Vorteilhafte Wirkungen der gesamten Phenylethanoidglycosid-Fraktion, die aus Cistanche Deserticola isoliert wurde, auf die Knochenmikrostruktur bei ovarektomierten Ratten Ⅰ

Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die antiosteoporotische Aktivität der gesamten isolierten Phenylethanoidglycosidfraktion abzuschätzenC. deserticola(CDP) an Ratten, die durch Ovarektomie (OVX) induziert wurden, sowie die damit verbundenen Mechanismen. Nach 3 Monaten oraler Verabreichung war dieverminderte Knochenmineraldichte, Serum-Ca und P in OVX-Ratten wurden wiederhergestellt und die Trabekel verschlechtertKnochenmikroarchitekturwurde teilweise durch eine CDP-Intervention (60, 120 und 240 mg/kg) verbessert, die Aktivitäten der Knochenresorptionsmarker wurden herunterreguliert und die Bioaktivität des Knochenbildungsindex wurde hochreguliert; In der Zwischenzeit wurde der MDA-Gehalt gesenkt und der GSH-Gehalt durch die CDP-Behandlung erhöht. Von der Zusammensetzung her waren 8 Phenylethanoidglycosidverbindungen identischFied in CDP, mit den GesamtinhaltsmengenFiMit der HPLC-Methode wurden 50,3 % ermittelt. Mechanistisch gesehen senkte CDP die Spiegel von TRAF6, RANKL und RANK und unterdrückte so die durch RANKL/RANK/TRAF6-induzierte Aktivierung von nachgeschaltetem NF-κB- und PI3K/AKT-Signalwege und verhindert letztendlich die Aktivitäten der wichtigsten osteoklastogenen Proteine ​​NFAT2 und c-Fos. Alle oben genannten Daten deuten darauf hin, dass CDP Vorteile zeigteFicial effAuswirkungen auf die Knochenmikrostruktur bei ovarektomierten Ratten, und diese zffects können mit der NF zusammenhängenκB- und PI3K/AKT-Signalwege, die durch die Bindung von RANKL, RANK und TRAF6 ausgelöst wurden.

NATÜRLICHE BIO-CISTANCHE FÜR DAS KNOCHENWACHSTUM

1. Einleitung

Postmenopausale Osteoporose, an der jede dritte Frau über 50 Jahre leidet, entwickelt sich zu einem Hauptgesundheitsrisiko, von dem mehr als 200 Millionen Frauen auf der ganzen Welt betroffen sind [1]. In den Wechseljahren führt der starke Abfall des Östrogenspiegels in der Regel zu einer übermäßigen Knochenresorption, die durch eine verstärkte Osteoklastogenese verursacht wird; dann das Gleichgewicht zwischen Osteoblasten-induzierter Knochenbildung und Osteoklasten-induzierterKnochenresorptionist gestört und der beschleunigte Knochenabbau verursachte schließlich Osteoporose und sogar Hüft- oder Wirbelsäulenfrakturen [2]. Es wurde angenommen, dass die Differenzierung des Osteoklasten ausgelöst wurde, als der Rezeptoraktivator des Kernfaktors Kappa B (RANK) an RANKL, den Liganden von RANK, band. Die Kombination von RANK und RANKL kann jedoch nur dann aktiviert werden, wenn der Protein-Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-assoziierter Faktor 6 (TRAF6) daran beteiligt ist [3], gefolgt von der Stimulation der nachgeschalteten Signalwege, einschließlich PI3K/AKT und NF-κB . Schließlich wurde die Expression des Kernfaktors aktivierter T-Zellen c2 (NFAT2) und c-Fos reguliert [4], um die Differenzierung des Osteoklasten sowie die Knochenresorption zu modulieren. Daher galten die Faktoren und Regulatoren, die direkt oder indirekt mit der Aktivierung und Differenzierung von Osteoklasten zusammenhängen, als entscheidende Ziele zur Verhinderung von Knochenschwund.

Es gibt tatsächlich einige klinische und synthetische Hormonersatzmedikamente wie Östradiolvalerat, die bei der Behandlung von postmenopausaler Osteoporose wirksam sind. Leider erhöhten einige davon das Risiko schwerer Krebserkrankungen, einschließlich Brust- und Endometriumkrebs [5], was ihre klinische Anwendung einschränkte. Daher ist es notwendig, andere Alternativen mit sowohl Wirksamkeit als auch minimalen Nebenwirkungen auszuwählen. Traditionelle chinesische Arzneimittel (TCM) sowie die isolierten bioaktiven Verbindungen und Fraktionen [6–9] haben sich bei verschiedenen Beschwerden, einschließlich postmenopausaler Osteoporose, als wirksam erwiesen. Unter diesen bioaktiven Komponenten und Fraktionen galten Phenylethanoidglycoside (PhG)-Verbindungen mit potenzieller Wirksamkeit als vielversprechende Wirkstoffe für die Behandlung von Osteoporose [10–12]. Die Strukturen von PhGs bestehen aus Zimtsäureaglykon, einer Hydroxylphenylethylgruppe, die über eine glykosidische Bindung mit -Glucopyranose, Apiose, Galaktose, Rhamnose oder Xylose verbunden ist. Sie kommen häufig in medizinischen Arten der Gattung Cistanche vor [13]. Cistanche deserticola YC Ma ist ein offizielles TCM, das im chinesischen Arzneibuch aufgeführt ist, und C. deserticola ist nicht nur ein wichtiges TCM [14], sondern auch ein Anti-Aging-Tonikum mit wenigen Nebenwirkungen, das zu medizinischen Likören und Nährflüssigkeiten entwickelt wurde, die von zugelassen sind die staatliche Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde. Basierend auf den Aufzeichnungen des chinesischen Arzneibuchs wurde C. deserticola traditionell von Einheimischen zur Behandlung von Problemen mit Nierenessenzmangel wie Muskelschwäche und Lendenwirbelsäulenschwäche verwendet, und Phenylethanoidglycosidverbindungen, einschließlich Echinacosid und Acetonid, sind die wichtigsten bioaktiven Bestandteile in diesem Kraut. Nach der TCM-Theorie „Niere wird über den Knochen gesteuert“ wird das Knochensystem von der Nierenessenz gesteuert [15], und Knochenprobleme wie Osteoporose könnten durch Kräuter oder Verbindungen geheilt werden, die die Nierenessenz nähren. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die gesamte aus C. deserticola isolierte Phenylethanoidglycosid-Fraktion zumindest teilweise bei der Behandlung von Osteoporose von Nutzen war. Das aktuelle Experiment wurde daher entwickelt, um unsere Hypothese mithilfe eines ovarektomierten (OVX) Rattenmodells zu validieren. Neben den Knochenresorptions- und -bildungsmarkern, die geschätzt werden müssen, wurden auch der Antioxidationsindex sowie die durch RANKL/RANK/TRAF6- induzierten PI3K/AKT- und NF-κB-Signalwege verwendet, um die Hauptmechanismen der antiosteoporotischen Bioaktivität zu untersuchen .

2. Materialien und Methode

2.1. Pflanzenmaterialien und Vorbereitung.

Insgesamt 30 kg Stängel von Cistanche deserticola YC Ma wurden im Yongning County im September 2015 mit den Koordinaten 106.026597 und 38.262816 gesammelt. Provinz Ningxia, China. Das Kraut wurde von Dr. Lin Dong (Abteilung für Pharmakognosie, Ningxia Medical University) identifiziert und ein entsprechendes Exemplar (#20150901) wurde in der Abteilung aufbewahrt der Pharmazeutischen Analytik. Zunächst wurden 30,0 kg pulverisiertes C. deserticola unter Verwendung der Rückflussmethode mit 70 % Ethanol als Lösungsmittel extrahiert; Das Verhältnis von Material zu Lösungsmittel wurde auf 1:10 eingestellt und die Rückflusszeit betrug dreimal 2 Stunden. Anschließend wurden alle Filtrate vereinigt und unter reduziertem Druck bei 60 °C kondensiert. Zweitens wurden makroporöse AB-8-Harzsäulen für die Vortrennung verwendet und unterschiedliche Verhältnisse von Ethanol in Wasser (0 %, 20 %, Zum Eluieren wurden 30 %, 40 %, 50 % und 60 % (je 60 L) eingesetzt. Drittens wurden die 40 %- und 50 %-Eluenten kombiniert und unter Verwendung wiederholter makroporöser AB-8-Harzsäulen mit den Eluenten 0 %, 20 %, 30 %, 40 % und 50 % Ethanol in Wasser weiter gereinigt jeder Eluent betrug 12 l. Schließlich wurde die 40 %-Fraktion gesammelt und unter reduziertem Druck kondensiert, um 150 g hellgelbe Sediment-Phenylethanoidglycosid-Fraktion von C. deserticola (CDP, die Ausbeute betrug 0,5 %) zu erhalten. Für In-vivo-Experimente wurde 0,5 % CMC-Na-Lösungsmittel verwendet, um CDP aufzulösen; Die orale Verabreichung an Tiere wurde auf 1 ml/100 g Körpergewicht festgelegt; Für die In-vitro-Western-Blot-Analyse wurde CDP mit DMSO gelöst und dann mit DMEM verdünnt, um die Endkonzentrationen von 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml und 0,001 mg/ml zu erhalten.

2.2. Chemikalien und Lösungsmittel.

Östradiolvalerat (EV) stammte von Delpharm Lille SAS, Frankreich; alkalische Phosphatase (ALP),Knochen-Gla-Protein(BGP), Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) und Desoxypyridinolin (DPD)-Vernetzungs-ELISA-Kits von Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China, 201605; Reagenzienkits für Malondialdehyd (MDA, 20181221), Superoxiddismutase (SOD, 20121218) und Glutathion (GSH, 20181221) vom Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, China; Intaktes Parathormon (l-PTH, NEWASHE7UZ), Calcitonin (2L9ISN7AIU) und Östrogen-verwandter Rezeptor Alpha (ERR, Y3AY8QEWB3) Crosslink-ELISA-Kits von Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, China; Cathepsin K ELISA-Reagenzienkit von BioVision, Amerika, 1l300141; Primärantikörper von RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3-Kinase p85 alpha (AC09021266), AKT 1 (AF05173234), -Actin (17AV0411) und sekundäre Antikörper von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG von ZSGB-BIO, China, 136080; Gesamt-BCA-Protein-Assay-Kit und das kommerzielle Kit zum Nachweis der Oste-Oclast-Bildung sowie fötales Rinderserum und Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von HyClone, Logan, UT, USA; Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran von Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; Penicillin und Streptomycin von Gibco, Rockville, MD, USA. Alle anderen verwendeten chemischen Mittel waren von AR-Qualität.

2.3. HPLC-Quantifizierung von CDP.

Zur Identifizierung und Quantifizierung der Zusammensetzung von CDP wurde ein Agilent 1220 HPLC-Gerät eingesetzt. Die Chromatographiebedingungen waren wie folgt: C18-Säule (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); Die Gradientenelution enthielt die Lösungsmittel A (Acetonitril) und B (Wasser mit 0,5 % Essigsäure) (0-10 min: 17-20 % A; 10-30 min: 20-25 % A; und 30-40 min: 25-30% A); die Detektionswellenlänge betrug 333 nm; Umgebungstemperatur; Die Flussrate betrug 1,0 ml/min. Das Probeninjektionsvolumen betrug 5 μl. Acht PhG-Verbindungen, nämlich Cistanosid F, Echinacosid, 6′-Acetylacteosid, Cistanosid C, Cistanosid A, Acteosid, 2′-Acetylacteosid und Isoacteosid, wurden identifiziert; Unter Verwendung der entsprechenden Referenzsubstanzen und einer externen Standardmethode wurden die Gehalte der oben genannten 8 PhGs mittels HPLC-Analyse quantifiziert (Abbildung 1).

Abbildung 1: HPLC-Fingerabdruck von CDP. In dieser Fraktion wurden acht Phenylethanoidglycosidverbindungen gefunden, und der Gesamtgehalt wurde mit 50,7 % beziffert. Die Verbindungen und ihre Inhaltsstoffe waren wie folgt: (1) Acteosid F (3,6 %), (2) Echinacosid (8,8 %), (3) Cistanosid A (5,0 %), (4) Acteosid (13,3 %), (5) Isoacteosid (3,3 %), (6) Acteosid C (3,6 %), (7) 2′-Acetylacteosid (9,9 %) und (8) 6′-Acetylacteosid (3,2 %).

2.4. Tierversuchsprotokoll.

Insgesamt wurden 6 0 weibliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 3 Monaten aus dem Tierversuchszentrum der Ningxia Medical University mit einem durchschnittlichen anfänglichen Körpergewicht von etwa 234 ± 25 g ausgewählt. Die Ratten wurden in einer Standardumgebung ohne Krankheitserreger gehalten, die für die Akklimatisierung eine Woche lang gedacht war. Dann wurden alle Ratten nur anästhesiert (Chloralhydrat, 100 mg/kg, ip) oder einer Schein-Ovarektomie (SHAM) unterzogen, oder zwei Eierstöcke wurden beide entfernt und dann zufällig in 5 Untergruppen aufgeteilt: oral mit Vehikel behandelt (0,5 % CMC- Na) wurde als Modellgruppe (OVX), Östradiolvalerat (1 mg/kg/Tag) als positive Gruppe (EV) und 60, 120 und 240 mg/kg/Tag CDP als niedrig (CDPL) festgelegt. mittlere (CDPM) bzw. hohe (CDPH) Dosierungsgruppen. Allen Ratten wurde täglich eine orale Verabreichung verabreicht, die drei Monate lang anhielt, wobei die Dosierung alle zwei Wochen angepasst wurde, abhängig von der Veränderung des gesamten Körpergewichts. Am letzten Tag des Tierversuchs wurde mithilfe von Stoffwechselkäfigen 24-stündiger Urin gewonnen; Serum wurde aus der Oberschenkelarterie narkotisierter Ratten entnommen; Die rechte Femora, Tibia und alle Organe wurden präpariert und zur weiteren Analyse bei -80 Grad C gelagert. Die von uns durchgeführten Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ningxia Medical University genehmigt.

2.5. Bestimmung der Knochenmineraldichte und Mikro-CT-Analyse.

Zunächst wurde ein Dual-Energy-Röntgenabsorptiometriegerät (Lunar, USA) verwendet, um die gesamte Knochenmineraldichte des rechten Oberschenkelknochens jeder Ratte abzuschätzen; Zweitens wurde derselbe Femur verwendet, um das 3D-Bild der trabekulären Knochenmikroarchitektur mithilfe eines Mikro-CT-Scanners (GE, Amerika) abzuschätzen. Die isotrope Auflösung wurde auf 14 μm eingestellt, um ein ideales 3D-Bild zu erhalten; Der interessierende Bereich (ROI) wurde ausgewählt, indem in der Wachstumsfuge des Femurs jeder Probe die gleichen Koordinaten festgelegt wurden. und die knochenmorphometrischen Parameter einschließlich Trabekeltrennung (Tb.Sp), Trabekelzahl (Tb.N), Trabekeldicke (Tb. Th), Knochenmineralgehalt (BMC), Gewebemineraldichte (TMD) und Gewebemineralgehalt (TMC). ) wurden durch Analyse des ROI ermittelt.

2.6. Biochemischer Serum- und Urintest.

Die Aktivitäten von Serum-Cathepsin K, TRAP, SOD und GSH sowie der Gehalt an Serum-PTH, Calcitonin, ERR, MDA, BGP und Urin-DPD wurden unter Verwendung entsprechender Reagenzienkits gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt Der Gehalt an alkalischer Phosphatase (ALP) und der Gehalt an Calcium (Ca) und Phosphor (P) im Serum und Urin wurden mithilfe eines Automaten (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA) geschätzt.

2.7. Western-Blot-Analyse.

Osteoklasten wurden durch die Verwendung von RAW 264.7-Zellen, denen Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (MCSF) und RANKL zugesetzt waren, induziert. Kurz gesagt, 1 × 107 RAW 264.7-Zellen wurden in einer 6-Well-Platte in Gegenwart von 30 ng/ml MCSF und 25 ng/ml RANKL kultiviert. Nach 6 Tagen Induktion wurden die reifen Osteoklastenzellen mithilfe der TRAP-Färbemethode mit dem entsprechenden Kit identifiziert und dann mit CDP (0.1, 0.01 und 0,001 mg/ml behandelt , bzw.) für 24 h; Anschließend wurden die Zellen mit einem Lysepuffer, der 0,5 mmol Phenylmethylsulfonylfluorid sowie Protease- und Phosphataseinhibitoren enthielt, lysiert. Das Lysat wurde dann mithilfe von 10 % SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen, die mit AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos und -Actin sondiert wurde ( 1 : 400) nach 2-stündiger Blockierung mit 5 % fettfreier Milch. Dieselben Membranen wurden abgezogen und erneut mit den oben genannten 9 entsprechenden Antikörpern sondiert und am Ende von der Image Lab-Software erkannt. Die Experimente wurden dreimal wiederholt.

2.8. Statistische Analyse.

Alle aus In-vivo- und In-vitro-Experimenten erhaltenen Daten, beschrieben als Mittelwert ± SD, wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Dunnett-Test (SPSS 22.0-Software, SPSS, USA) analysiert. p < 0 05 war statistisch signifikant.

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