Angemessenes Trainingsniveau mildert Darmdysbiose und Valeriansäureanstieg, um Neuroplastizität und kognitive Funktion nach einer Operation bei Mäusen zu verbessern, Teil 3

MATERIALEN UND METHODEN

Die Versuchsprotokolle und -verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia (Charlottesville, VA, USA; Protokollnummer: 3114) genehmigt.

Das Gedächtnis ist eine der Fähigkeiten, die wir in unserem täglichen Leben häufig nutzen müssen. Es kann Menschen klüger, sensibler und förderlicher für Karriere und zwischenmenschliche Beziehungen machen. Daher möchten viele Menschen ihr Gedächtnis verbessern. Es besteht ein Zusammenhang zwischen experimentellen Protokollen und dem Gedächtnis. Lassen Sie uns dieses Problem als nächstes untersuchen.

Erstens können experimentelle Protokolle Menschen dabei helfen, ihr Gedächtnis zu verbessern. Im Experiment müssen die Personen bestimmte Schritte befolgen, um den experimentellen Vorgang abzuschließen. Diese schrittweise Aktivität kann das menschliche Gehirn in einen Zustand hoher Aufmerksamkeit und Konzentration versetzen und so die Leistungsfähigkeit der Gehirnfunktionen fördern. Gleichzeitig müssen Sie sich während des Experiments einige experimentelle Daten und experimentelle Schritte merken, die auch die Gedächtnisfunktion des Gehirns trainieren. Durch wiederholtes Üben auf diese Weise wird sich Ihr Gedächtnis allmählich verbessern.

Zweitens hängt auch die Sinneserfahrung während des Gedächtnisprozesses eng mit der Gestaltung des Versuchsplans zusammen. In Experimenten stellen Designer während des Experiments häufig bestimmte spezifische Aufgaben, sodass die Teilnehmer denselben Vorgang mehrmals wiederholen müssen, z. B. das Erinnern und Schreiben von Zahlen, das Erinnern und Erkennen von Farbblöcken usw. Diese sich wiederholende Erfahrung kann die Fähigkeiten der Menschen stärken Aufmerksamkeits- und Gedächtnisfähigkeiten, wodurch es für Menschen einfacher wird, diese Informationen im Langzeitgedächtnis zu verarbeiten.

Darüber hinaus kann in Experimenten auch der Einsatz repräsentativer Reizmaterialien (wie Bilder, Töne, Gerüche etc.) gute Ergebnisse liefern. Denn diese Reize können Erregungs- und Gedächtnisprozesse im Gehirn auslösen und so die Gedächtnisleistung des Menschen verbessern. Gleichzeitig können diese Reize auch mit der Umgebung und Lebenssituationen gekoppelt werden, wodurch das Auftreten von Entkopplungen verringert wird und die Informationen leichter zu merken und zusammenhängender sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Versuchsplan eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung des menschlichen Gedächtnisses spielt. Durch die Durchführung von Experimenten können Menschen ihre kognitiven Fähigkeiten trainieren, ihr Gedächtnis verbessern und gleichzeitig die Gehirnfunktion fördern. Deshalb sollten wir weiterhin neue experimentelle Methoden erlernen und an mehr Experimenten teilnehmen, um unser Gedächtnis zu verbessern und einen größeren Beitrag zu unserer Karriere, unseren Beziehungen und unserer Gesundheit zu leisten. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola antioxidative, entzündungshemmende und Anti-Aging-Wirkungen hat, die dazu beitragen können, Oxidations- und Entzündungsreaktionen im Gehirn zu reduzieren und so das Gehirn zu schützen Gesundheit des Nervensystems. Darüber hinaus kann Cistanche deserticola auch das Wachstum und die Reparatur von Nervenzellen fördern und so die Konnektivität und Funktion neuronaler Netzwerke verbessern. Diese Effekte können dazu beitragen, das Gedächtnis, die Lernfähigkeit und die Denkgeschwindigkeit zu verbessern und können auch die Entwicklung kognitiver Dysfunktionen und neurodegenerativer Erkrankungen verhindern.

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Alle Tierversuche wurden gemäß dem 2011 überarbeiteten National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH-Publikationsnummer 80–23) durchgeführt. Die Quellen der wichtigsten Materialien sind in der Tabelle mit den wichtigsten Ressourcen in den ergänzenden Materialien aufgeführt.

Tiere und experimentelles Design

Acht Wochen alte männliche C57BL/6 J-Mäuse mit einem Gewicht von 19–22 g wurden in einem Raum gehalten, der unter konstanten Umgebungsbedingungen (Temperatur 22–24 Grad, ein 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus und 50 ± 10 % Luftfeuchtigkeit) mit freiem Zugang zu Futter gehalten wurde und Wasser.

Alle durften sich vor den Experimenten eine Woche lang akklimatisieren. Im ersten Experiment wurden sie nach dem Zufallsprinzip den folgenden Gruppen zugeteilt: (1) Kontrollgruppe (ohne Anästhesie und Operation), (2) Übungsgruppe (mit 35–40 % maximaler Kapazität trainiert, aber ohne Anästhesie und Operation) , (3) Operationsgruppe (Freilegung der linken Halsschlagader für 15 Minuten unter Isofluran-Anästhesie für 2 Stunden) und (4) bis (6) Exe-l+Sur-, Exe-m+Sur- und Exe-h+Sur-Gruppen: trainiert bei 35 –40 %, 55–60 % bzw. 75–80 % maximale Kapazität und wurden einer Anästhesie und einem chirurgischen Eingriff unterzogen.

Die Tiere wurden ab 4 Tagen nach der Operation (n=20) für Lern- und Gedächtnistests verwendet oder ihre Gehirne wurden 6 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 96 Stunden und 7 Tage nach der Operation für biochemische Tests entnommen (n=9 oder 14), für die Immunfluoreszenzfärbung 48 Stunden und 19 Tage nach der Operation (n=6) und für die Golgi-Färbung 19 Tage nach der Operation (n=8).

Blut und Kot von Mäusen der ersten 4 Gruppen wurden zur Messung der SCFAs 7 Tage nach der Operation (n=7) und für 16 S-Analysen 3 und 7 Tage nach der Operation (n=8) oder bei entnommen am Ende des 4-wöchigen Trainingsprotokolls (n=8) ​​oder zum entsprechenden Zeitpunkt in den ersten beiden Gruppen (n=16). Bei den Mäusen für die Gewebeentnahme handelte es sich um verschiedene Kohorten von Mäusen, die für Lern- und Gedächtnistests verwendet wurden. Im zweiten Experiment wurden die Mäuse zufällig (1) der Transcontrol+Sur-Gruppe und (2) der Trans-exe+Sur-Gruppe zugeordnet.

Mäuse in der ersten Gruppe erhielten 500 μl Stuhllösung aus der Kontrollgruppe über eine Magensonde und 600 μl über einen Einlauf einmal täglich an sieben aufeinanderfolgenden Tagen nach der Antibiotikabehandlung, um die native Darmmikrobiota der Empfänger zu eliminieren. Mäuse in der zweiten Gruppe erhielten 500 μl Stuhllösung von Übungsmäusen durch Magensonde und 600 μl durch Einlauf einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen nach der Antibiotikabehandlung. Der Kot der Empfänger wurde 14 Tage nach der Kottransplantation für die 16-S-Analyse entnommen. Anschließend wurden die Mäuse operiert.

Lernen und Gedächtnis wurden ab 4 Tagen nach der Operation bewertet (n=15). Das Gehirn wurde wie im ersten Experiment (n=10) für biochemische Studien entnommen. Im dritten Experiment wurden die Mäuse zufällig (1) der Transcontrol-Gruppe und (2) der Trans-control+Sur-Gruppe zugeordnet. Mäuse in beiden Gruppen erhielten eine Kottransplantation von Kontrollmäusen. Die zweite Gruppe wurde 14 Tage nach der Stuhltransplantation operiert. Der Hippocampus wurde zwei Tage nach der Operation entnommen, um GDNF (n=10) zu messen. Im vierten Experiment wurden Mäuse nach dem Zufallsprinzip (1) der Kontrollgruppe (naive Mäuse, die keinen in dieser Studie beschriebenen experimentellen Bedingungen ausgesetzt waren) zugeordnet. (2) die Antibiotika-Gruppe, die 7 Tage lang Antibiotika erhielt, und (3) die Trans-Kontrollgruppe, die eine Kottransplantation von Kontrollmäusen erhielt.

Lernen und Gedächtnis wurden 19 Tage nach Abschluss der Stuhltransplantation (26 Tage nach Abschluss der Antibiotikabehandlung in der Antibiotikagruppe) bewertet (n=12). Im fünften Experiment wurden Mäuse zufällig (1) der Kontrollgruppe zugeordnet. (2) die Trans-Kontrollgruppe, die eine Transplantation von Kot von Kontrollmäusen erhielt, und (3) die Trans-Chirurgie-Gruppe, die eine Transplantation von Kot von Operationsmäusen erhielt. 

Die Stuhltransplantation wurde wie im zweiten Experiment beschrieben durchgeführt. Der Kot der Empfänger wurde 14 Tage nach der Kottransplantation für die 16-S-Analyse (n=10) entnommen. Lernen und Gedächtnis wurden 4 Tage nach der Entnahme der Stuhlprobe bewertet (n=17). Im sechsten Experiment wurden Mäuse nach dem Zufallsprinzip einer (1) Operationsgruppe plus normaler Kochsalzlösung zugeteilt, die einmal 200 µl normale Kochsalzlösung (NS) durch intraperitoneale Injektion erhielt eine Woche für 4 Wochen und dann eine Operation, (2) Training plus normale Kochsalzlösung plus Operation, Gruppe, die einmal wöchentlich 200 µl NS durch intraperitoneale Injektion während der 4- Woche Training bei 35–40 % maximaler Kapazität und dann Operation erhielt, (3 ) Training plus Valeriansäure plus Operationsgruppe, die Valeriansäure (200 mg/kg in 200 µl) einmal pro Woche durch intraperitoneale Injektion während der 4-Woche erhielt, Training bei 35–40 % maximaler Kapazität und dann Operation.

Die Injektion erfolgte am Morgen des ersten Trainingstages der Woche. Eine weitere Injektion erfolgte am Operationstag. Verhaltensbezogene (n=13) und biochemische (n=10) Ergebnisse wurden wie im zweiten Experiment bewertet. Im siebten Experiment wurden 13- Wochen alte (23–27 g schwere) männliche C57BL/ 6 J-Mäuse wurden zufällig (1) der Kontrollgruppe, (2) der NS-Gruppe, die 4 µl NS durch intrazerebroventrikuläre Injektionen einmal täglich an 4 aufeinanderfolgenden Tagen erhielt, und (3) der Valeriansäuregruppe, die 4 mg/kg in 4 µl durch intrazerebroventrikuläre Injektionen erhielt, zugeteilt Injektion einmal täglich an 4 aufeinanderfolgenden Tagen. Der linke und der rechte Großhirnventrikel wurden nach einem abwechselnden Zeitplan injiziert. Lernen und Gedächtnis wurden 4 Tage nach der Injektion beurteilt (n=15).

Im achten Experiment wurden Mäuse nach dem Zufallsprinzip einer (1) Gruppe mit Operation plus Dimethylsulfoxid (DMSO) zugeteilt, die DMSO durch intrazerebroventrikuläre Injektion einmal täglich an vier aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend am Tag der Operation, erhielt, (2) der Gruppe mit Operation plus C3ar-Antagonist, die C3ar-Antagonist (SB290157) erhielt ) durch intrazerebroventrikuläre Injektion einmal täglich für 4 Tage, beginnend am Tag der Operation, (3) Übung plus DMSO plus Operationsgruppe, die DMSO einmal täglich durch intrazerebroventrikuläre Injektion an 4 aufeinanderfolgenden Tagen erhielt, beginnend am Tag der Operation nach der 4-wöchigen Übung im Alter von 35 Jahren –40 % maximale Kapazität und (4) Training plus C3ar-Agonist plus Operationsgruppe, die an 4 aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich einen C3aragonisten durch intrazerebroventrikuläre Injektion erhielt, beginnend am Operationstag nach der 4-wöchigen Belastung bei 35–40 % maximaler Kapazität . Verhaltenstests wurden 4 Tage nach der Operation wie oben angegeben begonnen (n=15).

Im neunten Experiment wurden Mäuse nach dem Zufallsprinzip (1) der Kontrollgruppe, (2) der Operationsgruppe, (3) der Operations-plus-GDNF-Gruppe, die bei der Operation GDNF durch intrazerebroventrikuläre Injektion erhielt, und (4) der Operations-plus-hitzeinaktivierten GDNF-Gruppe zugeteilt Gruppe, die bei einer Operation hitzeinaktiviertes GDNF durch eine intrazerebroventrikuläre Injektion erhielt. Hippocampi wurden 48 Stunden nach der Operation für die ELISA-Studie geerntet (n=12). Nach einer Woche Eingewöhnung wurden alte Mäuse (18- Monate alte männliche C57BL/6 J-Mäuse) mit einem Gewicht von 30–36 g verwendet drei Studien. Im ersten Experiment wurden alte Mäuse nach dem Zufallsprinzip (1) der Kontrollgruppe, (2) der Übungsgruppe, in der die Mäuse eine 4-wöchige Übung bei 35–40 % maximaler Kapazität absolvierten, (3) der Operationsgruppe und (3) der Operationsgruppe zugeordnet (4) die Exe+Sur-Gruppe, in der Mäuse vor der Operation eine 4-wöchige körperliche Betätigung mit 35–40 % maximaler Kapazität absolvierten. Die Tiere wurden ab 4 Tagen nach der Operation (n=12) für Lern- und Gedächtnistests verwendet, oder ihre Gehirne wurden 48 Stunden nach der Operation (n=10 oder 12) für biochemische Tests und nach 48 Stunden für eine Immunfluoreszenzfärbung entnommen und 19 Tage nach der Operation (n=6) und für Golgifärbung 19 Tage nach der Operation (n=8).

Blut und Kot von Mäusen der 4 Gruppen wurden für die SCFA-Messung 7 Tage nach der Operation (n=7) und für 16 S-Analysen 3 und 7 Tage nach der Operation (n=8) oder am Ende entnommen des 4-wöchigen Trainingsprotokolls oder zum entsprechenden Zeitpunkt in den ersten beiden Gruppen (n=16). Bei den Mäusen für die Gewebegewinnung handelte es sich um verschiedene Kohorten, die für Lern- und Gedächtnistests verwendet wurden. Im zweiten Experiment wurden alte Mäuse nach dem Zufallsprinzip (1) der Trans-Old Control+Sur-Gruppe und (2) der Trans-Old Exe+Sur-Gruppe zugeordnet. Diese Mäuse wurden 14 Tage nach der Stuhltransplantation wie in beschrieben operiert zweites Experiment mit jungen erwachsenen Mäusen. Lernen und Gedächtnis wurden ab 4 Tagen nach der Operation bewertet (n =10).

Im dritten Experiment wurden alte Mäuse zufällig der (1)Operation plus NS-Gruppe zugeteilt; (2) Übung plus NS plus Operationsgruppe; und (3) Übung plus Valeriansäure plus Operationsgruppe. Diese Mäuse erhielten Trainingskonditionierung und Valeriansäure, wie im sechsten Experiment mit jungen erwachsenen Mäusen beschrieben. Die Verhaltensergebnisse wurden ab 4 Tagen nach der Operation getestet (n=11). Die oben beschriebenen Stichprobengrößen (n) stellten die Anzahl der Tiere dar, die in jede Gruppe/jeden Zustand randomisiert wurden. Diese Tierzahlen entsprachen der Summe von mindestens drei Wiederholungen jedes Experiments. Die Tiere wurden in jedem Experiment auf der Grundlage computergenerierter Randomisierungstabellen zufällig in Gruppen eingeteilt.

Bestimmung der maximalen Trainingskapazität und Trainingstraining

Vor der Operation wurden {{0}}Wochen und 18-Monate alte Mäuse einem {{3}wöchigen Aerobic-Training auf dem Laufband ausgesetzt, nachdem die maximale Trainingskapazität der einzelnen Mäuse ermittelt worden war. Diese Bestimmung wurde auf ähnliche Weise wie zuvor beschrieben durchgeführt [47, 48]. Kurz gesagt, die Mäuse wurden am ersten Tag an das Laufband gewöhnt, wobei die anfänglichen Einstellungen des Stoßgitters auf 25 V, 0,3 mA und 2 Hz und die Geschwindigkeit und Neigung 10 Minuten lang auf Null eingestellt waren. Anschließend wurde die Laufbandgeschwindigkeit auf 10 cm/s erhöht und die Neigung 10 Minuten lang auf 50 eingestellt. Anschließend wurden die Laufbandgeschwindigkeit und -neigung für 5 Minuten auf 15 cm/100 Sand erhöht.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50 % der Zeit am Netz; und/oder (3) mangelnde Motivation zum manuellen Anstupsen. Die Maus wurde sofort aus der jeweiligen Spur entfernt, sobald eines oder mehrere dieser Kriterien erfüllt waren. Am nächsten Tag liefen die Mäuse auf demselben Laufband mit der Hälfte der durchschnittlichen Maximalgeschwindigkeit (35 cm/s bei jungen Mäusen oder 30 cm/s bei alten Mäusen) und einer Steigung von 100, bis sie erneut eines der Erschöpfungskriterien erreichten Kontinuierliches Training wurde als maximale Trainingskapazität jeder Maus aufgezeichnet. Nach diesen beiden Protokollen wurden die Mäuse 30 Minuten lang getrennt gehalten, um auffälliges aggressives Verhalten nach dem Training zu vermeiden.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >3 % der Gesamtzeit an drei aufeinanderfolgenden Tagen würden ausgeschlossen.

Die Nicht-Übungsgruppen in derselben Versuchsreihe wie die Übungsgruppen wurden täglich etwa 30–40 Minuten lang auf ein stillstehendes Laufband gesetzt. Sie erhielten insgesamt 5 Sekunden lang 10 Schocks, die durchschnittliche Anzahl an Schocks, die Mäuse in einer Trainingsgruppe jeden Tag während ihres Aufenthalts auf einem sich nicht bewegenden Laufband erhielten. Wenn eine Versuchsreihe keine Übungsgruppe hatte, erhielten keine Mäuse in der Versuchsreihe Schocks.

Antibiotikabehandlung

Um die Kolonisierung der transplantierten Mikrobiota zu erleichtern, erhielten Empfängermäuse einmal täglich an sieben aufeinanderfolgenden Tagen eine Antibiotikabehandlung, um ihre ursprüngliche Darmmikrobiota zu eliminieren, wie von uns und anderen beschrieben [11, 36]. Kurz gesagt, nach der Spülung mit 10 % Magnesiumsulfat (200 µl/10 g, zweimal im Abstand von 3 Stunden) durch Magensonde am ersten Tag erhielten C57BL/6 J-Mäuse Amoxicillin/Clavulansäure (200 mg/kg), Metronidazol ( 200 mg/kg) und Cefazolin (2 g/kg) durch Magensonde und Einlauf (in 300 µl bei Magensonde und 400 µl NS bei Einlauf) morgens einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen und Amoxicillin/Clavulansäure (20 mg/kg). ), Metronidazol (20 mg/kg) und Cefazolin (300 mg/kg) in 200 ul NS täglich durch intraperitoneale Injektion für die gleichen 7 Tage (von 16 bis 17 Uhr). Um eine bakterielle Kreuzkontamination zu verhindern, wurden die Handhabung der Mäuse sowie der tägliche Käfig- und Wasserflaschenwechsel von Technikern durchgeführt, die einen sauberen Kittel und Handschuhe unter einer belüfteten Haube trugen. Der Kot dieser Mäuse wurde 24 Stunden nach der letzten Behandlung für 16 S-Analysen zur Bestimmung der Wirkung geerntet.

Stuhltransplantation

Frische Kotpellets, die innerhalb von 30 Minuten nach dem Stuhlgang von Kontrollmäusen, Mäusen unmittelbar nach Abschluss der 4-wöchigen Übung und Ormäusen 2 bis 8 Tage nach der Operation gesammelt wurden, wurden mit 100 mg/ml steriler Kochsalzlösung verdünnt. Alle Kotpellets von 7 –10 Spender mit jeder Versuchsbedingung wurden gemischt und zusammen in Kochsalzlösung resuspendiert. Kurz gesagt, die Fäkalien wurden 5 Minuten lang im Vortex gemischt und dann durch ein 70-μm-Nylon-Zellsieb geleitet, um unverdaute Nahrung und Partikelmaterialien zu entfernen. Die Empfängermäuse erhielten 24 Stunden nach der letzten Antibiotikadosis an 7 aufeinanderfolgenden Tagen morgens 500 μl entsprechende Fäkalienlösung durch Magensonde und nachmittags 600 μl durch Einlauf. Transplantierte Mäuse wurden nach der Kottransplantation zwei Wochen lang gehalten, bevor sie einer Kotsammlung für 16-S-Analysen und chirurgische Eingriffe unterzogen wurden.

Anästhesie und Operation

Bei der Operation wurde die Halsschlagader freigelegt, wie wir zuvor beschrieben haben [6]. Kurz gesagt wurden die Mäuse mit 2 % Isofluran anästhesiert und hielten während des Eingriffs ihre Spontanatmung mit einer Gesichtsmaske aufrecht, die mit 1 0 0 % Sauerstoff versorgt wurde. Die Rektaltemperatur wurde überwacht und mit Hilfe einer Heizdecke auf 37 Grad gehalten. Nachdem die Maus mindestens 20 Minuten lang mit Isofluran anästhesiert worden war, wurde ein Schnitt in der Mittellinie des Halses von 2- cm und eine Weichteildissektion mit einer Freilegung der gemeinsamen Arterie von 1- cm Länge durchgeführt, ohne dass der Vagusnerv geschädigt wurde. Anschließend wurde die Wunde gespült und mit einer chirurgischen Naht der Stärke 4–0 verschlossen. Der chirurgische Eingriff wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt und dauerte bei jungen Mäusen etwa 15 Minuten und bei alten Mäusen etwa 12 Minuten. Die Gesamtdauer der Vollnarkose betrug 2 Stunden. Nach der Operation erhielten alle Tiere eine subkutane Injektion von 3 mg/Kbupivacain. Während der Anästhesie wurde keine Reaktion auf das Einklemmen der Zehen beobachtet.

Intracerebroventrikuläre Injektionen

Wie oben beschrieben erhielten einige Gruppen von Mäusen eine intrazerebroventrikuläre Injektion. Kurz gesagt, diese Mäuse wurden in Bauchlage in einen stereotaktischen Kopfrahmen gebracht. Die Injektionsstelle befand sich wie folgt: 1,00 mm mediolateral, −0,3 mm anteroposterior von Bregma und −2,5 mm dorsoventrale Tiefe. Mäuse der operierten plus GDNF-Gruppe erhielten eine intrazerebroventrikuläre Injektion von 1{{ 20}} ug/kg rekombinanter Maus-GDNF in 3 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), wie in früheren Studien beschrieben [6, 26], und Mäuse in der chirurgischen plus hitzeinaktivierten GDNF-Gruppe erhielten eine Injektion von hitzedenaturiertem (5 Minuten bei 100 °C). ) GDNF-Lösung. Mäuse in der Operation plus die C3ar-Antagonistengruppe erhielten 10 ug/kg SB290157 in 3 ul PBS mit 5 % DMSO 0 h, 24 h, 48 h und 72 h nach der Operation. Mäuse in der Übungsgruppe plus C3ar-Agonist und in der Operationsgruppe erhielten 1 μg/kg C3ar-Agonist in 3 μl PBS mit 5 % DMSO zur gleichen Zeit wie für SB290157. Mäuse in einer Valeriansäure-Gruppe des sechsten Experiments erhielten an 4 aufeinanderfolgenden Tagen 4 mg/kg Valeriansäure in 4 µl.

Verhaltenstests

Lernen und Gedächtnis wurden durch die Erkennung neuartiger Objekte und den Barnes-Labyrinthtest bewertet. Alle Verhaltenstests wurden um 10:00–17:00Uhr in einem schallisolierten Raum durchgeführt. Mäuse, die in den Lern- und Gedächtnistests verwendet wurden, wurden nicht für biochemische Studien verwendet, um die Auswirkungen dieser Tests zu vermeiden.

Neuartiger Objekterkennungstest

Wie wir und andere zuvor beschrieben haben [20, 49, 50], wurden Mäuse 4 Tage nach der Operation zur Gewöhnung für 5 Minuten in eine Freilandkammer gebracht. Der Test wurde auf folgende Weise durchgeführt. Am Lerntag wurden zwei gleiche Objekte in benachbarten Winkeln der Kammer platziert. Mäuse wurden mit dem Rücken zu den Objekten in die Kammer gesetzt und durften die Kammer 5 Minuten lang frei erkunden. Das Tier wurde eliminiert, wenn die Gesamterkundungszeit auf zwei Objekten betrug<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Barnes-Labyrinth

Sieben Tage nach der Operation wurden die Tiere dem Barnes-Labyrinth ausgesetzt, um ihr räumliches Lernen und Gedächtnis zu testen, wie wir zuvor beschrieben haben [6, 49]. Das Barnes-Labyrinth ist eine kreisförmige Plattform mit 20 Löchern in gleichen Abständen (SDInstruments, San Diego, CA). Eines der Löcher war mit einer Dunkelkammer verbunden, die Zielbox genannt wurde. Der Test begann damit, dass Tiere in die Mitte des Barnes-Labyrinths gestellt wurden. Aversiver Lärm (85 dB) und helles Licht (200 W) auf der Plattform wurden verwendet, um Mäuse dazu zu bringen, diese Box zu finden. Nach 4-tägigem Training wurde ihr Referenzgedächtnis am 5. und 12. Tag getestet. Während des Zeitraums wurde kein Test durchgeführt von Tag 5 bis Tag 12. Die Latenz bis zum Betreten der Zielbox während jedes Versuchs wurde von einem ANYMaze-Videoverfolgungssystem (SD Instruments) aufgezeichnet.

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