Aristolochinsäure induziert Nierenfibrose und Seneszenz bei Mäusen

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt:Die Niere ist eines der anfälligsten Organe für altersbedingte Beeinträchtigungen. Im Allgemeinen wird die Nierenalterung von einer Nierenfibrose begleitet, die der letzte gemeinsame Weg einer chronischen Erkrankung istNierenerkrankungen. Aristolochinsäure (AA), ein nephrotoxischer Wirkstoff, verursacht eine AA-Nephropathie (AAN), die durch fortschreitende Nierenfibrose und Funktionsabfall gekennzeichnet ist. Obwohl die Nierenfibrose mit der Nierenalterung assoziiert ist, bleibt unklar, ob AA die Nierenalterung induziert. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, die potenzielle Verwendung von AAN als Modell der renalen Alterung zu untersuchen. Hier untersuchten wir seneszenzbezogene Faktoren in AAN-Modellen, indem wir C57BL/6-Mäusen chronisch AA verabreichten. Verglichen mit Kontrollen zeigte die AA-Gruppe eine AlterungNierePhänotypen wie Nierenatrophie, Abnahme der Nierenfunktion und tubulointerstitielle Fibrose. Zusätzlich förderte AA die zelluläre Seneszenz speziell in derNierenund erhöhte renale p16-mRNA-Expression und Seneszenz-assoziierte -Galactosidase-Aktivität. Darüber hinaus zeigten mit AA behandelte Mäuse Anomalien der proximalen tubulären Mitochondrien sowie eine Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies. Klotho, ein Anti-Aging-Gen, war ebenfalls signifikant verringertNierenvon AA-behandelten Mäusen. Insgesamt weisen die Ergebnisse der vorliegenden Studie darauf hin, dass AA alterungsbedingte Faktoren verändert und dass die Nierenfibrose eng mit der Nierenalterung zusammenhängt.

Schlüsselwörter:chronisches Nierenleiden; Nierenfibrose; Aristolochinsäure; Altern; Zellalterung

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN

EinführungMit der immer länger werdenden Lebenserwartung des Menschen leiden immer mehr Menschen an altersbedingten Beeinträchtigungen.Nierensind typischerweise von altersbedingten Gewebeschäden betroffen, und das Auftreten von chronischenNierenerkrankungnimmt mit zunehmendem Alter zu [1]. Die renale Alterung beschleunigt die allgemeine Alterung, was zu einer kürzeren Lebensdauer führt. Daher ist Forschung zur renalen Alterung notwendig, obwohl geeignete Tiermodelle noch nicht vollständig entwickelt sind. Die renale Alterung wird von verschiedenen pathologischen Veränderungen begleitet, darunter Nierenatrophie, Glomerulosklerose und tubulointerstitielle Fibrose [2]. Die tubulointerstitielle Nierenfibrose ist der letzte gemeinsame Weg bei den meisten Formen fortschreitender Nierenerkrankung, was darauf hindeutet, dass die Nierenfibrose eng mit dem Alter verbunden istNiere. In der Alternsforschung sind Mäuse aufgrund ihrer genetischen Nähe zum Menschen, der Fähigkeit zur genetischen Manipulation ihres Genoms und der Tatsache, dass sie im Laufe ihres Lebens ähnliche altersbedingte Phänotypen wie Menschen aufweisen, ein zuverlässiges Werkzeug [3]. Längsschnittbeobachtungen mit Inzuchtmäusen eignen sich ideal als Alterungsmodell, obwohl es zeitaufwändig ist, Mäuse über ihre gesamte Lebensdauer zu verfolgen. Darüber hinaus gibt es mehrere genetisch veränderte Mausmodelle des Alterns. Die Klotho-defiziente Maus ist ein Modell für vorzeitiges Altern, das in der Alternsforschung verwendet wird. In diesem Modell ist die Nierenfunktion jedoch nicht betroffen, und mehrere andere Organe als die Nieren sind beeinträchtigt [4]. Daher kann dieses Mausmodell für die Erforschung der renalen Alterung ungeeignet sein.Die Verabreichung von Aristolochinsäure (AA) verursacht eine spezifische Art von Nierenschädigung, die als AA-Nephropathie (AAN) bekannt ist und durch ausgedehnte interstitielle Fibrose gekennzeichnet ist [5,6]. AA ist für das renale Tubulusepithel toxisch, da es die Bildung von DNA-Addukten im Nierengewebe fördert [7]. Es ist unwahrscheinlich, dass AA andere Organe als das Harnsystem beeinflusst, und kann für die Bewertung nützlich seinNiere-spezifische Änderungen. Daher wird AA häufig verwendet, um Modelle für Nierenfibrose bei Mäusen zu etablieren [8,9]. Es bleibt jedoch unklar, ob AA-induzierte Veränderungen mit dem Altern der Haut zusammenhängenNieren. In dieser Studie untersuchten wir altersbedingte Phänotypen und molekulare Faktoren bei AAN bei Mäusen

Ergebnisse 2.1. Die AA-Verabreichung führte zu signifikantem Gewichtsverlust, Nierenatrophie und einem Rückgang der NierenfunktionDas Ausgangskörpergewicht (BW) und der systolische Blutdruck (BP) waren zwischen der Vehikelkontroll- und der AA-Gruppe identisch. BW in der Vehikel-Kontrollgruppe nahm über 8 Wochen konstant zu. Die Gewichtszunahme wurde jedoch durch die AA-Verabreichung gehemmt, und die AA-Gruppe hatte 4 und 8 Wochen nach Beginn der AA-Verabreichung ein signifikant niedrigeres BW (Abbildung 1A). Es gab keinen signifikanten Unterschied beim systolischen Blutdruck oder der Herzfrequenz zwischen der Vehikel-Kontrollgruppe und der AA-Gruppe (Abbildung 1B,C). Das Herzgewicht/KG-Verhältnis zeigte 8 Wochen nach Beginn der AA-Verabreichung keinen Unterschied zwischen den Gruppen (Fig. 1D), während dasNiereDas Gewicht/KG-Verhältnis war in der AA-Gruppe 8 Wochen nach Beginn der AA-Verabreichung signifikant niedriger (Abbildung 1E). Als nächstes untersuchten wir die Nierenfunktion in den Vehikelkontroll- und AA-Gruppen. Plasma-Kreatinin- und Harnstoff-Stickstoff (UN)-Konzentrationen waren 8 Wochen nach Beginn der AA-Verabreichung in der AA-Gruppe signifikant höher als in der Vehikel-Kontrollgruppe. Darüber hinaus reduzierte die AA-Behandlung 8 Wochen nach Beginn der AA-Verabreichung die Kreatinin-Clearance im Vergleich zur Trägerkontrollgruppe signifikant (Abbildung 1F–H).

2.2. Die AA-Verabreichung induzierte eine offene tubulointerstitielle Fibrose und eine signifikante Hochregulierung der Fibrose-bezogenen Genexpression in den NierenDie histologische Untersuchung mit Periodsäure-Schiff (PAS)-Färbung ergab, dass die glomeruläre Fläche in der AA-Gruppe im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe signifikant reduziert war (Abbildung 2A). In der AA-Gruppe (Abbildung 2B) wurde eine ausgedehnte tubulointerstitielle Fifibrose, die anhand der Masson-Trichrom (MT)-Färbung beurteilt wurde, sowie eine Hochregulierung der mRNA-Spiegel der mit renaler Fibrose zusammenhängenden Gene, Kollagen I und III und des transformierenden Wachstumsfaktors ( TGF)-(Abbildung 2C–E).

2.3.AA-Verabreichung beschleunigte zelluläre Seneszenz, mitochondriale Dysfunktion und Akkumulation von Reaktionssauerstoff/gen-Spezies (ROS) in den NierenUm die zelluläre Seneszenz zu bewerten, untersuchten wir die renale mRNA-Expression von p53, p21, p16 und Glutaminase (GLS).Nieren(Abbildung 3A-D). Darüber hinaus ist die Seneszenz-assoziierte -Galactosidase(SA- -gal)-Färbungsintensität in derNierenwar in der AA-Gruppe erhöht und in der Trägerkontrollgruppe fast nicht vorhanden (Abbildung 3E). In der AA-Gruppe zeigte die Elektronenmikroskopie das Verschwinden der mitochondrialen Cristae, der mitochondrialen Fragmentierung, der zytoplasmatischen Vakuolisierung und der Autolysosomen in den proximalen tubulären Zellen, gleichzeitig mit der Herunterregulierung des mit BCL2/Adenovirus E1B 19- kDa interagierenden Proteins 3 (Bnip3), eines mitochondrienbezogenen Gens (Abbildung 3FG). Renale mRNA-Expression von Nox2. ein Bestandteil der Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH)-Oxidase, war in der AA-Gruppe im Vergleich zur Vehikel-Kontrollgruppe signifikant erhöht (Abbildung 3H). Darüber hinaus ergab die Western-Blot-Analyse, dass der renale 4-hydroxy-2-nominale (4-HNE)-Spiegel in der AA-Gruppe signifikant erhöht war (Abbildung 3I). Diese Ergebnisse zeigten, dass die AA-Verabreichung zelluläre Seneszenz, mitochondriale Dysfunktion und ROS-Akkumulation induziertNieren.

2.4. AA Reduzierte renale Klotho-ProteinexpressionWir untersuchten die renale Expression von Anti-Aging-Proteinen in den Vehikelkontroll- und AA-Gruppen. Die Klotho-Expression war in der AA-Gruppe im Vergleich zur Vehikelkontrollgruppe signifikant reduziert (Abbildung 4A), während die Nierenexpressionen von Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase (NAMPT) und Sirtuin1 (SIRT1) zwischen den Gruppen ähnlich waren (Abbildung 4B,C).

3. DiskussionUnseres Wissens ist die vorliegende Studie die erste, die sich auf die Bewertung von mit der Nierenalterung verbundenen Veränderungen der AAN unter Verwendung von Seneszenzmarkern wie p16 und SA- -gal-Aktivität konzentriert. Die AA-Behandlung förderte Nierenatrophie, tubulointerstitielle Fibrose und Nierenfunktionsverlust, die von einer Hochregulierung der renalen p16-mRNA und einer SA- -gal-positiven Färbung begleitet wurden. Darüber hinaus zeigte die AA-Gruppe Merkmale von mit der Nierenalterung zusammenhängenden Mechanismen wie mitochondriale Anomalien, erhöhten oxidativen Stress und Herunterregulierung des Anti-Aging-Gens Klotho. Zusammengenommen legen unsere Beobachtungen nahe, dass die chronische AA-Verabreichung teilweise die Nierenalterung nachahmt.

Die zelluläre Seneszenz ist der dauerhafte Stillstand der Zellproliferation als Reaktion auf verschiedene Stressoren, wie z. B. DNA-Schäden, und trägt zum Altern und altersbedingten Krankheiten bei. Die Expression von p16, einem Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor, korreliert mit dem Altern in verschiedenen Organen, einschließlich der Nieren. Kalorienrestriktion erhöht die Lebensdauer durch Hemmung der pl6-Expression [10]. Darüber hinaus verursacht die Eliminierung von p16--exprimierenden seneszenten Zellen in INK-ATTAC-Mäusen durch Injektion von AP20187, einem FK506--bindenden Proteindimerisierer [11], eine Abschwächung von Phänotypen der Nierenalterung, wie z. B. Glomeruläre Sklerose und Nieren funktioneller Rückgang. Daher ist p16 einer der wichtigsten altersbedingten Faktoren. Seneszente Zellen können mithilfe der SA- -gal-Färbung nachgewiesen werden, die eine erhöhte -Galactosidase-Aktivität bei pH 6,0 zeigt [12] und ein weit verbreiteter Biomarker für seneszente und gealterte Zellen ist. Die renale mRNA-Expression von p116 nimmt bei gealterten Ratten zuNierenund wird von einer erhöhten SA- -gal-Aktivität im Nierenepithel begleitet [13I. In der vorliegenden Studie zeigten wir eine erhöhte renale p16-mRNA-Expression und SA- -gal-Färbung, was darauf hindeutet, dass AA die renale Seneszenz induziert. Es wurde kürzlich berichtet, dass GLS für das Überleben seneszenter Zellen durch verstärkte Glutaminolyse und intrazelluläre pH-Neutralisierung essentiell ist [14]. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der GLS-abhängigen Glutaminolyse bei gealterten Mäusen seneszente Zellen eliminiert und die altersbedingte Organdysfunktion verbessert. In der vorliegenden Studie deutete die Hochregulierung der renalen GLS-mRNA auf eine renale Akkumulation alternder Zellen in der Gruppe hin. Somit verursachte die chronische AA-Verabreichung eine zelluläre Seneszenz in den Nieren.

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN

Neben der zellulären Seneszenz ist die mitochondriale Dysfunktion ein wesentlicher Mechanismus, der altersbedingten Gewebeschäden zugrunde liegt und von einer ROS-Akkumulation begleitet wird [15,16. Mitochondriale Dysfunktion treibt und erhält die zelluläre Seneszenz [17], während die zelluläre Seneszenz direkt zur mitochondrialen Dysfunktion beiträgt [18]. Bnip3, das sich hauptsächlich in der äußeren Mitochondrienmembran befindet, spielt möglicherweise eine Rolle bei der Regulation der Mitophagie in kultivierten proximalen Tubuluszellen der Niere als Reaktion auf oxidativen Stress und Hypoxie. Bei gealterten Mäusen erhöht die Kalorienrestriktion die Autophagie in tubulären Zellen über die Hochregulierung von Bnip3 und verbessert die altersbedingte Degeneration der Nierenfunktion [19]. In der vorliegenden Studie zeigte die Elektronenmikroskopie die Merkmale von mitochondrialen Anomalien, die durch eine reduzierte renale Bnip3-Expression oder zelluläre Seneszenz beeinflusst werden können. Mitochondrien sind die wichtigste intrazelluläre Quelle von ROS. Um die Auswirkungen von mitochondrialen Anomalien auf renale ROS zu beurteilen, untersuchten wir die renale Akkumulation von 4-HINE und demonstrierten eine AA-induzierte ROS-Akkumulation in derNieren.NADPH-Oxidasen sind eine Hauptquelle von ROS. Während der akuten Phase von AAN bei Mäusen war die renale mRNA-Expression von Nox2 erhöht und die Stickoxidverfügbarkeit verringert, was zu anhaltender Hypoxie und Ischämie führte [20. Bei alter RatteNierenwird die Akkumulation von ROS von einer erhöhten Expression von Nox2 begleitet [21]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AA altersbedingte Phänotypen über eine ROS-Akkumulation induzieren kann, die durch mitochondriale Dysfunktion und Hochregulierung von NADPH-Oxidasen verursacht wird.

Die renale Klotho-Genexpression war in der AA-Gruppe verringert, während die Expression von NAMPT und SIRT1 zwischen den Gruppen ähnlich war. Klotho ist ein Anti-Aging-Gen, das für ein Single-Pass-Transmembranprotein kodiert, das als Alterungsunterdrücker wirkt. Der Alterungsprozess bei Klotho-defizienten Mäusen ähnelte dem beim Menschen, einschließlich einer kürzeren Lebensdauer, Unfruchtbarkeit, Arteriosklerose, Hautatrophie, Osteoporose und Emphysem [22]. Hypomorphe mutierte Klotho-Mäuse zeigten auch einen Phänotyp beschleunigter Alterung, der durch p16-Ablation wiederhergestellt wurde [23]. Da Klotho ein wichtiger Faktor für das Altern ist, wurden genmodifizierte Klotho-Mäuse in großem Umfang in der Alternsforschung eingesetzt. Klotho-genmodifizierte Mäuse sind jedoch aufgrund der systemischen alterungsbedingten Beeinträchtigungen dieser Mäuse und der Tatsache, dass die Nierenfunktion nicht belegt ist (dh Kreatininspiegel), für die Erforschung der renalen Alterung möglicherweise ungeeignet. Im Gegensatz dazu kann das AAN-Mausmodell als medikamenteninduziertes Modell der Nierenalterung für Forschungszwecke verwendet werden, da es mehrere Vorteile hat, wie z. B. die relativ einfache Implementierung und die Möglichkeit, die Auswirkungen von Interventionen auf den Nierenfunktionsabfall abzuschätzen .

Die vorliegende Studie hatte einige Einschränkungen. Wir untersuchten die renale Alterung, wobei wir uns hauptsächlich auf zelluläre Seneszenz, mitochondriale Morphologie und altersbedingte Genexpression konzentrierten. Die Mechanismen des Alterns sind jedoch komplex und noch wenig verstanden. Obwohl die Klotho-Genexpression als Reaktion auf AA verringert war, konnten wir außerdem keinen kausalen Zusammenhang mit den pathologischen Veränderungen in AAN nachweisen. Weitere Studien sind erforderlich, um die Rollen der verschiedenen Moleküle zu bestimmen, die an der Entwicklung von AAN beteiligt sind. Dennoch liefert die vorliegende Studie neue Einblicke in die Verwendung von Avan als Modell der renalen Alterung. Es ist wichtig zu beachten, dass phänotypische Veränderungen in derNieresind stark mit der Lebensdauer verbunden. Obwohl dieNiereleicht von altersbedingten Veränderungen betroffen ist, kann die Hemmung der renalen Alterung die Gesamtlebensdauer verlängern. Daher könnten weitere Forschungen zur renalen Alterung unter Verwendung von AAN-Modellen zu einer erhöhten Langlebigkeit in der Zukunft führen.

4. Materialien und Methoden4.1. TiereDiese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health für die Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Tierversuche wurden vom Animal Studies Committee der Yokohama City University genehmigt (Genehmigungsnummer: FA20-027) und wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und deren Leiden zu minimieren. Die Mäuse wurden in einer kontrollierten Umgebung unter einem Zyklus von 12- h Licht/12- h Dunkelheit bei einer Temperatur von 25 °C gehalten. Die Mäuse hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENINFEKTIONEN VERBESSERN

Acht Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse wurden von den Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) gekauft und nach 1 Woche Akklimatisierung den Vehikel-Kontroll- oder AA-Gruppen zugeteilt, den Mäusen wurde intraperitoneal Vehikel oder AA (Sigma -Aldrich, St.Louis, MO, USA), das in einer kleinen Menge Dimethylsulfoxid gelöst wurde. Vor der vorliegenden Studie führten wir eine Vorstudie mit mehreren Protokollen durch. Das erste Protokoll umfasste die intraperitoneale Verabreichung von AA (3 mg/kg) an C57BL/6-Mäuse zweimal pro Woche für 4 Wochen ohne Umbauzeit; In diesem Protokoll verursachte AA offensichtliche akute Nierenläsionen, wie z. B. erweiterte proximale Tubuli mit Verlust des Bürstensaums (ergänzende Abbildung S1). Im zweiten Protokoll wurde C57BL/6-Mäusen AA (2,5 mg/kg) intraperitoneal einmal pro Woche für 4 Wochen verabreicht, gefolgt von einer Umbauzeit für 4 Wochen; Plasma-Kreatinin bei diesen Mäusen war 0,19 ± {{20}},080 mg/dL versus 0,18 ± 0,010 mg/dL (Vehikel-Kontrolle versus AA; Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM), p=0.86, ungepaarter Student-t-Test, n=4 pro Gruppe) und Plasma-UN betrug 31,3 ± 5,95 mg/dL versus 30,4 ± 3,87 mg/dl (Vehikelkontrolle versus AA; Mittelwert ± SEM, p=0 0,90, ungepaarter Student's t-Test, n=4 pro Gruppe). Daher haben wir festgestellt, dass dieses Protokoll nicht für ein Nierenverletzungsmodell geeignet ist, da AA keinen signifikanten Rückgang der Nierenfunktion induziert. Im dritten Protokoll wurde C57BL/6-Mäusen AA (3 mg/kg) intraperitoneal zweimal pro Woche für 10 Wochen ohne Umbauzeit verabreicht; bei diesen Mäusen betrug die Sterblichkeitsrate in der AA-Gruppe 83 Prozent (n=6), wohingegen keine der Mäuse in der Vehikel-Kontrollgruppe starb (n=4). In diesem Protokoll konnten wir den durch AA induzierten Nierenphänotyp aufgrund der hohen Sterblichkeit nicht statistisch auswerten. Im vierten Protokoll wurde C57BL/6-Mäusen AA (3 mg/kg) intraperitoneal zweimal pro Woche für 4 Wochen verabreicht, gefolgt von einer Umbauzeit für 4 Wochen; Bei diesen Mäusen wurden chronische Nierenläsionen, wie tubulointerstitielle Fifibrose, und ein Rückgang der Nierenfunktion beobachtet [9]. Daher haben wir auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Voruntersuchungen das vierte Protokoll zur Durchführung der Experimente in der vorliegenden Studie übernommen.

4.2.BP-MessungDer systolische Blutdruck und die Herzfrequenz wurden mit der zuvor beschriebenen Schwanzmanschettenmethode gemessen (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Tokyo, Japan)[24,25]. Alle Messungen wurden zwischen 9:00 und 14:00 durchgeführt. Bei jeder Maus wurden mindestens 10 Messungen durchgeführt, und der Mittelwert wurde zur Analyse verwendet.

4.3. Quantitative Reverse-Transkriptions-PCR-Analyse in Echtzeit Gesamt-RNA wurde aus Nierengeweben unter Verwendung von ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japan) extrahiert, und komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung des SuperScript IⅢFirst-Strand-Systems (Invitrogen, Waltham, MA, USA) synthetisiert. Die quantitative Reverse-Transkriptions-PCR-Analyse in Echtzeit wurde mit dem CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) durchgeführt, und die Reverse-Transkriptions-Produkte wurden mit TaqMan PCR Master Mix und einem kundenspezifischen TaqMan inkubiert Sonde (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), wie zuvor beschrieben [26]. Es wurden TaqMan-Sonden gegen folgende Gene verwendet: Kollagen I (Mm00801666_g1), Kollagen II (Mm01254476_m1), TGF- (Mm01178819 m1),p53(Mm00441964 g1),p21( Mm04205640 g1).p16(Mm00494449 m1)GLS (Mm01257297_m1), Bnip3 (Mm01275600_g1) und Nox2 (Mm00627011_m1).mRNA-Spiegel wurden auf die von normalisiert 18S ribosomale RNA.

4.4. Western-Blot-Analyse Die Proteinexpression wurde durch Western-Blot-Analyse der Gewebehomogenate unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Verfahrens analysiert [27,28]. Gesamtproteinextrakte wurden aus den Geweben unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat enthaltendem Probenpuffer hergestellt. Die Proteinkonzentration jeder Probe wurde unter Verwendung des Detergent-Compatible Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) und des NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit Rinderserumalbumin als das gemessen Standard. Gleiche Mengen an Proteinextrakten aus den Gewebeproben wurden auf 5-20 Prozent Polyacrylamidgelen (ATTO Corp., Tokio, Japan) fraktioniert. Abgetrennte Proteine ​​wurden dann unter Verwendung des Semi-Dry Transfer System (ATTO Corp., Tokio, Japan) auf Polyvinylidendifluorid-Membranen übertragen. Die Membranen wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 5 % Magermilchpulver enthielt, blockiert. Membranen wurden mit Primärantikörpern gegen Klotho (ab181373 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), NAMPT (sc-67020 1:5000; Abcam), SIRT1(07-131 1:1000, MilliporeSigma) inkubiert , Burlington, MA, USA), 4-HINE(MHN-100P 1:1000; JaICA, Fukuroi, Japan) und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) (2118, 1:2000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Die Membranen wurden gewaschen und mit sekundären Antikörpern für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Stellen für Antikörper-Antigen-Reaktionen wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenzsubstrats (Merck, Kenilworth, NJ, USA) sichtbar gemacht. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet. Die Bilder wurden unter Verwendung des ChemiDoc Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) quantitativ analysiert.

4.5. Histologische Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [29]. Nierengewebe von Mäusen wurden mit 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Schnitte (4 um dick) wurden mit PAS- und MT-Färbungen gefärbt. Zur Bewertung der glomerulären Fläche wurden 50 Glomeruli pro Maus gemessen und gemittelt. Alle Bilder wurden mit dem BZ-9000-Mikroskop (Keyence Corp., Osaka, Japan) aufgenommen.

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/RENALE DIALYSE VERBESSERN

4.6. SA- -al-Färbung Nierengewebe von Mäusen wurden schnell eingefroren und in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (Sakura FinetekJapan, Co., Ltd., Tokio, Japan) eingelegt. Schnitte (4 μm dick) wurden unter Verwendung eines Kryostaten (HM550-VPD; Thermo Fisher Scientific) und auf Objektträger aus Glas aufgezogen. Die SA- -gal-Aktivität wurde unter Verwendung eines Seneszenz-Erkennungskits (Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA) gemäß den Protokollen des Herstellers gemessen. Die Proben wurden unter Hellfeld bei 100-facher Vergrößerung unter Verwendung des BZ-9000-Mikroskops (Keyence Corp., 4.7. Electron MicroscopyDie elektronenmikroskopische Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [30]. Die Mäuse wurden mit Isofluran anästhesiert und durch den rechten Aortenbogen mit heparinisierter (5 U/ml) physiologischer Kochsalzlösung und 2,5 Prozent Glutaraldehyd in 0,1 mol/l Phosphatpuffer bei pH 7,4 perfundiert. Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie wurden in 1 % Osmiumtetroxid für 2 h eingetaucht, seriell in Ethanol dehydriert und in eine Epon-Mischung eingebettet. UlItrathin-Schnitte wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und unter Verwendung des Hitachi-H-7500-Transmissionselektronenmikroskops untersucht, das bei 80 kV betrieben wurde (Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan). Die Schnitte wurden bei 5000-facher Vergrößerung betrachtet und unter Verwendung einer Kamera mit ladungsgekoppelten Vorrichtungen fotografiert.

4.8.Biochemische AnalyseBlutproben wurden durch Herzpunktion im genährten Zustand entnommen. Vollblutproben wurden bei 3000 U/min (MR-150; Tomy Seiko Co., Ltd., Tokio, Japan) für 10 min bei 4 Grad zentrifugiert, um das Plasma abzutrennen. Die resultierenden Plasmaproben wurden bei -80 Grad gelagert. Die Plasmakreatinin-, UN- und Urin-Kreatininspiegel wurden unter Verwendung des Hitachi 7180 Autoanalyzer (Hitachi, Ltd., Tokio, Japan) gemessen.

4.9. Statistische Analyse Statistische Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Der ungepaarte Student-f-Test wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen der Vehikel-Kontroll- und der AA-Gruppe zu vergleichen. p<0.05 was="" considered="" statistically="">

5. SchlussfolgerungenAA-Verabreichung verursachtNiereSeneszenz, zusammen mit tubulointerstitieller Fibrose und Nierenatrophie. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Nierenfibrose eng mit der Nierenalterung zusammenhängt und dass AAN nützlich sein kann als eineNiere-spezifisches Alterungsmodell.