOH-H2O (0 ≤ 50 Prozent) eluiert; neun wichtige Phenylethanoide 1 (607 mg), 2 (286 mg), 3 (43 mg), 4 (187 mg), 5 (1,1 g), 6 (100 mg), 7 (208 mg), 8 (168 mg) , 9 (75 mg) wurden erhalten.

Tiere Männliche Std: Wistar-Ratten (8 Wochen alt, 230 &mgr;l, 250 g) wurden verwendet. Die Tiere wurden vom Shizuoka Laboratory Animal Center gekauft und mit Labor-Pelletfutter (Clea Japan) gefüttert und mit Wasser nach Belieben versorgt.

Herstellung einer mikrosomalen Rattenleber-Suspension Rattenleber-mikrosomale Fraktion wurde nach dem Verfahren von Kiso et al. (19) hergestellt, jedoch ohne Vorbehandlung mit Phenobarbital. Nachdem die Tiere 24 h gefastet hatten, wurden die Lebern mit einer eiskalten 0,9-prozentigen NaCl-Lösung in situ perfundiert, dann in dünne Stücke geschnitten und in kalter 1,15-prozentiger KCl-Lösung (1,{{9}) homogenisiert. } ml/g Leberfeuchtgewicht). Das Homogenat wurde viermal mit 1,15-prozentiger KCl-Lösung verdünnt und bei 8000 g für 20 min bei 4 Grad zentrifugiert. Die überstehende Fraktion wurde dann gesammelt und bei 105000 g für 60 min ultrazentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde im gleichen Volumen einer 1,15-prozentigen KCl-Lösung resuspendiert. Der Proteingehalt wurde nach dem Verfahren von Lowry et al. unter Verwendung von Albumin als Standard bestimmt.

Probenvorbereitung Die getesteten Proben wurden in Wasser oder Ethanol gelöst und mit Wasser auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Die Endkonzentrationen von Ethanol lagen in allen Assay-Systemen unter 1 Prozent, mit Ausnahme des DPPH-Radikalfänger-Assays. Ethanol in einer Endkonzentration unter 1 Prozent zeigte keine Wirkung auf diese Testsysteme.

DPPH-Radikalfänger-Effekt Der Radikalfänger-Effekt entsprach der Intensität des Quenchens von DPPH-Radikalen, wie von Hatano et al. beschrieben 30 min bei Raumtemperatur, dann wurde die optische Dichte bei 520 nm gemessen. Für den Blindwert wurde EtOH anstelle von DPPH-Lösung verwendet, und für die Kontrolle wurde H2O anstelle von Probenlösung verwendet. Die IC50-Werte wurden aus Regressionslinien berechnet, wobei die Abszisse die Konzentration der getesteten Verbindung darstellt und die Ordinate die durchschnittliche prozentuale Reduktion des DPPH-Radikals aus vier getrennten Tests darstellt.

Auswirkungen auf die Bildung von Superoxid-Anionen-Radikalen Die Bildung von Superoxid-Anionen im Xanthin/XOD-System wurde unter Verwendung einer halben Größe des Verfahrens von Imanari et al. bestimmt.22) Eine Mischung aus 900/zl von 0,05 m Na2CO3 (pH 10,2), 50 &mgr;l von jeweils 3 mM Xanthin, 3 mM EDTA, 1,5 mg/ml BSA, 0,75 mM NBT und getestete Probe wurden mit 50 von 0,1 mg/ml XOD hinzugefügt, um die zu starten Reaktion. Nach 30-minütiger Inkubation wurde die Reaktion mit 50 &mgr;l 6 mM CuCl 2 gestoppt und die Extinktion bei 560 nm gemessen. Die Kontrolllösung wurde auf die gleiche Weise hergestellt, jedoch wurden anstelle der Probenlösung 50 µl H2O verwendet. In der Blindlösung wurden 50 &mgr;l H 2 O anstelle der XOD-Lösung verwendet. IC50-Werte wurden aus Regressionslinien berechnet, wobei die Abszisse die logarithmische Konzentration der getesteten Verbindung darstellte und die Ordinate die mittlere prozentuale Hemmung der NBT-Reduktion von vier in abhängigen Tests darstellte.

Hemmwirkungen auf die Aktivität von XOD Hemmwirkungen auf die Aktivität von XOD wurden durch das Verfahren von Hatano et al.* mit einigen Modifikationen abgeschätzt. Eine Mischung bestehend aus 600/11 eines Puffers (0,1 m Phosphatlösung, pH 7,5), 50 µl XOD-Lösung (0,068 U/ml in Puffer) und 50 &mgr;l Probenlösung wurden für 10 min bei 25 Grad vorinkubiert. Dann wurden 300 &mgr;l Xanthinlösung (0,1 mM in Puffer) zu der Mischung gegeben und die resultierende Lösung wurde für 30 Minuten bei 25 Grad inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 1 n HCl (100 /zl) beendet und die Extinktion des Reaktionsgemisches bei 295 nm gemessen. Die Konzentration der in der Mischung gebildeten Harnsäure wurde aus der Extinktion berechnet, nachdem die Extinktion der Blindlösung subtrahiert wurde, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, außer dass die XOD-Lösung durch 50 &mgr;l des Puffers ersetzt wurde. Die Hemmwirkungen auf XOD wurden durch die prozentuale Hemmung (Prozent) der Bildung von Harnsäure gegenüber der Kontrolle ausgedrückt, bei der Wasser anstelle der Probenlösung verwendet wurde. Als positive Kontrolle wurde der bekannte XOD-Inhibitor Allopurinol verwendet.

Hemmwirkungen auf die Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen Die Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen, nicht enzymatisch induziert durch Ascorbin/Fe2 plus und enzymatisch induziert durch ADP/NADPH/Fe3 plus, wurde nach dem Verfahren von Kiso et al.19) mit einigen Modifikationen gemessen .

a) Ascorbinsäure/Fe2 plus induzierte Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen: Das Reaktionsgemisch bestand aus 39 0/11 100 mM KCl/45 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 pl der mikrosomalen Fraktion in 1,15 % KC1 (20 mg Protein/ml) und 50 µl einer Probenlösung. Nach Zugabe von 10/11 10 mM Ascorbinsäure/0,5 mM FeSO 4 und anschließender 20-minütiger Inkubation bei 37 Grad wurde die Reaktionsmischung in Eis gekühlt, um die Reaktion zu stoppen. Die Lipidperoxidation wurde nach der Thiobarbitursäure-Methode24) gemessen und als MDA (Malondialdehyd)-Produktion ausgedrückt. Dass

b) ADP/NADPH/Fe3 plus induzierte Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen: Das Reaktionsgemisch enthielt 29 0 × 100 mM KCl/45him Tris-HCl (pH 8,0), 50/il mikrosomale Suspension in 1,15 % KCl (20 mg Protein/ml) und 50 µl Probe in Wasser. 50 frisch zubereitetes 20 mM ADP, 50 ul 1 mM NADPH und 10 2 mM FeCl 3 wurden zugegeben und dann 30 min lang bei 37 Grad inkubiert. Die Lipidperoxidation wurde gemessen und IC50 wurde nach dem obigen Verfahren berechnet.

cistanche Vorteile: schützt die Leber

ERGEBNISSE

Strukturbestimmung Durch direkten Vergleich ihrer ^H-NMR- und 13C-NMR-Daten mit der Literatur2* wurden die neun Phenylethanoide als 2,-Acetylacteosid (1), Cistanosid A (2), Tubulosid A (3), Echinacosid ( 4), Acteosid (5), Syringalid A 3'-a-Rhamnopyranosid (6), Tubulosid B (7), Isoacteosid (8) bzw. Cistanosid F (9) (Abb. 2). Für Acteosid, eine repräsentative Verbindung von Phenylethanoiden, Zuordnungen der 13C-NMR-Signale von C-3 und C-4 in der Aglykoneinheit, C-3, C-4 , C-5 und C-6 im Kaffeeanteil in früheren Berichten25) waren verwirrend. Durch die 2D-NMR-Methode wie HMBC und HMQC haben wir die 13C-NMR-Daten von Acteosid als Aglykoneinheit eindeutig zugeordnet: Cl: 131,49, C-2: 117,14, C-3: 146,07, C{ {41}}: 144,62, C-5: 116,34, C-6: 121,29, Ca: 72,33, C# 36,54; Caffeoyl-Einheit Cl: 127,63, C-2: 115,26, C-3: 146,79, C-4: 149,78, C-5: 116,55, C-6: 123,24 , Ca: 168,33, Cg: 114,68, Cy: 148,04; Glukoseeinheit C-1': 104,16, C-2': 75,97, C-3': 81,66, C4: 70,39, C-5': 76,16, C-6' : 62,35; und Rhamnose-Einheit: Cl: 102,99, C-2: 72,22, C-3: 72,05, C-4: 73,79, C-5: 70,58, C-6 : 18.46.

Die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen wurden für diese neun Phenylethanoide anhand ihrer durch DPPH-Radikale und Xanthin/XOD erzeugten Superoxidanion-Radikalfängeraktivitäten, Ascorbinsäure/Fe2 plus und ADP/NADPH/Fe3 plus induzierte Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen untersucht. Als positive Kontrollsubstanzen wurden Kaffeesäure und a-Tocopherol eingesetzt, die bekannte Radikalfänger und Antioxidantien sind.

DPPH Radical Scavenging Activity All of the nine phenylethanoids showed stronger DPPH radical scav-enging activity than either a-tocopherol or caffeic acid, except that cistanoside A (2), syringalide A 3'-a-rhamno- pyranoside (6) and cistanoside F (9) showed weaker activity than caffeic acid (Fig. 3). The activity order was tubuloside B ⑺(IC50 = 2.99 ^m) > echinacoside ⑷ (IC50 = 3.29 fiM)M 2z-acetylacteoside ⑴(IC50 = 3.30 /im) M tubuloside A (3) (IC50 = 3.34/im) acteoside (5) (IC50 = 3.36 〃m)> isoacteoside (8) (IC50 = 3.49 ^m) >caffeic acid (IC50 = 4.79 /2M)> cistanoside A (2) (IC5O = 4.87 /im)>Syringalid A S'-a-Rhamnopyranosid (6) (IC5O=5.52 /zm) > Cistanosid F (9) (IC50=6.29 /im) > a-Tocopherol (IC{{10 }}.2//m). Tubulosid B ⑺, Echinacosid (4), 2/-Acetylacetosid (1), Tubulosid A (3), Acteosid (5) und Isoacteosid (8) (IC5O=2.99一3.49 /im), von denen jedes vier phenolische Hydroxylgruppen im Molekül aufweist, zeigte in ähnlicher Weise eine stärkere Aktivität als Cistanosid A (2), dessen 3-OH- oder Aglykoneinheit methyliert war. Syringalid A 3z-a-Rhamnopyranosid (6), das nur eine OH-Gruppe in der Aglyconeinheit aufweist, zeigte relativ schwache Aktivität. Cistanosid F (9), das nur zwei Hydroxylgruppen am Caffeoylrest, aber kein Phenylethanolaglykon aufweist, zeigte die schwächste Aktivität.

Effects on Superoxide Anion Radical Generation All the tested compounds exhibited a stronger inhibitory activity than a-tocopherol but weaker than caffeic acid on the generation of superoxide anion radical (Fig. 4). The activity order was caffeic acid (IC5()= 1.82jUM)>2'- acetylacteoside (1) (IC50 = 2.25 /im) tubuloside B ⑺ (IC50 = 2.34jUM) >echinacoside (4) (IC50 = 2.74juM)^ isoacteoside (8) (IC50 = 2.88 /zm) acteoside (5) (IC50 = 2.89 f/M) >cistanoside F (9) (IC5o = 3.13 rm) tubuloside A (3) (IC50 = 3.17 jUM)syringalide A 3'-a-rhamnopyrano- side (6) (IC50 = 3.20^m)>Cistanosid A (2) (IC5O=3.69 jUm) > a-Tocopherol (IC50 > 10 〃m).

Hemmende Wirkungen auf die XOD-Aktivität Nur Isoacteosid (8) und Tubulosid B (7), deren Caffeoyl-Einheit sich an der 6z-Position der Glucose befindet, hatten hemmende Wirkungen auf die Aktivität von XOD und anderen Phenylethanoiden, die eine Caffeoyl-Einheit an der ^- Position der Glukose, zeigten keine Wirkungen bei den getesteten Konzentrationen (25 bis 200 m) (Tabelle 1). isolierten neun wichtige Phenylethanoidverbindungen aus diesem Extrakt und bestimmten ihre Strukturen durch NMR. System als Tubulosid B (7) M2'-Acetylacteosid (1) Iso-Acteosid (8) Echinacosid (4) Tubulosid A (3) M-Acteo-Seite (5) > Syringalid A 3'-a-Rhamnopyranosid (6) > Cistanosid A (2) > Cistanosid F (9); im ADP/NADPH/Fe3 plus-System als Tubulosid B (7)2,-Acetylacteosid (^^Isoacteosid (8) Acteosid (5) > Tubulosid A (3) > Echinaco-Seite (4) > Syringalid A 3z-a-Rhamnopyranosid (6) > Cistanosid A (2) > Cistanosid F (9) Diese beiden Reihenfolgen waren ähnlich wie in den obigen Radikalfängertests, insbesondere im DPPH-Radikalfängertest, aber die Anzahl der phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül spielte die wichtigste Rolle bei der Hemmung der Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen.

Wirkungen von Cistanche

DISKUSSION

Wir testeten die Radikalfängeraktivitäten der verschiedenen Lösungsmittelextrakte des Stengels von Cistanche deserticola auf DPPH-Radikale und fanden heraus, dass der Aceton-H2O (9:1)-Extrakt die stärkste Aktivität aufwies. Um die aktiven Bestandteile der Aktivität zum Einfangen freier Radikale zu finden, isolierten wir neun wichtige Phenylethanoidverbindungen aus diesem Extrakt und bestimmten ihre Strukturen durch NMR.

Die antioxidativen Wirkungen dieser Phenylethanoide wurden anhand ihrer Aktivität zum Abfangen freier Radikale und ihrer Anti-Lipid-Peroxidationsaktivität bewertet. Als positive Kontrollsubstanz wurde das allgemein bekannte a-Tocopherol verwendet. Als dieDie Lipophilie von a-Tocopherol kann seine Aktivitäten in den vorliegenden Assay-Systemen beeinflussen, mit Ausnahme des DPPH-Radikalfänger-Assays nahmen wir Kaffeesäure als eine weitere positive Kontrollsubstanz.

Zuerst führten wir Tests zu den Aktivitäten zum Abfangen freier Radikale durch. Alle 9 getesteten Phenylethanoide zeigten zweifellos stärkere DPPH-Radikal- und Superoxidanion-Radikalfängeraktivitäten als a-Tocopherol, aber einige waren stärker und andere schwächer als Kaffeesäure. Die Radikalfängeraktivität nahm mit zunehmender Zahl der phenolischen Hydroxylgruppen zu. Es wurde angenommen, dass die unvollständige Parallelität der Abfangaktivitäten von DPPH-Radikalen und Superoxid-Anionen auf die unterschiedlichen Eigenschaften zwischen den Radikalspezies und einigen anderen Faktoren zurückzuführen ist, die an diesen beiden Reaktionssystemen beteiligt sind,21,26), da das DPPH-Radikal ein chemisch induziertes Radikal ist, das reagiert mit Radikalfängern auf einfache chemische Weise, während das Superoxid-Anion-Radikal durch Xanthin/XOD, eine Enzymreaktion, erzeugt wird.

Wenn die Phenylethanoide das Xanthin/XOD-generierte Superoxidanion-Radikal hemmen, könnte die Hemmung als das Ergebnis ihrer Superoxidanion-Radikalfängeraktivität oder (und) ihrer Hemmung des Enzyms XOD angesehen werden,23) also führten wir einen Test mit ihnen durch hemmende Wirkung von Xanthinoxidase. Interessanterweise zeigten selektiv nur Isoacteosid (8) und Tubulosid B (7), dessen Caffeoyl-Einheit sich an der 6/-Position der Glucose befindet, eine Hemmung. Sie zeigten eine Wirkung bei einer Konzentration von 25–200 jtiM auf 3,4 × 10 ^ 3 U/ml (10 μg/ml) XOD, obwohl die Aktivität schwächer war als bei Allopurinol; andere Verbindungen, deren Caffeoyl-Einheit sich an der Position der Glucose befindet, zeigten keine inhibitorische Wirkung. Dieses Ergebnis lieferte den ersten Bericht über die hemmende Wirkung von Phenylethanoiden auf das XOD-Enzym. Chan et al.21) berichteten, dass Kaffeesäure und einige ihrer Analoga hemmende Wirkungen auf die XOD-Aktivität haben, wir fanden jedoch keine solche Wirkung von Kaffeesäure unter den vorliegenden Reaktionsbedingungen. In diesem Test war die XOD-Konzentration ähnlich der in dem Test der Wirkung auf die Bildung von Superoxid-Anion-Radikalen (4,3 /zg/ml), aber die Konzentration der Verbindungen war viel höher als in letzterem. Daher beruht die Hemmung der Oj-Erzeugung durch diese Phenylethanoide auf ihrer radikalfangenden Aktivität, aber nicht auf ihrer hemmenden Aktivität des XOD-Enzyms.

Dass die Kettenreaktion freier Radikale schließlich zu einer Lipidperoxidation führt, ist bekannt.28,29) Wir untersuchten daher diese Phenylethanoidverbindungen auf ihre Wirkungen auf die Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen, die durch das enzymatische System ADP/NADPH/Fe3 plus induziert wurde, und auf die durch das nicht-enzymatische System Ascorbinsäure/Fe2 plus . Alle diese Verbindungen zeigten in beiden Systemen stärkere Anti-Lipid-Peroxidationswirkungen als Kaffeesäure und a-Tocopherol. Es ist allgemein anerkannt, dass beide Systeme durch Eisenionen katalysiert werden, entweder Fe2 plus oder Fe3 plus , die an Lipidperoxylradikalen beteiligt sind,30,31) und dass das Hydroxylradikal OH die wichtigste Rolle bei der Lipidperoxidation spielt,32 _34) obwohl die Initiierung von OH in einigen Berichten in Frage gestellt wurde.35祁6) Andererseits ist das Superoxid-Anion-Radikal OJ, das das primäre Produkt des e_-Angriffs auf O2 in der Radikalkette ist, ziemlich schlecht reaktives Radikal und führt selbst nicht zur Lipidperoxidation. Obwohl diese Phenylethanoide eine schwächere Fängerwirkung auf Superoxid-Anion-Radikale zeigten als Kaffeesäure, zeigten sie eine viel stärkere Anti-Lipid-Peroxidationswirkung als letztere. Daher glauben wir, dass sie, wie einige andere aromatische, kettenbrechende Polyphenole, die obige Lipidperoxidation in Rattenlebermikrosomen hemmen können, indem sie Fe2+- oder Fe3+-Ionen chelatieren und auch Superoxidradikale Oj abfangen, um die Radikalkettenreaktion zu brechen .37,38) Darüber hinaus können sie auch toxischere Radikalarten wie Hydroxylradikale und Lipidperoxylradikale abfangen, um die Lipidperoxidation mit höherer Wirksamkeit als Kaffeesäure direkt zu unterbrechen.38,39)

Liet al. untersuchten einige Phenylethanoidglykoside, darunter Acteosid (Verbascosid) (5), Isoacteosid (Isoverbascosid) (1) und Echinacosid (4) aus Pedicularis auf ihre Hemmung der Autoxidation von Linolsäure in Micellen, einem nicht biologischen System,13) für ihren Schutz vor oxidativer Hämolyse in vitro14''1 und auch für ihre abfangenden Wirkungen auf NBT/PMS/NADH-erzeugtes Superoxid und Hemmung der durch Ascorbinsäure/Fe2 plus in Mauslebermikrosomen induzierten Lipidperoxidation.15) Eine ähnliche Aktivität -Struktur-Beziehung wurde in den Berichten von Li et al. und unsere Ergebnisse. Das heißt, die Aktivitäten von Phenylethanoiden zur Hemmung der Lipidperoxidation hängen hauptsächlich von der Anzahl und sterischen Position der phenolischen Hydroxylgruppen ab.15) Aufgrund ihrer Stereochemie sind die phenolischen Hydroxylgruppen der Caffeoyleinheit auf Acteosid (5), Tubulosid A ( 3) und Echinacosid (4), die das Caffeoyl an der 4z-Position der Glucose haben, würden leichter eine Wasserstoffbrücke mit den Hydroxylgruppen von Rhamnosyl bilden als die von Isoacteosid (8) und Tubulosid B (7), die haben das Caffeoyl an der 6'-Position der Glucose. Somit behielten die letzteren mehr freie phenolische Hydroxylgruppen als die ersteren und zeigten daher eine stärkere Anti-Lipid-Peroxidationsaktivität. Wir stellten auch fest, dass die 2z-Acetylierung dieser Phenylethanoide, wenn auch geringfügig, ihre antioxidativen Wirkungen verstärkte. Beispielsweise zeigten Acteosid (5) und Isoacteosid (8) bei 2'-Acetylierung zu 2/-Acetylacteosid (1) bzw. Tubulosid B (7) stärkere Aktivitäten in allen vier Testsystemen. Aufgrund der Überlegenheit der Stereochemie und der 2'-Acetylierung zeigte Tubulosid B (7) die stärkste antioxidative Aktivität unter den getesteten Proben. Vielleicht aufgrund der Substitution einer dritten Zuckereinheit an der 6'-Position passte diese Korrelation im Fall von Tubulosid A (3) oder Echinacosid (4) nicht gut; im ADP/NADPH/Fe3 plus-System zeigte Tubulosid A ⑶ jedoch immer noch eine stärkere Anti-Lipid-Peroxidationsaktivität als Echinacosid (4).

Außerdem zeigte die Reihenfolge der DPPH-Radikalfängeraktivität eine bessere Parallelität mit der der Anti-Lipid-Peroxidation als die Reihenfolge der Superoxidanion-Radikalfängeraktivität. Dies bewies erneut, dass der DPPH-Radikalfänger-Assay eine bequeme und zuverlässige Methode für Antioxidantien-Assays ist,26) obwohl das DPPH-Radikal ein chemisch induziertes Radikal ist, während das Superoxid-Anion-Radikal ein biologisch endogenes Radikal sein könnte.

Zusammenfassend zeigten alle neun Phenylethanoide in der vorliegenden Studie signifikante Aktivitäten zum Abfangen freier Radikale und Anti-Lipid-Peroxidationswirkungen. Die antioxidative Wirkung wurde durch eine Erhöhung der Anzahl phenolischer Hydroxylgruppen im Molekül potenziert. Wie man sich vorstellen kann, spielen die hier nachgewiesenen antioxidativen Wirkungen dieser Phenylethanoide möglicherweise eine wichtige Rolle bei den Wirkungen des Arzneimittels Cistanchis Herba und können teilweise die Mechanismen der Aktivitäten einiger Phenylethanoide gegen Neoplasmen8* Entzündungen10) und Nephritis erklären. 1 n, an denen freie Radikale ernsthaft beteiligt sind.

Cistsanche Echinacoside: Antioxidationsmittel

VERWEISE

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