Vorteilhafte Wirkungen der aus Cistanche Deserticola isolierten gesamten Phenylethanoidglykosidfraktion auf die Knochenmikrostruktur bei ovariektomierten Ratten

Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die antiosteoporotische Aktivität der aus C. deserticola (CDP) isolierten Phenylethanoidglykosid-Gesamtfraktion bei Ratten nach Ovariektomie (OVX) sowie die damit verbundenen Mechanismen abzuschätzen. Nach 3 Monaten oraler Verabreichung wurden die verringerte Knochenmineraldichte, Serum-Ca und P bei OVX-Ratten wiederhergestellt und die verschlechterte trabekuläre Knochenmikroarchitektur wurde teilweise durch CDP-Intervention (60, 120 und 240 mg/kg) verbessert, die Aktivitäten von Knochenresorptionsmarker wurden herunterreguliert und die Bioaktivität des Knochenbildungsindex wurde hochreguliert; währenddessen wurde der MDA-Gehalt verringert und GSH wurde durch die CDP-Behandlung erhöht. Hinsichtlich der Zusammensetzung wurden 8 Phenylethanoidglykosid-Verbindungen in CDP identifiziert, wobei der Gesamtgehalt unter Verwendung des HPLC-Verfahrens als 50,3 Prozent quantifiziert wurde. Mechanistisch senkte CDP die Spiegel von TRAF6, RANKL und RANK, wodurch die RANKL/RANK/TRAF6--induzierte Aktivierung der nachgeschalteten NF-κB- und PI3K/AKT-Signalwege unterdrückt und letztendlich die Aktivitäten der wichtigsten osteoklastogenen Proteine ​​von NFAT2 verhindert wurden und c-Fos. Alle oben genannten Daten deuteten darauf hin, dass CDP vorteilhafte Wirkungen auf die Knochenmikrostruktur bei ovariektomierten Ratten zeigte, und diese Wirkungen könnten mit den NF-κB- und PI3K/AKT-Signalwegen zusammenhängen, die durch die Bindung von RANKL, RANK und TRAF6 ausgelöst wurden.

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1. Einleitung

Postmenopausale Osteoporose, an der 1 von 3 Frauen über 50 Jahren leidet, entwickelt sich zu einem Hauptgesundheitsrisiko, von dem mehr als 200 Millionen Frauen auf der ganzen Welt betroffen sind [1]. In den Wechseljahren führt das starke Absinken des Östrogenspiegels meist zu einer übersteigerten Knochenresorption durch gesteigerte Osteoklastogenese; dann wurde das Gleichgewicht zwischen Osteoblasten-induzierter Knochenbildung und Osteoklasten-induzierter Knochenresorption gestört, und die beschleunigte Knochenresorption verursachte schließlich Osteoporose und sogar Hüft- oder Wirbelsäulenfrakturen [2]. Es wurde angenommen, dass die Differenzierung des Osteoklasten ausgelöst wurde, wenn der Rezeptoraktivator des Kernfaktors Kappa B (RANK) an RANKL, den Liganden von RANK, gebunden wurde. Die Kombination von RANK zu RANKL kann jedoch nicht aktiviert werden, es sei denn, es wurde der Protein-Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-assoziierte Faktor 6 (TRAF6) hinzugefügt [3], gefolgt von der Stimulation nachgeschalteter Signalwege, einschließlich PI3K/AKT und NF-κB. Und schließlich wurden die Expressionen des Kernfaktors aktivierter T-Zellen c2 (NFAT2) und c-Fos reguliert [4], um die Differenzierung des Osteoklasten sowie die Knochenresorption zu modulieren. Daher wurde angenommen, dass die Faktoren und Regulatoren, die direkt oder indirekt mit der Aktivierung und Differenzierung von Osteoklasten in Verbindung stehen, entscheidende Ziele zur Verhinderung von Knochenverlust sind.

Es gibt tatsächlich einige klinische und synthetische Medikamente zur Hormonersatztherapie wie Östradiolvalerat, die bei der Behandlung von postmenopausaler Osteoporose wirksam sind. Leider erhöhten einige davon das Risiko schwerer Krebsarten, einschließlich Brust- und Gebärmutterschleimhautkrebs [5], was ihre klinischen Anwendungen einschränkte.

Daher ist es notwendig, andere Alternativen mit sowohl Wirksamkeit als auch minimalen Nebenwirkungen auszuwählen. Traditionelle chinesische Medizin (TCM) sowie die isolierten bioaktiven Verbindungen und Fraktionen [6–9] haben sich bei verschiedenen Beschwerden, einschließlich postmenopausaler Osteoporose, als wirksam erwiesen. Unter diesen bioaktiven Komponenten und Fraktionen wurden Phenylethanoidglykoside (PhG)-Verbindungen mit potenzieller Wirksamkeit als vielversprechende Wirkstoffe für die Behandlung von Osteoporose angesehen [10–12]. Die Strukturen von PhGs bestehen aus Zimtsäureaglykon, einer Hydroxyl-Phenylethylgruppe, die über eine glykosidische Bindung mit -Glucopyranose, Apiose, Galactose, Rhamnose oder Xylose verbunden ist. Sie sind in medizinischen Arten der Gattung Cistanche weit verbreitet [13]. Cistanche Deserticola YC Ma ist eine offizielle TCM, die im chinesischen Arzneibuch aufgeführt ist, und abgesehen davon, dass sie eine wichtige TCM [14] ist, ist Cistanche Deserticola auch ein Anti-Aging-Tonikum mit wenigen Nebenwirkungen, das zu einem medizinischen Likör und einer von der zugelassenen Nährflüssigkeit entwickelt wurde Staatliche Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde.

Basierend auf den Aufzeichnungen des chinesischen Arzneibuchs wurde C. deserticola traditionell von Eingeborenen verwendet, um Probleme mit Nierenessenzmangel wie Muskelschwäche und Lendenschwäche zu behandeln, und Phenylethanoidglykosid-Verbindungen, einschließlich Echinacosid und Acteosid, sind die wichtigsten bioaktiven Bestandteile in diesem Kraut. Gemäß der TCM-Theorie "Niere-regieren-Knochen" wird das Knochensystem von Nierenessenz gesteuert [15], und knochenbedingte Probleme wie Osteoporose könnten durch Kräuter oder Verbindungen geheilt werden, die die Aktivität besitzen, die Nierenessenz zu nähren. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die gesamte aus C. deserticola isolierte Phenylethanoidglycosidfraktion zumindest teilweise bei der Behandlung von Osteoporose von Vorteil war. Das aktuelle Experiment wurde daher entwickelt, um unsere Hypothese durch Verwendung eines ovariektomierten (OVX) Rattenmodells zu validieren; neben den zu schätzenden Knochenresorptions- und -bildungsmarkern wurden auch der Antioxidationsindex sowie RANKL/RANK/TRAF6--induzierte PI3K/AKT- und NF-κB-Signalwege herangezogen, um die Hauptmechanismen der zu untersuchen antiosteoporotische Bioaktivität

2. Materialien und Methode

2.1. Pflanzenmaterialien und Vorbereitung. Insgesamt 30 kg Stängel von Cistanche deserticola YC Ma wurden im September 2015 im Landkreis Yongning mit den Koordinaten 106.026597 und 38.262816, Provinz Ningxia, China, gesammelt. Das Kraut wurde von Dr. Lin Dong (Abteilung für Pharmakognosie, Ningxia Medical University) identifiziert, und ein entsprechendes Exemplar (#20150901) wurde in der Abteilung für pharmazeutische Analyse aufbewahrt.

Zuerst wurden 30,0 kg pulverisiertes C. deserticola extrahiert, indem das Rückflussverfahren mit 70 Prozent Ethanol als Lösungsmittel verwendet wurde; das Verhältnis von Material zu Lösungsmittel wurde auf 1:1 0 eingestellt, und die Rückflusszeit war 2 h für 3 Mal. Dann wurden alle Filtrate vereinigt und unter reduziertem Druck bei 60 Grad C kondensiert. Zweitens wurden AB-8 makroporöse Harzsäulen für die Vorabtrennung verwendet und verschiedene Verhältnisse von Ethanol in Wasser ({ {34}} Prozent, 20 Prozent, 30 Prozent, 40 Prozent, 50 Prozent und 60 Prozent, jeweils 60 L) wurden zum Eluieren verwendet. Drittens wurden die 40-prozentigen und 50-prozentigen Elutionsmittel kombiniert und weiter gereinigt, indem wiederholt AB-8-Säulen mit makroporösem Harz mit den Elutionsmitteln 0 %, 20 %, 30 %, 40 % und 50 % Ethanol in Wasser und verwendet wurden jeder Eluent war 12 l. Schließlich wurde die 40-Prozent-Fraktion gesammelt und unter reduziertem Druck kondensiert, um 150 g blassgelbe Sediment-Phenylethanoidglycosid-Fraktion von C. deserticola (CDP, die Ausbeute war 0,5 Prozent) zu erhalten. Für In-vivo-Experimente wurde 0,5 % CMC-Na-Lösungsmittel verwendet, um CDP aufzulösen; Die orale Verabreichung an Tiere wurde auf 1 ml/100 g Körpergewicht eingestellt; für die In-vitro-Western-Blot-Analyse wurde CDP mit DMSO gelöst und dann mit DMEM verdünnt, um die Endkonzentrationen von 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml und 0,001 mg/ml zu erhalten.

2.2. Chemikalien und Lösungsmittel. Östradiolvalerat (EV) war von Delpharm Lille SAS, Frankreich; alkalische Phosphatase (ALP), Knochen-Gla-Protein (BGP), Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) und Desoxypyridinolin (DPD) Crosslink-ELISA-Kits von Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China, 201605; Malondialdehyd (MDA, 20181221), Superoxiddismutase (SOD, 20121218) und Glutathion (GSH, 20181221) Reagenzienkits vom Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, China; Intaktes Parathormon (1-PTH, NEWASHE7UZ), Calcitonin (2L9ISN7AIU) und östrogenbezogener Rezeptor-alpha (ERR, Y3AY8QEWB3) Crosslink-ELISA-Kits von Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, China; Cathepsin K ELISA-Reagenzkit von BioVision, America, 11300141; primäre Antikörper von RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3-Kinase p85 alpha (AC09021266), AKT 1 (AF05173234), -Actin (17AV0411) und sekundäre Antikörper von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG von ZSGB-BIO, China, 136080; Gesamt-BCA-Protein-Assay-Kit und das kommerzielle Kit zum Nachweis von Osteoklastenbildung und fötalem Rinderserum und Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) von HyClone, Logan, UT, USA; Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran von Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; Penicillin und Streptomycin von Gibco, Rockville, MD, USA. Alle anderen verwendeten chemischen Mittel waren von AR-Qualität.

2.3. HPLC-Quantifizierung von CDP. Ein Agilent 1220 HPLC-Instrument wurde verwendet, um die Zusammensetzung von CDP zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Chromatographiebedingungen waren wie folgt: C18-Säule (TSK-GEL, 4 6 I d × 25 0 mm, 5 μm); Gradientenelution enthielt die Lösungsmittel A (Acetonitril) und B (Wasser mit 0,5 Prozent Essigsäure) (0-10 min: 17-20 Prozent A; 10-30 min: 20-25 Prozent A; und 30-40 min: 25-30 Prozent A); die Detektionswellenlänge betrug 333 nm; Umgebungstemperatur; die Fließgeschwindigkeit betrug 1,0 ml/min; Das Probeninjektionsvolumen betrug 5 μl. Acht PhG-Verbindungen, nämlich Cistanosid F, Echinacosid, 6′-Acetylacteosid, Cistanosid C, Cistanosid A, Acteosid, 2′-Acetylacteosid und Isoacteosid, wurden identifiziert; Unter Verwendung der entsprechenden Referenzsubstanzen und einer externen Standardmethode wurden die Gehalte der oben genannten 8 PhGs durch HPLC-Analyse quantifiziert (Abbildung 1).

2.4. Tierversuchsprotokoll. Insgesamt 60 weibliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 3 Monaten wurden vom Zentrum für Tierversuche der Ningxia Medical University mit einem durchschnittlichen anfänglichen Körpergewicht von etwa 234 ± 25 g bestimmt. Die Ratten wurden zur Akklimatisierung für 1 Woche in einer standardspezifischen, pathogenfreien Umgebung gehalten. Dann wurden alle Ratten nur anästhesiert (Chloralhydrat, 100 mg/kg, ip) oder scheinovarektomiert (SHAM) oder beide Eierstöcke wurden entfernt und dann zufällig in 5 Untergruppen eingeteilt: oral behandelt mit Vehikel (0,5 % CMC- Na) wurde als Modellgruppe (OVX), Östradiolvalerat (1 mg/kg/Tag) als positive Gruppe (EV) und 60, 120 und 240 mg/kg/Tag CDP als niedrig (CDPL) festgelegt, moderate (CDPM) bzw. hohe (CDPH) Dosierungsgruppen. Alle Ratten wurden täglich oral verabreicht und dauerten 3 Monate, wobei die Dosierung alle 2 Wochen angepasst wurde, was von der Veränderung des gesamten Körpergewichts abhing. Am letzten Tag des Tierversuchs wurde 24- Stundenurin unter Verwendung von Stoffwechselkäfigen gewonnen; Serum wurde aus der Femoralarterie anästhesierter Ratten gesammelt; der rechte Oberschenkel, das Schienbein und alle Organe wurden präpariert und zur weiteren Analyse bei -80 Grad C gelagert. Die von uns durchgeführten Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ningxia Medical University genehmigt.

2.5. Bestimmung der Knochenmineraldichte und Mikro-CT-Analyse. Zunächst wurde ein Dual-Energy-Röntgenabsorptiometriegerät (Lunar, USA) verwendet, um die Gesamtknochenmineraldichte des rechten Femurs jeder Ratte abzuschätzen; Zweitens wurde derselbe Femur verwendet, um das 3D-Bild der Mikroarchitektur des trabekulären Knochens abzuschätzen, indem ein Mikro-CT-Scannergerät (GE, Amerika) verwendet wurde. Die isotrope Auflösung wurde auf 14 μm eingestellt, um ein ideales 3D-Bild zu erhalten; der interessierende Bereich (ROI) wurde ausgewählt, indem die gleichen Koordinaten in der Wachstumsfuge des Oberschenkelknochens jeder Probe eingestellt wurden; und die knochenmorphometrischen Parameter einschließlich Trabekelabstand (Tb. Sp), Trabekelzahl (Tb. N), Trabekeldicke (Tb. Th), Knochenmineralgehalt (BMC), Gewebemineraldichte (TMD) und Gewebemineralgehalt (TMC ) wurden durch Analyse des ROI erhalten.

2.6. Biochemischer Assay für Serum und Urin. Die Aktivitäten von Cathepsin K, TRAP, SOD und GSH im Serum sowie die Gehalte an Serum PTH, Calcitonin, ERR, MDA, BGP und DPD im Urin wurden unter Verwendung entsprechender Reagenzienkits gemäß den Anweisungen des Herstellers und der Konzentration von bestimmt alkalische Phosphatase (ALP) und die Gehalte von Calcium (Ca) und Phosphor (P) im Serum und Urin wurden unter Verwendung einer automatischen Maschine (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA) bestimmt.

2.7. Western-Blot-Analyse. Osteoklasten wurden unter Verwendung von RAW-264.7-Zellen induziert, denen Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (MCSF) und RANKL hinzugefügt wurden. Kurz gesagt, 1 × 107 RAW 264.7-Zellen wurden in einer 6-Well-Platte in Gegenwart von 30 ng/ml MCSF und 25 ng/ml RANKL kultiviert. Nach 6 Tagen Induktion wurden die gereiften Osteoklastenzellen unter Verwendung der TRAP-gefärbten Methode mit dem entsprechenden Kit identifiziert und dann mit CDP (0.1, 0.01 und 0,001 mg/ml behandelt ) für 24 h; dann wurden die Zellen mit einem Lysepuffer, der 0,5 mMol Phenylmethylsulfonylfluorid, Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthielt, lysiert. Das Lysat wurde dann mit 10-prozentiger SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen, die mit AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos und -actin (1 : 400) nach Blockieren mit 5-prozentiger Magermilch für 2 h. Dieselben Membranen wurden gestrippt und erneut mit den oben genannten 9 entsprechenden Antikörpern sondiert, dann wurden sie am Ende durch die Image Lab-Software nachgewiesen. Die Versuche wurden dreimal wiederholt.

2.8. Statistische Analyse. Alle aus In-vivo- und In-vitro-Experimenten erhaltenen Daten, beschrieben als Mittelwert ± Standardabweichung, wurden unter Verwendung von Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnett-Test (SPSS 22.0-Software, SPSS, USA) analysiert; p < 0 05 war statistisch signifikant.

2.7. Western-Blot-Analyse. Osteoklasten wurden unter Verwendung von RAW-264.7-Zellen induziert, denen Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (MCSF) und RANKL hinzugefügt wurden. Kurz gesagt, 1 × 107 RAW 264.7-Zellen wurden in einer 6-Well-Platte in Gegenwart von 30 ng/ml MCSF und 25 ng/ml RANKL kultiviert. Nach 6 Tagen Induktion wurden die gereiften Osteoklastenzellen unter Verwendung der TRAP-gefärbten Methode mit dem entsprechenden Kit identifiziert und dann mit CDP (0.1, 0.01 und 0,001 mg/ml behandelt ) für 24 h; dann wurden die Zellen mit einem Lysepuffer, der 0,5 mMol Phenylmethylsulfonylfluorid, Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthielt, lysiert. Das Lysat wurde dann mit 10-prozentiger SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen, die mit AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3Kp85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos und -actin (1 : 400) nach Blockieren mit 5-prozentiger Magermilch für 2 h. Dieselben Membranen wurden gestrippt und erneut mit den oben genannten 9 entsprechenden Antikörpern sondiert, dann wurden sie am Ende durch die Image Lab-Software nachgewiesen. Die Versuche wurden dreimal wiederholt.

2.8. Statistische Analyse. Alle aus In-vivo- und In-vitro-Experimenten erhaltenen Daten, beschrieben als Mittelwert ± Standardabweichung, wurden unter Verwendung von Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnett-Test (SPSS 22.0-Software, SPSS, USA) analysiert; p < 0 05 war statistisch signifikant.

3. Ergebnisse

3.1. Chemische Zusammensetzung von CDP. Unter Anwendung des HPLC-Verfahrens wurden in dieser Fraktion acht Phenylethanoidglykosid-Verbindungen gefunden, wie Abbildung 1 zeigt. Unter Verwendung von Standardreferenzen und einer externen Standardmethode wurden die Verbindungen und ihre Gehalte wie folgt identifiziert und quantifiziert: (1) Acteosid F (3,6 Prozent), (2) Echinacosid (8,8 Prozent), (3) Cistanosid A (5.{ {11}} Prozent), (4) Acteosid (13,3 Prozent), (5) Isoacteosid (3,3 Prozent), (6) Acteosid C (3,6 Prozent), (7) 2′-Acetylacteosid (9,9 Prozent) und (8 ) 6′-Acetylacteosid (3,2 Prozent). Der Gesamtgehalt dieser acht Komponenten wurde mit 50,7 Prozent beziffert.

3.2. Auswirkungen von CDP auf die Knochenmineraldichte und die Mikroarchitektur von Trabecula. Die Gesamtknochenmineraldichte der Ratten in verschiedenen Untergruppen ist in Abbildung 2 dargestellt. Bei Ratten der OVX-Modellgruppe wurde ein abnehmender Trend beim Gehalt an Knochenmineraldichte beobachtet, der danach um fast 12,0 Prozent abnahm 12 Wochen der Operation im Vergleich zu den Ratten der SHAM-Gruppe (p < 0 001). Alle mit CDP behandelten Ratten zeigten im Vergleich zu den Ratten der OVX-Modellgruppe eine signifikant erhöhte Knochenmineraldichte um 11,2 Prozent, 12,0 Prozent bzw. 10,7 Prozent (p < 0 01). .

Darüber hinaus zeigte die Mikro-CT-Rekonstruktion sowie die histomorphometrische Bestimmung des Femurs in Übereinstimmung mit den Daten der Gesamtknochenmineraldichte, dass die Ratten in der OVX-Gruppe eine offensichtliche Verschlechterung der Trabekelarchitektur zeigten, was durch die deutlich verringerte Anzahl und Fläche der Trabekel belegt wurde sowie deutlich erhöhte Tb. Also im Vergleich zu den Ratten der SHAM-Gruppe. Die Behandlung mit CDP verhinderte die OVX-induzierte Verschlechterung der Trabekelarchitektur; Wie Abbildung 3 zeigt, sind BMC, TMC und Tb. Die N-Werte waren signifikant erhöht und die Fläche von Tb. Sp war deutlich verringert, während die Werte von TMD und Tb. Sie schienen von der OVX-Operation und unserer CDP-Intervention nicht wesentlich betroffen zu sein.

3.3. Auswirkungen von CDP auf die biochemischen Parameter von Urin und Serum. Wie Abbildung 4 zeigt, wurden signifikante Abnahmetrends des Urinspiegels von P und des Serumgehalts von Calcitonin bei Ratten der OVX-Modellgruppe festgestellt, die um fast 30 Prozent und 60 Prozent geringer waren als bei den SHAM-Ratten (p < 0 001 ), während zwischen den OVX- und den SHAM-Gruppen keine offensichtlichen steigenden oder fallenden Trends bei den Urinspiegeln von Ca und Serum-Ca sowie von Serum-P und Serum-PTH beobachtet wurden. Die Behandlung mit CDP verhinderte signifikant den Verlust von P und Ca im Serum bei OVX-Ratten, was durch die im Vergleich zu den Ratten der OVX-Modellgruppe deutlich hochregulierten Serum-P- und -Ca-Spiegel (p < 0 05) belegt wurde. Darüber hinaus wurden im Vergleich zur OVX-Modellgruppe erhöhte, aber statistisch nicht signifikante Trends von Calcitonin sowohl in den CDP-Gruppen mit niedriger als auch mit hoher Dosierung beobachtet.

3.4. Auswirkungen von CDP auf Knochenbildungs- und Knochenresorptionsmarker. Die vorteilhaften Wirkungen von CDP auf den Knochenbildungsindex sowie die Hemmungseinflüsse auf Knochenresorptionsmarker wurden in Abbildung 5 beschrieben. Was die Knochenbildungsmarker betrifft, so wurden die Serum-BGP-Spiegel fast nicht durch die Operation der Ovariektomie beeinflusst, was durch nicht signifikante Veränderungen belegt wurde, die in beobachtet wurden alle behandelten Gruppen, während statistisch signifikante Verbesserungen der Serum-ALP sowohl bei niedrigen (60 mg/kg) als auch bei moderaten (120 mg/kg) Dosierungen der CDP-Interventionsgruppen im Vergleich zu den Ratten erzielt wurden der SHAM-Gruppe (p < 0 01). In Bezug auf den Knochenresorptionsindex waren die Serumspiegel von Cathepsin K und DPD sowie TRAP bei Ratten der OVX-Modellgruppe im Vergleich zu den SHAM-Ratten signifikant um etwa 75,0 Prozent, 41,4 Prozent bzw. 21,0 Prozent erhöht Bei Behandlung mit CDP, insbesondere der niedrigen Dosierung von 60 mg/kg, wurden die Eigenschaften von Cathepsin K und DPD sowie TRAP in der OVX-Modellgruppe deutlich um 67,3 Prozent, 41,4 Prozent bzw. 25,9 Prozent im Vergleich zu gehemmt die Ratten in der OVX-Modellgruppe.

3.5. Auswirkungen von CDP auf Vagina und Uterus sowie auf das gesamte Körpergewicht. Nicht signifikante Unterschiede im anfänglichen Ganzkörpergewicht von Ratten wurden vor der Behandlung in sechs Gruppen beobachtet (Fig. 6). Die ovariektomierte Operation führte jedoch zu einer signifikanten Zunahme des endgültigen Körpergewichts von Ratten in der OVX-Modellgruppe, die fast 36,0 Prozent beträgt, während die Nassgewichte von Uterus und Vagina drastisch um fast 9{{6} zurückgingen. }.0 Prozent bzw. 60,0 Prozent im Vergleich zu den SHAM-Ratten (p < 0 001). Obwohl der ERR-Gehalt keinen signifikanten Unterschied zwischen den OVX- und SHAM-Gruppen aufwies, erhöhten alle Behandlungsgruppen, einschließlich CDP und EV, den ERR-Wert signifikant. Darüber hinaus wurden bei Behandlung mit EV die oben genannten Gesamtkörpergewichtszunahmen sowie der Verlust des Vagina- und Uterusgewichts von OVX-Ratten teilweise umgekehrt (p < 0 001), aber nicht durch CDP-Intervention beeinflusst.

3.6. Auswirkungen von CDP auf die Serumspiegel von MDA, SOD und GSH. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in den Eigenschaften von Serum-SOD und -GSH zwischen den SHAM- und OVX-Modellgruppen; Wie in Abbildung 7 beschrieben, kann zwischen den beiden oben genannten Gruppen ein zunehmender Trend bei GSH beobachtet werden. Darüber hinaus war der Serum-MDA-Spiegel bei den Ratten der OVX-Modellgruppe im Vergleich zu den SHAM-Ratten um fast 50 Prozent stark erhöht. Die Aktivität von SOD wurde durch die CDP-Behandlung nicht beeinflusst, während die Eigenschaft von GSH durch die CDP-Intervention signifikant verbessert wurde und CDP den MDA-Spiegel deutlich um 33,9 Prozent und 42,4 Prozent bei Dosen von 60 bzw. 240 mg/kg senkte ( p < 0 001).

3.7. Wirkungen von CDP auf Proteinexpressionsniveaus. Unsere in Abbildung 8 gezeigten Daten legten nahe, dass die CDP-Behandlung die Proteinspiegel von TRAF6, RANK und RANKL im Vergleich zur Kontrolle signifikant senkte. Die nachgeschalteten Signalwege, einschließlich NF-κB, wurden unterdrückt, und PI3K/AKT wurde durch CDP-Intervention stimuliert, was durch die Expression von NF-κB-p65-Herunterregulierung belegt wurde, während PI3Kp85 und AKT1 hochreguliert waren. Folglich war die Expression von NFAT2 signifikant verringert und cFos war nach Behandlung mit CDP in einer Konzentration von 0,001-0,1 mg/ml erhöht. Ein vorgeschlagener Mechanismus ist in Abbildung 9 beschrieben, wo CDP die Spiegel von RANKL und RANK herunterregulierte, was zu einer Verringerung der Bindungsmengen dieses Liganden mit seinem Rezeptor führte, und die Verbindung von RANKL mit RANK durch die Herunterregulierung von TRAF6 weiter verringert wurde. gefolgt von der Unterdrückung der nachgeschalteten Signalwege einschließlich des NF-κB-Signalwegs, während der PI3K/AKT-Signalweg stimuliert wurde, was schließlich zu einer Verringerung der NFAT2-Expression und einem Anstieg des c-Fos-Spiegels führte.

4. Diskussion

Phenylethanoidglykoside sind natürlich vorkommende wasserlösliche Komponenten, die im Heilpflanzenreich weit verbreitet sind [11]. Bisher hatten die Verbindungen von Phenylethanoidglykosiden wegen ihrer offensichtlichen Rolle bei der Behandlung verschiedener menschlicher Leiden und Anomalien immer mehr Forscher angezogen [13]. Mehrere antiosteoporotische bioaktive Fraktionen und Verbindungen, darunter Polyphenol- und Phenylethanoidglykoside, wurden identifiziert und aus Dutzenden von natürlichen Heilkräutern isoliert [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola ist als „Ginseng der Wüste“ bekannt, was auf das Sicherheitsprofil dieser essbaren TCM hindeutet [18, 19]. Als allgemeines stärkendes Kraut und natürliches Gesundheitsnahrungsmittel, das in asiatischen Ländern seit langem verwendet wird, zeigte C. deserticola eine vorteilhafte Funktion zur Stärkung der Nieren.

Es wurde festgestellt, dass TCM, die traditionell zur Belebung und Aufrechterhaltung der Nierenessenz verwendet wird, normalerweise zur Behandlung von Osteoporose verwendet wird, sowohl in vitro als auch in vivo veröffentlichte Daten haben die antiosteoporotische Aktivität von C. deserticola bewiesen [20–23], und Phenylethanoidglykosid-Bestandteile, einschließlich Echinacosid und Acteosid, sind die wichtigsten bioaktiven Komponenten, die in dieser essbaren Heilpflanze vorkommen; All dies legte nahe, dass nicht nur Echinacosid und Acteosid selbst, sondern auch andere in C. deserticola enthaltene Phenylethanoidglykosidkomponenten als für die antiosteoporotische Eigenschaft dieses Krauts verantwortlich angesehen wurden. In unserer vorliegenden Studie wurde ein makroporöses Harz mit günstiger Sicherheit verwendet, um die Phenylethanoidglykosid-Fraktion von C. deserticola zu isolieren und anzureichern, und unter Verwendung des HPLC-Verfahrens wurden acht Hauptbestandteile von Phenylethanoidglykosiden, nämlich Acteosid F, Echinacosid, Cistanosid A, Acteosid, Isoacteosid, Acteosid C, 2′-Acetylacteosid und 6′-Acetylacteosid wurden in der isolierten Phenylethanoidglycosidfraktion gefunden, und die Gehalte waren 3,6 Prozent, 8,8 Prozent, 5,0 Prozent, 13,3 Prozent, 3,3 Prozent, 3,6 Prozent, 9,9 Prozent. bzw. 3,2 Prozent. Echinacosid, eine der Hauptaktivitätsverbindungen, die in C. deserticola [14] nachgewiesen wurde, besitzt nachgewiesenermaßen eine antiosteoporotische Aktivität; Die Dosierung von 270 mg/kg war jedoch so hoch, dass sie ihre weitere klinische Anwendung einschränkte [24]. In den aktuellen Experimenten wurde die gesamte Phenylethanoidglykosidfraktion mit einer niedrigeren Dosierung von 60-240 mg/kg Körpergewicht/Tag an OVX-Ratten verwendet, und die Gehalte an identifizierten Bestandteilen waren in dieser Fraktion durch Verwendung zu fast 50 Prozent rein das HPLC-Verfahren.

Es war allgemein bekannt, dass OVX Osteoporose verursachen kann, und es wurde angenommen, dass eine OVX-Ratte ein klassisches und geeignetes Modell ist, um menschliche postmenopausale Osteoporose zu simulieren. Gleichzeitig wurde eine signifikante Abnahme der Knochenmineraldichte, der trabekulären Knochenmikroarchitektur, des Uterus- und Vagina-Nassgewichts und des Östrogenspiegels sowie eine offensichtliche Zunahme der Knochenresorption und des Körpergewichts nach Ovarektomie-Operationen beobachtet, von denen in Teil aufgrund von Östrogenverlust [25]. Unsere bisherigen Daten haben eindeutig gezeigt, dass OVX tatsächlich postmenopausale Osteoporose induziert und immer von einem starken Rückgang der Knochenqualität, der Knochenmikroarchitektur und des Feuchtgewichts von Uterus und Vagina begleitet wird. Da EV ein allgemeines Hormonersatzmittel ist, das in der klinischen Praxis verwendet wurde, wurde es als Positivkontrolle in unserem In-vivo-Experiment verwendet, und das erhöhte Körpergewicht und atrophierte Uterusgewichte sowie verschlechterte Knochenmineraldichte und trabekuläre Knochenmikroarchitektur waren voraussichtlich durch EV-Supplementierung umgekehrt.

Anders als bei der Positivkontrolle wurden die verringerten Vagina- und Uterusgewichte sowie das zugenommene Gesamtkörpergewicht der Ratten in der OVX-Modellgruppe nicht durch die CDP-Behandlung beeinflusst, was impliziert, dass CDP die Knochenbildung verbessern könnte, ohne die Nebenwirkungen auf Körper und Körper hervorzurufen Uterusorganisches Gewebe. Obwohl die ERR-Spiegel durch die CDP-Behandlung signifikant hochreguliert wurden, war es insofern wie ein Phytoöstrogeneffekt, als keine Nebenwirkungen auf das organische Gewebe von Uterus und Vagina beobachtet wurden. Darüber hinaus stärkte die Behandlung von CDP die Knochenqualität bei OVX-Ratten, die sich durch Ovarektomie-Operationen verschlechtert hatten.

Darüber hinaus wurden auch die Konzentrationen von P und Ca im Urin und Serum von OVX-Ratten verwendet, um die antiosteoporotische Wirkung widerzuspiegeln, und die Konzentrationen von Ca und anorganischem P waren normalerweise abhängig von den Konzentrationen von Calcitonin und PTH [26]. Obwohl in der vorliegenden Studie bei Ratten der OVX-Modellgruppe keine signifikanten abnehmenden oder steigenden Trends bei den Ausscheidungswerten von Ca, Serum-P, Serum-Ca und PTH im Urin festgestellt wurden, waren die signifikanten Konzentrationen von P und Calcitonin im Urin (p < { {1}}) wurden beobachtet. In Übereinstimmung mit den veröffentlichten Daten, dass ein Östrogenmangel, der durch Ovarektomieoperationen verursacht wurde, immer zu einem verringerten Calcitoninspiegel im Blut führte, führte dieses verringerte Serumcalcitonin schließlich zu einem erhöhten PTH-Spiegel, wobei Ca als Hauptregulator der PTH-Sekretion angenommen wurde. Da die Konzentration von PTH keinen signifikanten Unterschied zwischen den OVX- und SHAM-Gruppen in der vorliegenden Studie zeigte, zeigte der Ca-Spiegel sowohl im Serum als auch im Urin auch keine offensichtlichen Veränderungen zwischen den beiden oben genannten Gruppen.

Es wurde jedoch eine signifikant verringerte Tendenz des Calcitoninspiegels zwischen den OVX- und SHAM-Gruppen erhalten, und folglich war der P-Gehalt im Urin von OVX stark verringert. Wir glaubten, dass die obigen Daten das widersprüchliche Phänomen erklären könnten, warum die Urinausscheidung des Ca-Spiegels bei OVX-Ratten keine offensichtliche Veränderung im Vergleich zu SHAM-Ratten aufwies, und dieses Phänomen könnte auch mit der erhöhten Rate des Knochenumsatzes zusammenhängen [27]. . Nach der Behandlung mit CDP waren die P- und Ca-Spiegel im Serum deutlich hochreguliert und der P-Gehalt im Urin war bei OVX-Ratten herunterreguliert, was widerspiegelt, dass CDP nicht nur die Ausscheidung von Knochenmineralelementen verhindern, sondern auch den Serumgehalt dieser Ratten erhöhen konnte Elemente und unterdrückt so indirekt den Knochenschwund.

Darüber hinaus wurden auch die Knochenbildungs- und -resorptionsmarker sowie die antioxidativen Enzyme, einschließlich SOD und GSH, verwendet, um die zugrunde liegenden antiosteoporotischen Mechanismen von CDP zu erklären. Ähnlich wie die publizierten Daten zeigte der ALP-Spiegel bei Ratten der OVX-Modellgruppe einen nicht statistisch signifikant steigenden Trend, der auf eine beschleunigte Rate des Knochenumsatzes bei postmenopausaler Osteoporose hindeutet [10]. Nach der Behandlung mit dem CDP (60, 120 und 240 mg/kg/Tag) war die Eigenschaft von ALP jedoch signifikant verstärkt. Es war allgemein bekannt, dass OVX einen starken Rückgang des Östrogenspiegels verursachte, was normalerweise zu einer überhöhten Knochenresorption und oxidativem Stress führt [28], was durch die bei Ratten besonders hochregulierten Spiegel von TRAP, Cathepsin K und DPD sowie MDA belegt wird OVX-Modellgruppe.

Diese Verschlechterungen wurden jedoch teilweise durch CDP-Eingriffe verbessert. Darüber hinaus zeigte die Behandlung von OVX-Ratten mit CDP (60 und 240 mg/kg) einen signifikanten Anstieg der GSH-Aktivität (p < 0 05). Die obigen Ergebnisse implizierten, dass CDP eine therapeutische Wirkung auf OVX-induzierte Osteoporose zeigte, und diese Wirkungen bestanden sowohl in der Verstärkung der Knochenbildung und Unterdrückung der Knochenresorption als auch in der Verbesserung des Knochen-Antioxidationssystems.

Die Aktivierung von RANK durch seinen Liganden RANKL stimulierte die Expression von NFAT2 und c-Fos über PI3K/AKT- und NF-κB-Signalisierung [29]. NF-κB erwies sich als essentiell für die Osteoklastogenese, da die Störung von NF-κB zu einer beeinträchtigten Osteoklastendifferenzierung mit einem osteoporotischen Phänotyp führen könnte und NF-κB die c-Fos- und die NFAT2-Expression während der RANKL/RANK/TRAF-induzierten Osteoklastogenese hochregulierte und herunterregulierte. Um den positiven Einfluss von CDP auf die NFAT2- und c-Fos-vermittelte Osteoklastogenese abzuschätzen, wurden die Expressionsniveaus von RANKL und RANK analysiert. Erwartungsgemäß hemmte CDP signifikant NFAT2 und stimulierte die c-Fos-Spiegel, indem es die Expression von RANKL und RANK herunterregulierte.

In der Zwischenzeit fehlte RANK selbst die intrinsische Kinaseeigenschaft, es sei denn, TRAF6 gesellte sich hinzu, um die nachgeschaltete Signalübertragung auszulösen [3]. CDP regulierte auch die Expression von TRAF6 herunter, was dazu führte, dass die Bindungsmengen von RANKL und RANK signifikant reduziert wurden. Ein hypothetischer antiosteoporotischer Mechanismus von CDP bei OVX-Ratten umfasste die oben genannten Signalwege, und die Regulatoren wurden in Abbildung 9 beschrieben werden durch RANKL/RANK ausgelöst und reduzieren schließlich die Expression und Aktivitäten der osteoklastogenen Schlüsselproteine ​​NFAT2 und c-Fos. Daher implizierten mehrere Datenhinweise die vorteilhafte Wirkung von CDP auf den Knochenstoffwechsel von OVX-Ratten, hauptsächlich über RANKL/RANK/TRAF6--vermittelte PI3K/AKT- und NF-κB-Wege.

5. Schlussfolgerung

Zusammenfassend zeigten die aus C. deserticola isolierten gesamten Phenylethanoidglykoside signifikante positive Wirkungen auf die postmenopausale Osteoporose von OVX-Ratten, und das therapeutische Potenzial zur Unterdrückung des Knochenverlusts bestand hauptsächlich in der Stimulierung der Knochenbildung und der Hemmung der Knochenresorption sowie der Verbesserung des Knochenantioxidans System; die Mechanismen könnten mit der RANKL/RANK/TRAF6--induzierten NF-κB-Aktivierung und PI3K/AKT-Inaktivierung sowie der c-Fos-Stimulation und NFAT2-Unterdrückung zusammenhängen, und schließlich wurde die Differenzierung von Osteoklasten gehemmt.

Abkürzungen

AKT: Proteinkinase B

ALP: Alkalische Phosphatase

BGP: Knochen-Gla-Protein

BMC: Knochenmineralgehalt

CDP: Fraktion der Phenylethanoidglykoside von C. deserticola

CK: Kathepsin K

CT: Calcitonin

DPD: Desoxypyridinolin

ERR: Östrogenbezogener Rezeptor alpha

EV: Östradiolvalerat

GSH: Glutathion

l-PTH: intaktes Parathormon

MCSF: Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor

MDA: Malondialdehyd

NFAT2: Kernfaktor aktivierter T-Zellen c2

NF-κB: Kernfaktor Kappa B

OPG: Osteoprotegerin

OVX: Ovariektomiert

PhGs: Phenylethanoidglykoside

PI3K: Phosphoinositid-3--Kinase

RANK: Rezeptoraktivator des Nuklearfaktors Kappa B

RANKL: Rezeptoraktivator des Kernfaktor-kappa-B-Liganden

ROI: Region von Interesse

SOD: Superoxiddismutase

Tb. N: Trabekelzahl

Tb.Sp: Trabekuläre Trennung

Tb.Th: Trabekeldicke

TCM: Traditionelle Chinesische Medizin

TMC: Gewebemineralgehalt

TMD: Gewebemineraldichte

TNF: Tumornekrosefaktor

TRAF6: Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-assoziierter Faktor 6

TRAP: Tartratresistente saure Phosphatase.

Datenverfügbarkeit

Die zur Stützung der Ergebnisse dieser Studie verwendeten Daten sind auf Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Interessenskonflikte

Die Autoren hatten keinen Interessenkonflikt.

Autorenbeiträge

XM entwarf und überwachte die Experimente; SD und LY führten die meisten Experimente durch und entwarfen das Manuskript; BZ und JL führten die Western-Blot-Analyse durch und nahmen an Tierversuchen teil; YD analysierte die Daten; QT und PY überarbeiteten das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft. Lingling Yang und Shuqin Ding haben zu gleichen Teilen zum Manuskript beigetragen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), der National Natural Science Foundation of China (No. 81560684), des Key Research and Development Program of Ningxia (2018BHF2001), der Ningxia Key Research und unterstützt Invention Program of Science and Technology Cooperation of the East and the West (Nr. 2017BY084 und 2017BY079) und der West Light Foundation der Chinese Academy of Sciences-Young Scientists of West 2017.

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