Steigerung der Antikrebsaktivität von Aspergillus Favus „Endophyt von Jojoba“ Taxol durch Konjugation mit Goldnanopartikeln, vermittelt durch ‑Bestrahlung
May 30, 2023
Taxol Alternative chinesische Kräuter Cistanche
Schlüsselwörter:Aspergillus favus · Jojoba · Endophytische Pilze · Goldnanopartikel · Taxol · -Bestrahlung · Ernährungsoptimierung
Einführung
Taxol ist eines der am meisten kommerzialisierten BreitspektrumprodukteMedikamente gegen Krebs[1]. Die Aktivität von Taxol beruht auf seiner einzigartigen Spezifität für die Bindung an das Heterodimer der zellulären Tubulin-Untereinheiten, wodurch die Tubulin-Polymerisation gefördert und so die mitotische Teilung von Tumorzellen gestört wird [2]. Taxol zeigte eine starke Wirkung gegen Brust-, Lungen-, Kopf- und Halskrebs, Gebärmutterkrebs und fortgeschrittene Formen des Kaposi-Sarkoms [3]. Taxol wurde zunächst aus der Rinde der Eibe Taxus brevifolia „Familie Taxaceae“ hergestellt [4, 5]; Allerdings ist die Ausbeute an Taxol geringer<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as Asthma,Entzündung, UndKrebs[32]. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand daher darin, ein neues Pilzisolat aus der Jojobapflanze mit einzigartiger Stoffwechselstabilität für die Taxolproduktion zu erforschen, die verschiedenen Ansätze zur Maximierung ihrer Taxolausbeute zu bewerten und die antiproliferative Aktivität der extrahierten Taxolverbindungen zu verbessern durch Konjugation mit Goldnanopartikeln, vermittelt durch Gammabestrahlung.
Material und Methoden
Isolierung und Kultivierung der endophytischen Pilze
Verschiedene Teile von Jojoba (Simmondsia chinensis) wie Blätter, Rinden, Zweige und Knospen wurden an der Fakultät für Landwirtschaft der Universität Kairo gesammelt und als Quelle für endophytische Pilze verwendet. Die Pflanzenteile wurden gesammelt und unter fließendem Leitungswasser gewaschen, 1 Minute lang mit 70-prozentigem Ethanol oberflächlich sterilisiert und dann mit sterilem Wasser gespült [28]. Die oberflächensterilisierten Pflanzenteile wurden unter sterilen Bedingungen in kleine Stücke geschnitten und auf Platten mit Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Medium, Czapek's-Dox und Malzextrakt-Agar-Medium [33–36] gelegt, und die Platten wurden bei 30 Grad inkubiert 10 Tage. Die Wirksamkeit der Oberflächensterilisation der Pflanzenteile wurde durch Zentrifugieren des Spülwassers beurteilt, anschließend wurden 500 μl steriles Wasser zum Niederschlag gegeben und in PDA-Medium ausplattiert [37]. Die gereinigten endophytischen Pilzisolate wurden 7 Tage lang auf PDA-Schrägen geimpft und bei 4 Grad gelagert
Screening, Extraktion und Quantifizierung von Taxol aus endophytischen Pilzen
Die gewonnenen endophytischen Pilze, die Jojoba bewohnen, wurden durch Wachstum auf Kartoffel-Dextrose-Brühe (PDB) auf Taxolproduktion untersucht [38]. Ein Pfropfen jedes der 7 Tage alten Fun-Gal-Isolate wurde in 1 00 ml PDB/250 ml Erlenmeyer-Puffer inokuliert und 15 Tage lang bei 30 ± 1 Grad unter Schüttelbedingungen (120°C) inkubiert U/min). Nach der Inkubation wurden die Kulturen filtriert und das Filtrat mit 0,2 Prozent Natriumbicarbonat versetzt, um Fettsäuren auszufällen. Taxol wurde mit Dichlormethan extrahiert, und die organische Phase wurde gesammelt und zur Trockne eingedampft, und die Rückstände wurden in Methanol erneut gelöst [17, 39]. Taxol wurde abgetrennt und durch TLC unter Verwendung von vorbeschichteten 1 mm (20 × 20 cm) Silicagelplatten von Merck (TLC Silica Gel 60 F254, Darmstadt, Deutschland) identifiziert und durch UV-Beleuchtung bei 254 nm nachgewiesen [39]. Die mutmaßlichen Taxolflecken wurden von den TLC-Kieselgelplatten abgekratzt und in Methanol gelöst, 10 Minuten lang kräftig gevortext und 5 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Die ausgefällten Silicapartikel wurden entfernt und der Überstand wurde zur Taxol-Quantifizierung und Reinheitsprüfung mittels HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quaternary Pump, Korea) an einer C18-Umkehrphasensäule (Eclipse Plus C18 4.6) entnommen ×150 mm, 3,5 μm, Kat.-Nr. 959,963–902). Die verwendete mobile Phase war Methanol/Acetonitril/Wasser (25:35:40, Vol./Vol./Vol.) mit einer Durchflussrate von 1,0 ml/min für 20 Minuten [40], und die Taxolfraktionen wurden bei 227 nm gemessen Die chemische Identität und Konzentrationen wurden anhand der Retentionszeit und der Absorptionspeakfläche im Vergleich zur authentischen Probe bestätigt.
Morphologische und molekulare Identifizierung der gewonnenen endophytischen Pilze
Die endophytischen Pilzisolate wurden auf der Grundlage ihrer makro- und mikromorphologischen Merkmale durch Wachstum auf PDA-, Czapek-Dox- und Malzextraktmedien gemäß den Schlüsseln der Referenz [33–36] auf ihre Artenebene identifiziert. Die Identität der wirksamsten Taxol-produzierenden Pilzisolate wurde anhand der Sequenz des internen transkribierten Spacers (ITS) weiter molekular bestätigt (41, 42). Genomische Pilz-DNA (gDNA) wurde durch Pulverisieren des Myzels (~0,2 g) in flüssigem Stickstoff und anschließendes Verteilen in 1 ml CTAB-Extraktionspuffer (2 Prozent CTAB, 2 Prozent PVP40, {) extrahiert. {21}},2 Prozent 2-Mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0). Die PCR-Primersätze waren ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ und ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. Die PCR-Reaktion enthält 10 µl 2×PCR-Mastermischung (i-Taq™, Kat.-Nr. 25027), 2 µl gDNA, 1 µl jedes Primers (10 pmol/µl) und wurde mit sterilem Destillat auf 20 µl vervollständigt Wasser. Die PCR war auf anfängliche Denaturierung bei 94 Grad für 2 Minuten, Denaturierung bei 94 Grad für 30 Sekunden, Annealing bei 55 Grad für 10 Sekunden, Verlängerung bei 72 Grad für 30 Sekunden für 35 Zyklen und abschließende Verlängerung bei 72 Grad für 2 programmiert Mindest. Die PCR-Amplikons wurden mit 1,5-prozentigem Agarosegel in 1×TBE-Puffer (Ambion Kat.-Nr. AM9864) unter Verwendung einer 1-kb-DNA-Leiter (Kat.-Nr. PG010-55DI) analysiert und durch ein Geldokumentationssystem visualisiert. Die Amplikons wurden mit Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Version 6.0, mit denselben Primersätzen gereinigt und sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden nicht redundant durch BLAST in der NCBI-Datenbank durchsucht, in die MEGA 6.0-Software importiert und mit dem Clustal W-Muskelalgorithmus abgeglichen (43), und der phylogenetische Baum wurde mit der Neighbor-Joining-Methode von MEGA 6.0 erstellt (44).
Chemische Struktur des extrahierten Taxols
Die mutmaßlichen Taxolflecken wurden von den TLC-Kieselgelplatten abgekratzt und gereinigt, und die Reinheit und Konzentration wurden durch UV-Vis-Analysen bei λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000-Serie) im Vergleich zu authentischem Taxol bestimmt [39]. Als negative Basislinie für die spektrophotometrischen Analysen wurden leere Medien unter den gleichen Bedingungen verwendet. Das FT-IR-Spektrum der gereinigten Taxolproben wurde mit dem JASCO FT-IR 3600-Spektrophotometer analysiert. Die Taxol-Probe wurde mit KBr-Pellets gemahlen, unter Vakuum in Scheiben gepresst und die Absorption wurde im Bereich von 400 bis 4000 cm−1 [3] im Vergleich zur authentischen Probe gemessen. Die chemische Struktur des extrahierten Taxols wurde durch HNMR-Spektroskopie (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) im Vergleich zu authentischem Taxol bestätigt. Die Proben wurden in CDCl3 gelöst, die chemischen Verschiebungen werden in ppm (δ-Skala) angegeben und die Kopplungskonstanten werden in Hertz (Hz) ausgedrückt.
Einfluss verschiedener Medientypen auf die Taxolproduktion
Zwei Agarpfropfen (9 mm) aus 7 Tage alten Kulturen jedes Pilzisolats wurden dreifach in 100 ml Medium/250 ml Erlenmeyerkolben mit Kartoffeldextrose (PDB), Czapeks-Dox (CZD), M1D und Malzextrakt (ME) inokuliert ) Bouillonmedien. Als Negativkontrolle wurden nicht inokulierte Kontrollen aus jedem Medium verwendet, die frei von Pilzsporen waren und 15 Tage lang bei 30 Grad unter den gleichen Bedingungen inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die Pilzkulturen filtriert und Taxol extrahiert und wie oben beschrieben bestimmt.
Bioprozessoptimierung der Ernährungsbedingungen zur Maximierung der Taxol-Ausbeute
Die Optimierung der Mediumzusammensetzung zur Maximierung der Taxol-Ausbeute durch das wirksame Pilzisolat wurde mithilfe der Reaktionsoberflächenmethode unter Verwendung des Placket-Burman-Designs und anschließend des zentralen Verbunddesigns durchgeführt [17–20, 45]. Aus den RSM-Designs wurden die positiven und signifikanten Variablen, die die Taxolproduktion durch das wirksame Pilzisolat beeinflussen, mithilfe des Statistiksoftwarepakets von Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA) bewertet. Jedes Experiment wurde in drei biologischen Wiederholungen durchgeführt und die Mittelwerte wurden berücksichtigt. Nach der Inkubation unter den gewünschten Bedingungen wurde die Pilzbiomasse filtriert und Taxol extrahiert und wie oben beschrieben durch TLC und HPLC quantifiziert.
Knopfleiste im Burman-Design
Das Placket-Burman-Design wurde häufig zur Optimierung der Medienkomponente für das Pilzwachstum und die Produktion bioaktiver Sekundärmetaboliten verwendet, um die wesentlichen Variablen zu bewerten, die die Taxolproduktion beeinflussen [18, 20, 46]. Die Wahl des Faktors basierte auf den im qualitativen und quantitativen Screening verwendeten Medien. Elf Faktoren wurden einbezogen; Malzextrakt, Pepton, Saccharose, Sojaton, Glutamin, Rindfleischextrakt sowie Werte und Faktoren für Temperatur, pH-Wert, Inkubationszeit sowie Schüttelgeschwindigkeit wurden über zwei Ebenen variiert und die minimalen und maximalen Levelbereiche wurden ausgewählt. Mit dem statistischen Design-Expert 7.0 wurde eine Reihe von 12 Experimenten erstellt. Für jedes Experiment wurde die Taxolproduktion in drei biologischen Replikaten bestimmt und der durchschnittliche Taxolertrag berücksichtigt.
Die Regressionsanalyse der Daten wurde mithilfe einer Statistiksoftware durchgeführt. Der Effekt jeder Variablen wurde mithilfe der folgenden Gleichung berechnet (Biometrika, 2020):
Dabei ist E der Effekt einer Testvariablen, M plus und M − die Taxolkonzentration der Versuche, bei denen der Parameter auf seinem höheren bzw. niedrigeren Niveau lag, und N die Anzahl der durchgeführten Experimente. Die Auswirkung jeder Variablen auf die Produktion wurde durch Berechnung ihrer jeweiligen E-Werte bestimmt.
Dabei ist „Tot hoch“ die Gesamtantwort auf der hohen Ebene, „Tot niedrig“ die Gesamtantwort auf der niedrigen Ebene und „Nein“ die Anzahl der Versuche.
Zentraler Verbundaufbau und Wechselwirkungen zwischen Faktoren, die die Taxolproduktion beeinflussen
Die wichtigsten positiven Faktoren, die die Taxolproduktion durch das ausgewählte Pilzisolat beeinflussen, wurden mithilfe eines experimentellen CCD-Modelldesigns vom Reaktionsoberflächentyp optimiert [47]. Durch den Einsatz von CCD wurden die Konzentrationen der Mediumkomponenten optimiert und deren untersuchte Wechselwirkungen zur Generierung von insgesamt 20 Experimenten für die drei Variablen genutzt. Um die optimalen Werte der Variablen für die Taxolproduktion aus dem wirksamen Pilzisolat zu bestimmen, wurden dreidimensionale (3D) Reaktionsoberflächenkurven aufgezeichnet, um die Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Faktoren zu untersuchen und den variablen Zustand jedes Faktors zu bestimmen, der die Taxolproduktion beeinflusst. Die 3D-Diagramme wurden erstellt, indem die Konstanten von drei Faktoren auf einem idealen Niveau gehalten und die erhaltene Reaktion des Taxolertrags für unterschiedliche Niveaus der anderen beiden Faktoren aufgezeichnet wurden.
Einfluss der Gammabestrahlung auf die Taxol-Ausbeute
Die wirksamen endophytischen Isolate, die Taxol produzieren, wurden einer Bestrahlung mit einer 60Kobaltquelle (Gammazelle 4000-A-Indien) bei verschiedenen Gammastrahlungsdosen (0,25–3,0 kGy) ausgesetzt und verglichen zur Kontrolle der nicht bestrahlten Kultur; eine Dosisleistung von 1,2 kGy/h zum Zeitpunkt der Experimente. Die optimierten Medien wurden mit der bestrahlten Kultur unter Standardkulturbedingungen beimpft, verglichen mit dem nicht bestrahlten Sporeninokulum als Kontrolle. Die Kulturen wurden 15 Tage lang bei 30 ± 2 Grad auf einem Rotationsschüttler (120 U/min) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kulturen filtriert und Taxol wie oben beschrieben extrahiert, gereinigt und durch TLC und HPLC quantifiziert.
Synthese und Charakterisierung von Gold-Nanopartikeln (AuNPs); Konjugation mit Taxol
Antikrebsaktivität von Taxol
Die Aktivität der gereinigten Taxol- und Taxol-PVP-AuNPs-Konjugate gegen Leberkarzinom (HPG2) und Brustkarzinom (MCF7) wurde durch 3- (4,5-Dimethylthiazol- 2-yl) bestimmt. -2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay [48]. Die 96-Well-Platte wurde mit 103 Zellen pro Well besät und über Nacht bei 37 Grad inkubiert, dann wurden verschiedene Konzentrationen des Arzneimittels zugegeben und die Platten wurden 48 Stunden lang erneut inkubiert. Das MTT-Reagens (25 μl) wurde zugegeben und 2 Stunden lang inkubiert, und die violette Farbe des entwickelten Formazan-Komplexes wurde bei λ570 nm gemessen. Der IC50-Wert wurde durch die Medikamentenmenge ausgedrückt, die das Wachstum von 50 Prozent einer anfänglichen Anzahl von Tumorzellen reduzierte, die sich zur Positivkontrolle normalisierten.
Antimikrobielle Aktivität von Taxol und Taxol-AuNPs-Konjugaten
Die antimikrobielle Aktivität von Taxol und Taxol-AuNPs-Konjugaten wurde im Vergleich zu verschiedenen Bakterienisolaten bewertet; Bacillus subtilis ATCC 6633 und Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Enterobacter agglomerans, zusätzlich zu Candida albicans. Die getesteten Bakterienzellen wurden in sterilem Peptonwasser suspendiert, um ein Standardinokulum von ~0,5 McFarland (1–1,5)× 1{{10}}8 KBE/ml bei λ6{{18) zu erhalten }}0 nm. Die Wachstumshemmung (mm) des Wachstums mikrobieller Krankheitserreger wurde mit der Agarscheiben-Diffusionsmethode bewertet. Als Positivkontrollen wurden sterile Standard-Antibiotikascheiben mit einem Durchmesser von 6,0 mm verwendet. Sterile Antibiotikascheiben (6,0 mm) wurden mit 20 µl Methanol und Amoxicillin-Clavulansäure (AMC) als Negativ- und Positivkontrolle beladen. Die Scheiben wurden mit der gleichen Konzentration an Taxol, Taxol-PVP-AuNPs und AuNPs (1,0 ug/ml) beladen. Es wurden drei biologische Replikate hergestellt. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert und die Hemmzonen wurden gemessen. Amoxicillin-Clavulansäure (AMC) und Nystatin wurden verwendet, um die antimikrobielle Aktivität von Taxol zu normalisieren. Die Wachstumshemmzone wurde mit einem Messschieber (mm) bestimmt.
Statistische Analysen
Fishers geringster signifikanter Unterschied im Post-hoc-Test.
Pilzablagerung
Ergebnisse
Isolierung endophytischer Pilze aus Jojoba; Screening auf Taxolproduktion
Vierundzwanzig endophytische Pilzisolate wurden aus Rinden, Zweigen, Blättern und Knospen von Jojoba gewonnen, die auf PDA-, CZD- und ME-Medium geladen waren. Diese Pilzisolate wurden aus Rinden (6 Isolate), Zweigen (7 Isolaten), Blättern (4 Isolaten) und Knospen (7 Isolate) gewonnen, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Diese Pilzisolate wurden zunächst anhand ihrer Morphologie auf Artebene identifiziert Merkmale gemäß den Universalschlüsseln, die zu drei Gattungen gehören, nämlich Aspergillus, Penicillium und Fusarium. Unter diesen Isolaten lag die Prävalenz der Gattung Aspergillus Berichten zufolge bei 83,4 Prozent, während Fusarium und Penicillium mit 8,3 Prozent vertreten waren. Die Gattung Aspergillus wurde durch fünf Arten repräsentiert, nämlich A. favus (3 Isolate), Aspergillus oryzae (5 Isolate), A. niger (5 Isolate), A. fumigatus (4 Isolate) und A. terreus (3 Isolate). Die Produktivität von Taxol durch die gewonnenen Pilzisolate wurde durch Wachstum auf PDB, Inkubation unter Standardbedingungen, Extraktion und Quantifizierung von Taxol durch TLC und HPLC bewertet (Abb. 1). Den Ergebnissen zufolge wurde die maximale Taxolproduktivität von A. favus Bd1 (88,65 µg/l) gemeldet, gefolgt von P.polonicum Br1 (54,42 µg/l), A. niger Lv1 (43,95 µg/l) und A. oryzae Bd1 (38,87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26,80 µg/l), A. niger Lv2 (23,01 µg/l) und A. fumigatus Bd2 (17,62 µg/l) l). Die strukturelle chemische Identität von Taxol aus den stärksten Pilzproduzenten wurde anhand ihrer UV-Vis-Spektren im Vergleich zum chemischen Spektral des authentischen Taxols offenbart. Darüber hinaus wurde die chemische Struktur von Taxol, das aus den vier wirksamsten Pilzisolaten extrahiert wurde, durch FT-IR-Analysen validiert (Abb. 1). Bemerkenswerterweise zeigte das aus den wirksamen Pilzisolaten extrahierte Taxol das gleiche Spektralparadigma wie authentisches Taxol. Der Peak bei 3393,3 cm-1 wurde der Hydroxylgruppe (OH) zugeordnet. Während die Peaks bei 2923,5 der aliphatischen CH-Streckschwingung zugeordnet wurden, entsprechen die Peaks bei 1661,0 cm−1 der C=O-Streckschwingungsfrequenz. Der beobachtete Peak bei 1452,0–1404,0 cm−1 war auf die NH-Streckfrequenz zurückzuführen. Die Carbonylgruppen-Sauerstoff-Streckfrequenz wurde bei 1109 cm−1 beobachtet. Die beobachteten Peaks im Bereich 1020–979,7 cm−1 waren auf das Vorhandensein aromatischer C- und H-Bögen zurückzuführen. Aus den chromatographischen und spektralen Analysen konnte geschlossen werden, dass das extrahierte Taxol mit dem authentischen identisch ist. Offenbar schwankte die Stoffwechselaktivität derselben Pilzart bei verschiedenen Pflanzen stark, was die einzigartige biologische Interaktion und die Freisetzung spezifischer Signale aus dem Pflanzenteil gewährleistete, um die Expression des Maschinensystems der Taxol-Biosynthese auszulösen. Interessanterweise hängen die Schwankungen im Stoffwechselsystem nicht nur von den Pflanzenteilen ab, sondern auch von der Isolat-Isolat-Interaktion. Beispielsweise betrug die Taxol-Ausbeute von A. niger-Isolaten, die in den Blättern von Jojoba leben, 43,9 µg/l, während die Ausbeute an Taxol war für das aus der Pflanzenrinde gewonnene A. niger-Isolat null.
Morphologische und molekulare Identifizierung der potenten Taxolproduzenten
Morphologische Merkmale des wirksamen Pilzisolats, das Taxol produziert, wurden anhand der makroskopischen und mikroskopischen Beschreibungsschlüssel untersucht, wie in Materialien und Methoden beschrieben, und zeigten seine morphologische Nähe zu A. favus (Abb. 2). Das Pilzisolat wurde 10 Tage lang bei 30 Grad auf PDA gezüchtet und die makroskopischen und mikroskopischen Merkmale zeigten seine Identität, wie z. B. Konidienköpfe, Art der Verzweigung, Identität der Narbe, Konidienontologie und Fruchtkörperbildung, je nach Allgemeingültigkeit morphologische Schlüssel [33] und es wurde festgestellt, dass sie mit Aspergillus favus identisch sind. Das potente Taxol produzierende Isolat A. favus wurde anhand seiner ITS-Sequenzen unter Verwendung von gDNA als Matrize weiter identifiziert. Die PCR-Amplikons (~550 bp) von A. favus wurden aufgelöst, gereinigt und sequenziert (Abb. 2). Die ITS-Sequenz von A. favus wurde in der NCBI-Datenbank nicht redundant durchsucht und zeigte eine Ähnlichkeit von 99 Prozent mit A. favus, null E.-Werte und eine Abfrageabdeckung von 95 Prozent. Somit wurde anhand der mikroskopischen und molekularen Analysen bestätigt, dass es sich bei dem Zielisolat um A. favus handelte und es bei der GenBank unter der Zugangsnummer MW485934.1 hinterlegt wurde. Außerdem wurde das Isolat beim Assiut University Mycological Center (AUMC), Ägypten, unter der Hinterlegungsnummer MW485934.1 hinterlegt Hinterlegungsnummer AUMC13892. Das aktuelle Isolat hatte eine 99-prozentige Ähnlichkeit mit den A. favus-Isolaten MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,
Abb. 1 Eine morphologische Ansicht der Jojobapflanze. B Plattenkulturen der potenten Taxol-produzierenden endophytischen Pilze; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) und A. oryzae Bd (25) auf PDA nach 8 Tagen Inkubation bei 30 Grad. Die Pilzisolate wurden auf PDB gezüchtet und unter Standardbedingungen inkubiert, und Taxol wurde extrahiert und durch TLC (C) überprüft. D HPLC-Chromatogramm von Taxol aus den wirksamen Pilzisolaten. E Taxol-Ausbeute, quantifiziert durch HPLC. F, UV-Vis-Spektralanalyse von extrahiertem Taxol aus den Pilzisolaten. G FT-IR-Analyse von extrahiertem Taxol im Vergleich zu authentischem
Abb. 2 A Makromorphologische Merkmale von A. favus, einem Jojoba-Endophyten, nach 3, 5 und 8 Tagen Wachstum auf PDA. Mikromorphologische Merkmale, Konidienkopf von A. favus bei 400-facher Vergrößerung. C PCR-Amplikon der ITS-Region von A. favus mit 500 bp, normalisiert auf 1 kb-Leiter (Kat.-Nr. SM0312). D Phylogenetische Analyse von ITS A. favus mittels Maximum-Likelihood-Methode [44]
