CAR-Neutrophile-vermittelte Abgabe von auf die Tumormikroumgebung ansprechenden Nanomedikamenten für die Glioblastom-Chemoimmuntherapie

Das Glioblastom (GBM) ist einer der aggressivsten und tödlichsten soliden Tumoren des Menschen. Während zur Behandlung verschiedener Krebsarten wirksame Therapeutika wie neue chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen und Chemotherapeutika entwickelt wurden, wurde ihre Wirksamkeit bei der GBM-Behandlung weitgehend durch die Blut-Hirn-Schranke und die Blut-Hirn-Tumor-Schranke behindert. Menschliche Neutrophile überwinden effektiv physiologische Barrieren und zeigen Effektorimmunität gegen Krankheitserreger. Die kurze Lebensdauer und die Resistenz primärer Neutrophiler gegenüber der Genombearbeitung haben ihre breite Anwendung in der Immuntherapie jedoch eingeschränkt. Hier entwickeln wir gentechnisch veränderte menschliche pluripotente Stammzellen mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Gen-Knock-in, um verschiedene Anti-GBM-CAR-Konstrukte mit T-spezifischen CD3ζ- oder Neutrophilen-spezifischen Signaldomänen zu exprimieren. CAR-Neutrophile mit der besten Antitumoraktivität werden hergestellt, um spezifisch und nichtinvasiv auf die Tumormikroumgebung reagierende Nanomedikamente gezielt und freizusetzen, um auf GBM abzuzielen, ohne dass an den Tumorstellen eine zusätzliche Entzündung ausgelöst werden muss. Diese kombinatorische Chemo-Immuntherapie zeigt überlegene und spezifische Anti-GBM-Aktivitäten, reduziert die Arzneimittelabgabe außerhalb des Ziels und verlängert die Lebensdauer weiblicher tumortragender Mäuse. Zusammengenommen ist dieses biomimetische CAR-Neutrophile-Arzneimittelabgabesystem eine sichere, wirksame und vielseitige Plattform zur Behandlung von GBM und möglicherweise anderen verheerenden Krankheiten.

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Das Glioblastom (GBM) zeichnet sich durch eine hohe Sterblichkeitsrate, kurze Lebensdauer und eine schlechte Prognose mit hoher Rezidivneigung aus1,2. Die therapeutische Wirksamkeit sowohl von chirurgischen Eingriffen als auch von Chemomedikamenten wird in erster Linie durch die Feinstruktur des Gehirns und die physiologische Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​oder Blut-Hirn-Tumor-Schranke (BBTB)3–5 beeinträchtigt. Insbesondere die Medikamentenabgabe an das Zentralnervensystem (ZNS) zur Behandlung von Hirntumoren ist eine große Herausforderung:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Die angeborene Immunität und Plastizität von Neutrophilen gegen verschiedene Krebsarten12–16, einschließlich GBM, wurden weniger erforscht als ihre Verwendung als Zellträger bei der Arzneimittelabgabe8–10. Im Blut zirkulierende Neutrophile gelangen in die hypoxische Tumormikroumgebung (TME), wo sie zu heterogenen tumorassoziierten Neutrophilen (TANs) werden, einem wesentlichen Bestandteil der immunsuppressiven TME, die zum Fortschreiten des Krebses und zur Therapieresistenz beiträgt12,17. Ähnlich wie bei Makrophagen wurden im hypoxischen TME18–21 Anti-Tumor-N1- und Pro-Tumor-N2-Phänotypen von TANs gefunden. Verschiedene therapeutische Strategien wurden entwickelt, um Neutrophile direkt anzugreifen, wobei der Schwerpunkt auf der Depletion oder Hemmung von Neutrophilen liegt12,22, was zu mehreren klinischen Studien führte (z. B. CCR5-Inhibitor Maraviroc in NCT03274804). Daher kann die direkte Anwendung unbehandelter Neutrophilen als Nanoträger ein zusätzliches Risiko für Krebspatienten darstellen, bei denen drogenhandelnde Neutrophile innerhalb von TME auf den immunsuppressiven Pro-Tumor-N2-Phänotyp umprogrammiert werden können, nachdem sie sich an Tumorstellen eingenistet haben13,23. Darüber hinaus sollten die intrinsischen Antitumoraktivitäten naiver Neutrophiler erforscht und gesteigert werden, um eine optimierte therapeutische Wirksamkeit zu erreichen, wenn sie als Arzneimittelträger in Kombination mit Chemotherapeutika eingesetzt werden.

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Die Modifikation des chimären Antigenrezeptors (CAR) hat die Antitumoraktivitäten von Immun-T-Zellen oder natürlichen Killerzellen (NK) deutlich erhöht24–27. Allerdings ist ihre Wirksamkeit bei soliden Tumoren immer noch begrenzt, was zum Teil auf ihre relativ geringe Transport- und Tumorpenetrationsfähigkeit zurückzuführen ist. Das Vorhandensein von physiologischer BBB und BBTB beeinträchtigt die Wirksamkeit dieser neuen Therapeutika gegen GBM im Gehirn zusätzlich. Wir vermuteten, dass die Kombination aus CAR-Engineering und hochbeweglichen Neutrophilen ihren Antitumor-N1-Phänotyp aufrechterhalten und eine hervorragende therapeutische Wirksamkeit bei der Behandlung von GBM erzielen könnte. Primäre Neutrophile sind kurzlebig und resistent gegen Genombearbeitung28, was ihre Anwendung in der CAR-gesteuerten Immuntherapie einschränkt. Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs), die für die Genbearbeitung besser zugänglich sind und sich massiv in Neutrophile differenzieren können, könnten eine unbegrenzte Quelle hochwertiger CAR-Neutrophilen für eine gezielte Immuntherapie unter chemisch definierten, xenofreien Bedingungen darstellen29. Neutrophile phagozytieren auch bevorzugt mikrobielle Krankheitserreger mit rauer oder langer Oberfläche, wie S. aureus und E. coli30, was beim Nanopartikeldesign bei der Neutrophilen-vermittelten Arzneimittelabgabe berücksichtigt werden sollte. Tatsächlich haben Safari et al. berichteten kürzlich über die bevorzugte Phagozytose intravenös verabreichter länglicher Partikel ohne komplizierte Oberflächenmodifikation durch zirkulierende Neutrophile30. Solch ein einfaches und bioinspiriertes Design in mit Arzneimitteln beladenen Nanopartikeln kann die Arzneimittelbeladung in Neutrophilen maximieren und eine therapeutische Wirkstoffabgabe an Zielstellen ermöglichen.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20 % der verabreichten Nanomedikamente werden durch CAR-Neutrophile an Hirntumoren abgegeben, im Vergleich zu 1 % durch freie Nanomedikamente. Zusammenfassend ist unser biomimetisches CAR-Neutrophile-Arzneimittelverabreichungssystem eine sichere, wirksame und vielseitige Plattform zur Behandlung von GBM und anderen verheerenden Krankheiten.

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Ergebnisse

Screening neutrophilenspezifischer CAR-Strukturen auf verstärkte Anti-Tumor-Aktivitäten

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90% und die Mehrheit der Zielklone sind heterozygot (ergänzende Abbildung 1a – d). Die CAR-Expression auf manipulierten hPSCs wurde durch RT-PCR und Durchflusszytometrieanalyse von CLTX-IgG4 weiter bestätigt (ergänzende Abbildung 1e – g). Wie erwartet behielten CAR-exprimierende hPSCs hohe Expressionsniveaus pluripotenter Marker bei, einschließlich OCT4, SSEA4 und SOX2 (ergänzende Abbildung 1f).

Um De-novo-CAR-Neutrophile zu produzieren, wurden CAR-exprimierende hPSCs zunächst mit stadienspezifischer Zytokinbehandlung in multipotente hämatopoetische und dann myeloische Vorläufer differenziert (Abb. 2c). Der anschließende Einsatz von G-CSF und dem Retinsäureagonisten AM580 förderte eine robuste Neutrophilenproduktion36. Ähnlich wie ihre Gegenstücke im peripheren Blut (PB) zeigten von hPSC abgeleitete CLTX-CAR-Neutrophile die typische Neutrophilenmorphologie und Oberflächenmarker CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b und CD18 (ergänzende Abbildung 2). Als nächstes bestimmten wir die Auswirkungen der CAR-Expression auf die Anti-Tumor-Zytotoxizität von hPSC-abgeleiteten Neutrophilen, indem wir sie gemeinsam mit Glioblastom (GBM) U87MG-Zellen in vitro kultivierten. Wie erwartet zeigten von hPSC abgeleitete CLTX-CAR-Neutrophile im Vergleich zu PB-Neutrophilen eine verbesserte Fähigkeit zur Tumortötung (Abb. 2d), was mit früheren Beobachtungen in CLTX-CAR-T-Zellen übereinstimmt 27 . Unter diesen verschiedenen CARs vermittelte CAR Nr. 1 überlegene tumortötende Aktivitäten bei hPSC-Neutrophilen. Bemerkenswert ist, dass CAR #4 auf der Basis der ζ-Kette am wenigsten wirksam ist, um die durch Neutrophile vermittelte Tumorabtötung auszulösen, was auf die geringere Kopie von ITAM in der ζ-Untereinheit und die geringere Expression von CARs auf der Zelloberfläche zurückzuführen sein könnte28. Neutrophile setzen zytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Tumornekrosefaktor (TNF-) frei, um Zielzellen abzutöten. Die Produktion von ROS und TNF- (Abb. 2e, f) aus verschiedenen Neutrophilen stimmte gut mit ihrer erhöhten Zytolyse überein. Wie erwartet blieb die Produktion von ROS und TNF- aus verschiedenen Neutrophilen nach der Kokultivierung mit normalen SVG-p12-Gliazellen genauso niedrig wie in der Negativkontrollgruppe (ergänzende Abbildung 3a, b). Darüber hinaus wurde eine erhöhte Antitumor-Zytotoxizität von CAR-Neutrophilen nur bei gleichzeitiger Inkubation mit GBM-Zellen, einschließlich U87MG-, primären adulten GBM43- und pädiatrischen SJ-GBM2-Zellen, beobachtet (ergänzende Abbildung 3c), was die hohe Spezifität unseres CLTX zeigt -AUTO. Bemerkenswerterweise zeigten CAR-Neutrophile eine hohe Biokompatibilität mit normalen SVG-p12-Gliazellen, hPSCs und von hPSC abgeleiteten Zellen (ergänzende Abbildung 3d), was mit einer früheren Beobachtung übereinstimmt, dass inaktivierte primäre Neutrophile gesunde Zellen nicht abtöten . Insgesamt zeigten von hPSC abgeleitete CAR-Neutrophile, insbesondere CD3ζ-tragende CAR-Neutrophile, eine erhöhte Antitumor-Zytotoxizität und produzierten in vitro mehr ROS und TNF-, was ihr Potenzial in der gezielten Immuntherapie unterstreicht.

Abb. 1|Schematische Darstellung der verbesserten Anti-Glioblastom-Wirksamkeit durch kombinatorische Immuntherapie von CAR-Neutrophilen und auf die Tumormikroumgebung ansprechenden Nanomedikamenten. Humane pluripotente Stammzellen wurden mit CARs manipuliert und in CAR-Neutrophile differenziert, die mit rauen Silica-Nanopartikeln (SiO2-NPs) beladen sind, die Hypoxie-zielendes Tirapazamin (TPZ) oder andere Medikamente enthalten, als duale Immunchemotherapie. b Systemisch verabreichte CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ-NPs greifen zunächst externe normoxische Tumorzellen an, indem sie immunologische Synapsen bilden und Tumorzellen durch Phagozytose abtöten. Nach der Apoptose könnten CAR-Neutrophile dann R-SiO2-TPZ-NPs freisetzen, die von Tumorzellen überholt werden. Anschließend reagieren Nano-Prodrugs auf die hypoxische Tumormikroumgebung und töten Tumorzellen wirksam ab. TEOS Tetraethylorthosilicat, BTES Bis[3-(triethoxysilyl) propyl] tetrasulfid, TPZ Tirapazamin, BTZ Benzotriazinyl.

CAR-Neutrophile zeigten unter immunsuppressiven Tumormikroumgebungen weiterhin überlegene Antitumoraktivitäten

Ähnlich wie bei Makrophagen wurden Anti-Tumor-N1- und Pro-Tumor-N2-Phänotypen tumorassoziierter Neutrophiler in der immunsuppressiven Tumormikroumgebung gefunden17. Pro-Tumor-N2-Neutrophile spielen eine entscheidende Rolle bei der Tumorangiogenese, Metastasierung und Immunsuppression, die therapeutische Ausrichtung auf diesen Zelltyp war jedoch eine Herausforderung.

Anstelle einer systemischen Depletionsstrategie22 haben wir hier das Potenzial der CAR-Technik zur Aufrechterhaltung des Antitumor-Phänotyps von Neutrophilen bewertet. CAR-hPSC-abgeleitete und PB-Neutrophile wurden mit Hypoxie (3 % O2) und TGF behandelt, die zur Immunsuppression der Tumormikroumgebung beitragen37,38, um ihre anhaltende tumortötende Aktivität zu bewerten. Während PB-Neutrophile unter immunsuppressiven Bedingungen eine signifikant verringerte Zytolyse gegenüber GBM-Zellen aufwiesen, zeigten CAR-Neutrophile weiterhin hohe tumortötende Aktivitäten (ergänzende Abbildung 4a). Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei der TNF-Freisetzung und ROS-Erzeugung (ergänzende Abbildung 4b, c) aus PB- oder CAR-Neutrophilen unter immunsuppressiven und normalen Bedingungen gemacht. Um den Neutrophilen-Phänotyp unter hypoxischen und TGF-Bedingungen weiter zu bestätigen, haben wir die Expression von N1--spezifischer iNOS und N2- N2--spezifischer Arginase auf den isolierten Neutrophilen mittels Durchflusszytometrie gemessen (ergänzende Abbildung). 4d–f). Im Vergleich zu Normoxie, immunsuppressiver Hypoxie und TGF verringerten sich die Expressionsniveaus von iNOS signifikant und die Arginaseniveaus stiegen bei PB-Neutrophilen an, wohingegen CAR-Neutrophile hohe Expressionsniveaus von iNOS beibehielten. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die Aktivierung des Syk-Erk-Signalwegs zur ROS-Produktion führt39–42. Daher haben wir die Syk-Erk-Aktivierung in unmodifizierten Neutrophilen und CAR-Neutrophilen nachgewiesen und verglichen. Unsere Ergebnisse deuten auf eine signifikant höhere Aktivierung des Syk-Erk-Signalwegs in CAR-Neutrophilen unter Hypoxie hin (ergänzende Abbildung 5a – d), die möglicherweise anhält die unveränderte ROS-Produktion von CAR-Neutrophilen unter Hypoxie. Insgesamt behielten CAR-Neutrophile in vitro einen Antitumor-Phänotyp und eine hohe Antitumor-Aktivität unter Bedingungen bei, die die Mikroumgebung eines Tumors nachahmen, was ihr Potenzial in der gezielten Immuntherapie unterstreicht.

Abb. 2|Screening neutrophilenspezifischer chimärer Antigenrezeptorstrukturen (CAR) mit verstärkten Neutrophilen-vermittelten Antitumoraktivitäten. ein Schema verschiedener CAR-Strukturen. b Schematische Darstellung des CAR #1-Konstrukts und der gezielten Knock-in-Strategie am AAVS1-Safe-Harbor-Locus menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs). Der vertikale Pfeil zeigt die AAVS1-Targeting-sgRNA an. Rote und blaue horizontale Pfeile zeigen Primer zum Testen der Targeting-Effizienz bzw. Homozygotie an. HDR: Homologe Rekombinationsreparatur. c Schematische Darstellung der optimierten Differenzierung von Neutrophilen aus hPSCs unter chemisch definierten Bedingungen. d Zytotoxizitätstests gegen U87MG-Glioblastomzellen wurden bei unterschiedlichen Verhältnissen von Neutrophilen zu Tumorziel unter Verwendung der angegebenen Neutrophilen durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von fünf unabhängigen biologischen Replikaten, zweiseitiger Student-t-Test, dargestellt. Es wurde die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) (e) und die ELISA-Analyse der TNF-Freisetzung (f) aus verschiedenen Neutrophilen nach Kokultivierung mit U87MG-Zellen bestimmt. n=5 biologisch unabhängige Proben. Die Daten werden als Mittelwert ± SD, zweiseitiger Student-t-Test dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Herstellung und Charakterisierung von hPSC CAR-Neutrophilen, die mit Tirapazamin (TPZ)-haltigen SiO2-Nanopartikeln beladen sind

PB-Neutrophile wurden als zelluläre Träger verwendet, um bildgebende und therapeutische Arzneimittel in Hirntumoren zu transportieren8–10, obwohl eine gezielte Infiltration von Neutrophilen einen chirurgischen Eingriff oder eine lichtinduzierte Entzündung erfordert und eine Arzneimittelabgabe außerhalb des Ziels ein Problem darstellen kann11. Um die Antitumoraktivitäten von CAR-Neutrophilen weiter zu verbessern, haben wir Silica-Nanopartikel (SiO2-NP) mit einer rauen oder glatten Oberfläche hergestellt, um Chemotherapeutika oder Strahlenmedikamente in Neutrophile zu laden. Bilder des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) zeigten, dass beide SiO2-Nanopartikel gut dispergiert waren und eine sphärische Morphologie mit einheitlicher Größe aufwiesen (Abb. 3a, ergänzende Abb. 6a). Die Analyse der Zusammensetzungsverteilung mittels Raster-TEM (STEM) mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDS) zeigte, dass das Element Schwefel (S) gleichmäßig in den gesamten rauen SiO2-Nanopartikeln (R-SiO2) verteilt war (Abb. 3b). Unter Verwendung von Adsorptions-Desorptions-Isothermen für Stickstoff (N2) und einer entsprechenden Analyse der Porengrößenverteilung wurden die Porengrößen von R- und SSiO2-NPs mit 25 nm bzw. 35 nm gemessen (Abb. 3c, ergänzende Abb. 6b). Angesichts der großen Oberfläche und der großen Porengröße könnten therapeutische Arzneimittel effektiv sowohl in R- als auch in S-SiO2-NPs geladen werden, wie am Beispiel des auf Hypoxie reagierenden Pro-Wirkstoffs Tirapazamin (TPZ) veranschaulicht (Abb. 3d, ergänzende Abb. 6c). . Nach der TPZ-Beladung wurden mittels TEM und dynamischer Lichtstreuungsanalyse keine signifikanten Änderungen in der Dispersität, Morphologie und Größe von R-SiO2-TPZ beobachtet (ergänzende Abbildung 6d, e). Die in die R-SiO2-NPs eingebauten Tetrasulfidbindungen reagieren empfindlich auf reduktive Umgebungen und können durch die große Menge an Glutathion (GSH), die in den Tumorzellen vorhanden ist, schnell abgebaut werden43. Als nächstes bestimmten wir die auf GSH reagierende Abbaubarkeit von R-SiO2-TPZ-NPs in Gegenwart von 10 mM, 1 mM und 10 μM GSH, die mit den intrazellulären Bedingungen von Krebszellen, normalen Zellen bzw. extrazellulären Umgebungen identisch waren. Bei der Behandlung mit 10 mM GSH wurde die anfängliche Kugelstruktur der R-SiO2-TPZ-NPs nach 24 Stunden stark zerstört (ergänzende Abbildung 6f, g). Die Nanopartikel waren nach 48 Stunden vollständig in kleine Trümmer zerfallen, was zu einer GSH-responsiven Freisetzung von TPZ führte (Abb. 3e). Die Trümmer von R-SiO2-NPs verursachten in vitro keine signifikante Zytotoxizität für die getesteten Zellen (ergänzende Abbildung 6h), was auf die relative Sicherheit von R-SiO2-NPs hinweist.

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Als nächstes untersuchten wir die Machbarkeit der Verwendung von SiO2-TPZ-NPs zum Laden therapeutischer Arzneimittel in CAR-Neutrophile als kombinatorische Chemoimmuntherapie, um eine gesteigerte therapeutische Wirksamkeit zu erzielen. Nach der Zentrifugation haben wir die zelluläre Aufnahme von SiO2-TPZ-NPs durch Neutrophile mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops und einer Durchflusszytometrieanalyse gemessen (Abb. 3f, g) und eine signifikantere zelluläre Aufnahme von R-SiO2-TPZ-NPs als von S-SiO2- festgestellt. TPZ-NPs durch Neutrophile. Der zelluläre Si-Gehalt in Neutrophilen wurde durch induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) mit 11,3 bzw. 19,1 ng Si/ug Protein für glatte und raue SiO2-NPs@TPZ (Abb. 3h) gemessen. Aufgrund ihrer hohen Beladungskapazität in Neutrophilen wurden R-SiO2-TPZ-NPs für nachfolgende Experimente verwendet. Anschließend versuchten wir, die physiologischen Funktionen von CAR-Neutrophilen nach der Beladung mit R-SiO2-TPZ-NPs zu testen. Es wurden keine Veränderungen der Zelllebensfähigkeit (Abb. 3i, ergänzende Abb. 6i), der Transwell-Migrationsfähigkeit (Abb. 3j), der Chemotaxis und der entsprechenden Geschwindigkeit (Abb. 3k, l) von CAR-Neutrophilen vor oder nach der Beladung mit R-SiO2 beobachtet –TPZ-NPs, die ihre hohe Biokompatibilität unter Beweis stellen. Es wurde auch eine zeitabhängige Nano-Wirkstoff-Beladungsanalyse durchgeführt und der maximale Beladungsgehalt wurde 1 Stunde nach der Zell-NP-Inkubation erreicht (ergänzende Abbildung 7a). Mehr als 95 % der CAR-Neutrophilen wurden erfolgreich mit R-SiO2-TPZ-NPs beladen (ergänzende Abbildung 7b). Das Expressionsniveau von CD11b, einem neutrophilen Oberflächenprotein, das die Adhäsions- und Migrationsfunktion bei Stimulation entzündlicher Moleküle vermittelt, wurde bei CAR-Neutrophilen mit oder ohne R-SiO2-TPZ-Beladung nicht verändert (ergänzende Abbildung 7c, d). Superoxide oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden von aktiven Neutrophilen freigesetzt, um Mikroben und Tumorzellen abzutöten44. Wie erwartet war die ROS-Erzeugung durch CAR-Neutrophile nach der Behandlung mit N-Formylmethionin-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) signifikant erhöht, und es wurden keine signifikanten Unterschiede in der ROS-Produktion durch CAR-Neutrophile vor und nach der Beladung mit R-SiO beobachtet2- TPZ (Abb. 3m). Zusammengenommen zeigten unsere Daten, dass mit R-SiO2-TPZ beladene CAR-Neutrophile die physiologischen Aktivitäten von Wildtyp-Neutrophilen aufrechterhielten und aktiv zu Entzündungsreizen wandern konnten, was ihr Potenzial in der gezielten Krebs-Chemoimmuntherapie unterstreicht.

Mit R-SiO2-TPZ-Nanopartikeln beladene CAR-Neutrophile töten wirksam Glioblastomzellen ab

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von R-SiO2-TPZ auf die tumortötende Fähigkeit von CAR-Neutrophilen. Eine enge Effektor-Ziel-Interaktion war eine Voraussetzung für die Neutrophilen-vermittelte Zytolyse. Wie erwartet bildeten CAR-Neutrophile@R-SiO2-TPZ innerhalb von 2 Stunden Immunsynapsen mit Tumorzellen und zeigten ähnliche Effektor-Target-Interaktionszahlen wie arzneimittelfreie CAR-Neutrophile (Abb. 4a, ergänzende Abb. 8). . Bemerkenswerterweise wurden keine beobachtbaren Wechselwirkungen zwischen CAR-Neutrophilen@RSiO2-TPZ und nicht krebsartigen somatischen Zellen gefunden (ergänzende Abbildung 8), was die Spezifität von CLTX-CAR gegen Hirntumoren unterstreicht. Darüber hinaus wurden R-SiO2-TPZ-NPs 12 Stunden nach der Co-Kultur von Neutrophilen in das Kulturmedium freigesetzt (Ergänzende Abbildung 9a, b) und gelangten in die verbleibenden Tumorzellen (Abb. 4a). 24 Stunden nach der gemeinsamen Inkubation von mit SiO2-TPZ-NPs beladenen CAR-Neutrophilen mit Tumorzellen enthielten bis zu 95 % der Tumorzellen R-SiO2-TPZ-NPs (Abb. 4a, ergänzende Abb. 9c), was auf einen Erfolg hinweist Transportkaskade, an der Trägerneutrophile beteiligt sind, die ihre Effektorzellfunktion ausüben und Apoptose durchlaufen, wodurch sie passiv R-SiO2-TPZ-NPs an die Zieltumorzellen freisetzen45. Wir validierten auch die hypoxische Reaktionsfunktion und Zytotoxizität von Pro-Drug-TPZ in Tumorzellen durch elektronenparamagnetische Resonanzspektroskopie (EPR)-Analyse der Radikalerzeugung aus TPZ (ergänzende Abbildung 9d) und durchflusszytometrische Analyse von TOPRO-3 am Tumor Zellen (ergänzende Abb. 9e) unter Hypoxie und Normoxie. Um die Zytolyse von R-SiO2-TPZ-NP-beladenen CAR-Neutrophilen zu bestimmen, haben wir ein In-vitro-Normoxie-Hypoxie-Tumor-Rechallenging-Modell implementiert (Abb. 4b). Vierundzwanzig Stunden nach der normoxischen Kokultur zeigten CAR-Neutrophile, die mit R-SiO2-TPZ-NPs beladen waren oder nicht, eine ähnliche Antitumor-Zytotoxizität (Abb. 4c), und beide waren höher als die von PB-Neutrophilen, die mit R beladen waren -SiO2-TPZ-NPs oder nicht und R-SiO2-TPZ-NPs allein. Die erhöhte Zytotoxizität ist hauptsächlich auf die erhöhte Tumor-Targeting-Fähigkeit von Neutrophilen nach CAR-Engineering zurückzuführen. Nach weiteren 12 und 24-stündigen hypoxischen Kokulturen mit Tumorzellen zeigten R-SiO2-TPZ NP-beladene CAR-Neutrophile im Vergleich zu anderen Gruppen eine überlegene Antitumorfähigkeit (Abb. 4d, e). Darüber hinaus zeigten mit R-SiO2-TPZ-NPs beladene CAR-Neutrophile eine hervorragende Zytolyse gegen erneut ausgesäte frische Tumorzellen (Abb. 4f), was auf die Antitumorfähigkeit von freigesetztem R-SiO2-TPZ hinweist Nanopartikel nach Neutrophilen-Apoptose.

Anschließend führten wir eine RNA-Sequenzierungsanalyse (RNA-seq) an Tumorzellen durch, um den möglichen molekularen Mechanismus aufzuklären, der einer verstärkten Antitumor-Zytolyse von Neutrophilen durch CAR-Expression und R-SiO2-TPZ-NPs zugrunde liegt. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass CAR-Neutrophile, die mit oder ohne R-SiO2-TPZ-NPs beladen waren, im Vergleich zu Kontroll- und R-SiO2-TPZ-NPs die Expression von Zytoplasma- und Membrangenen in Tumorzellen signifikant verringerten ( Ergänzende Abb. 10a, Abb. 4g), die die Phagozytose von Tumorzellen bei der Kokultur weiter unterstützen. Während alle Versuchsgruppen den zellulären oxidativen Stress in Tumorzellen erhöhten, übertrafen R-SiO2-TPZ-beladene CAR-Neutrophile andere Gruppen bei der Auslösung von Signalen für oxidativen Stress. Darüber hinaus förderten R-SiO2-TPZ-beladene CAR-Neutrophile die Apoptose signifikant und verringerten die Proliferation in Tumorzellen. Um die verstärkten Antitumoraktivitäten von R-SiO2-TPZ-beladenen CAR-Neutrophilen besser zu verstehen, verwendeten wir einen Phagozytose-Inhibitor Cytochalasin D und einen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)-Fänger N-Acetylcystein (NAC) und ein ROS-Inhibitor GSK2795039 zur Tumor-Neutrophilen-Kokultur. Die Zytolyse von Tumorzellen durch CAR-Neutrophile wurde durch 5 & mgr; Tötung. Die verbleibenden 40 % -50 % Tumorzelllyse in Gegenwart von Neutrophilen und NAC oder GSK2795039 weisen auf die Beteiligung eines ROS-unabhängigen Mechanismus an der Neutrophilen-vermittelten Tumorabtötung hin, die einer weiteren Untersuchung wert ist.

Abb. 3|Herstellung und Charakterisierung von hPSC CAR-Neutrophilen, die mit Tirapazamin (TPZ)-haltigen SiO2-Nanopartikeln beladen sind. a–e Gezeigt werden Transmissionselektronenmikroskop- (TEM) (a) und energiedispersive Spektroskopie (EDS)-Elementkartierungsbilder (b) von rauen SiO2-Nanopartikeln. c Dargestellt ist die Stickstoffadsorptions-Desorptions-Isotherme grober SiO2-Nanopartikel zusammen mit der Darstellung der Porengrößenverteilung nach Barrett-JoynerHalenda (BJH). Biologische Triplikate wurden unabhängig voneinander durchgeführt. Der TPZ-Beladungsgehalt in SiO2-Nanopartikeln (d) und die auf Glutathion (GSH)--responsive TPZ-Freisetzung (e) wurden zum angegebenen Zeitpunkt gemessen. n=3 biologisch unabhängige Proben. Einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) für (e). Fluoreszenzbilder (f) und Durchflusszytometrieanalyse (g) von Neutrophilen, die mit glattem und rauem SiO2-TPZ beladen sind. Biologische Triplikate wurden unabhängig voneinander durchgeführt. h Der zelluläre SiO2-Gehalt in hPSC-abgeleiteten CAR-Neutrophilen wurde gemessen. n=5 biologisch unabhängige Stichproben, zweiseitiger Student-t-Test. Zelluläre Lebensfähigkeit (i), n=3 biologisch unabhängige Proben, Transmigration (j), n=5 biologisch unabhängige Proben, Chemoattraktionsfähigkeiten (k, l), n=20 biologisch unabhängige Proben und Es wurde die Fähigkeit zur ROS-Erzeugung (m) von hPSC-abgeleiteten CAR-Neutrophilen gezeigt, die mit oder ohne grobes SiO2-TPZ beladen waren, n=5 biologisch unabhängige Proben, zweiseitiger Student-t-Test. PMA: Phorbolmyristatacetat. Alle Daten in dieser Abbildung werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Funktionelle Bewertung von mit Nanowirkstoffen beladenen CAR-Neutrophilen unter Verwendung biomimetischer Glioblastommodelle in vitro

Um die Aktivitäten von R-SiO2-TPZ NP-beladenen CAR-Neutrophilen weiter zu bewerten, haben wir ein Transwell-basiertes Tumormodell der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​unter Verwendung menschlicher zerebraler mikrovaskulärer Endothelzellen implementiert (Abb. 5a, ergänzende Abb . 11a). Wie erwartet zeigten R-SiO2-TPZ NP-beladene CAR-Neutrophile eine hervorragende Transmigrationsfähigkeit im gesamten In-vitro-BBB-Modell (Abb. 5b) und töteten gezielt Tumorzellen nach der Transmigration sowohl unter normoxischen als auch unter hypoxischen Bedingungen wirksam ab (Abb. 5c). , d) und die Freisetzung weiterer entzündlicher Zytokine (Abb. 5e), die möglicherweise andere Effektorzellen anlocken, um die Tumorzellen abzutöten. Darüber hinaus hatten CAR-Neutrophile keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Endothelzellen nach der Transmigration (ergänzende Abbildung 11b). R-SiO2-TPZ NP-beladene CAR-Neutrophile behielten während des zweiten Transmigrationsexperiments eine hervorragende Transmigrationsfähigkeit (Abb. 5f) und eine überlegene Antitumorfähigkeit im Vergleich zu anderen Gruppen (Abb. 5g). Anschließend wurde ein dreidimensionales (3D) Tumorsphäroidmodell verwendet, um die Tumorpenetrationskapazität von R-SiO2-TPZ NP-beladenen CAR-Neutrophilen zu bewerten (Abb. 5h). CAR-Neutrophile wanderten allmählich in Richtung der Mitte des Tumorsphäroids und verteilten sich nach 8-stündiger Inkubation gleichmäßig im Sphäroid (Abb. 5i). Es wurde ein hoher Grad an Co-Lokalisierung zwischen CAR-Neutrophilen und R-SiO2-TPZ-NPs beobachtet (ergänzende Abbildung 12a – c), was zeigt, dass R-SiO2-TPZ-NPs stabil im CAR eingekapselt waren -Neutrophile während der Tumorinfiltration vor ihrer Zytolyse. Ohne Neutrophilen-vermittelte Abgabe wurden R-SiO2-TPZ-NPs nur auf der Außenschicht von Tumorsphäroiden gefunden. Im Vergleich zu R-SiO2-TPZ-NPs und CAR-Neutrophilen zeigten R-SiO2-TPZ-NP-beladene CAR-Neutrophile im 3D-Tumormodell eine überlegene Antitumorzytolyse (Abb. 5j). CAR-Neutrophile@R-SiO2-NPs können auch verwendet werden, um andere Medikamente, einschließlich klinisches Temozolomid (TMZ) und JNJ- 64619187, in 3D-Tumormodelle zu transportieren und GBM-Zellen effizient abzutöten (ergänzende Abbildung 12d – f). Zusammengenommen zeigten die kombinatorischen CAR-Neutrophilen und Nanomedikamente hervorragende Antitumoraktivitäten in biomimetischen Tumormikroumgebungsbedingungen, die in vitro Bedingungen nachahmen, was das therapeutische Potenzial der kombinatorischen Chemoimmuntherapie auf Neutrophilenbasis unterstreicht.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

In-vivo-Verteilung von durch CAR-Neutrophilen abgegebenen R-SiO2-TPZ-Nanopartikeln

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20 % der verabreichten Nanomedikamente wurden durch CAR-Neutrophile an Hirntumoren abgegeben, im Vergleich zu 1 % durch freie Nanomedikamente, was mit früheren Berichten übereinstimmt6. Die gezielte Abgabe von R-SiO2-TPZ-NPs an das Wirtshirn über die BHS durch CAR-Neutrophile wurde auch durch histologische Analyse bestätigt (Abb. 6d). Im Gegenteil, R-SiO2-TPZ-NPs allein sammelten sich hauptsächlich in Leber und Milz an. Insgesamt zeigten unsere Daten eine verbesserte gezielte Abgabe von R-SiO2-TPZ-NPs durch CAR-Neutrophile, ohne dass eine zusätzliche Entzündung an der Tumorstelle induziert werden muss, was die Machbarkeit und Sicherheit einer neutrophilenbasierten Chemoimmuntherapie bei der Krebsbehandlung unterstreicht.

Die kombinatorische Chemoimmuntherapie von CAR-Neutrophilen und R-SiO2-TPZ-Nanopartikeln zeigte in vivo hervorragende Anti-Glioblastom-Aktivitäten

Um die therapeutische Wirksamkeit von R-SiO2-TPZ NP-beladenen CAR-Neutrophilen zu bestimmen, wurde ein In-situ-Xenotransplantatmodell des Glioblastoms in den NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG)-Mäusen unter Verwendung von Luciferase-exprimierenden U87MG-Zellen etabliert. Tumortragenden Mäusen wurden wöchentlich 5 × 10 Neutrophile intravenös verabreicht (Abb. 7a), und die Tumorlast in den Wirten wurde gemessen und quantifiziert (Abb. 7b, c). Im Vergleich zu mit PBS oder PB-Neutrophilen behandelten Mäusen verlangsamte die Behandlung mit CAR-Neutrophilen und CAR-Neutrophil@R-SiO2-TPZ-NPs das Tumorwachstum wirksam. CAR-Neutrophile@R-SiO2-TPZ-NPs zeigten eine viel höhere Antitumor-Zytotoxizität als alle anderen Versuchsgruppen. Im Gegenteil, PB-Neutrophile förderten das Tumorwachstum im Gehirn erheblich, was zum Tod tumortragender Mäuse bereits am 23. Tag führte (Abb. 7d), was darauf hindeutet, dass nicht manipulierte Neutrophile zusätzliche Risiken bergen könnten. Als nächstes haben wir die Freisetzung menschlicher Zytokine im Plasma verschiedener experimenteller Mausgruppen gemessen (Abb. 7e). Alle Nicht-PBS-Versuchsgruppen produzierten vom 5. bis zum 26. Tag nachweisbares TNF und IL-6 im Plasma, was auf die Aktivierung menschlicher Neutrophilen bei Tumorstimulation schließen lässt. Im Einklang mit der beobachteten höheren Tumorwachstumsrate setzten unmodifizierte Neutrophile nach und nach mehr IL-6 und TNF frei, was bei Patienten zu einem Zytokinfreisetzungssyndrom führen kann und eingehendere Sicherheitsstudien mit IL-6-Blockern erfordert46,47 . Bemerkenswerterweise zeigten CAR-Neutrophile@RSiO2-TPZ-NPs zu späteren Zeitpunkten (Tag 19 und Tag 26) eine verringerte Fähigkeit zur Zytokinproduktion, was auf ein möglicherweise geringes Risiko eines Zytokinfreisetzungssyndroms bei Patienten hindeutet, die mit einer auf CAR-Neutrophilen basierenden Chemoimmuntherapie behandelt wurden. Die Biokompatibilität von kombinatorischen CAR-Neutrophilen und R-SiO2-TPZ-NPs wurde durch wöchentliche Messung des Körpergewichts und Überwachung pathologischer Veränderungen in wichtigen Organen von Mäusen bewertet. Es wurde kein Unterschied im Körpergewicht zwischen mit CAR-Neutrophilen@R-SiO2-TPZ-NP behandelten Mäusen und anderen Versuchsgruppen beobachtet (Abb. 7f), was auf eine minimale systemische Toxizität und eine ausgezeichnete Biokompatibilität der darin befindlichen CAR-Neutrophilen@R-SiO2-TPZ-NPs hinweist 28 Tage Behandlung. Die histologische Analyse wichtiger Organe, die am 30. Tag von Mäusen geschnitten wurden, zeigte, dass mit CAR-Neutrophile@R-SiO2–TPZ NP behandelte Mäuse keine erkennbaren Anomalien oder Organschäden in Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere verursachten (ergänzende Abb. 13), was die Sicherheit kombinatorischer CAR-Neutrophilen und R-SiO2-TPZ-NPs weiter bestätigt.

Abb. 4|Mit R-SiO2-TPZ-Nanopartikeln beladene CAR-Neutrophile töten wirksam Glioblastomzellen ab. Es wurden repräsentative Bilder von immunologischen Synapsen gezeigt, die durch die Akkumulation von polarisiertem F-Actin an der Schnittstelle zwischen CAR-Neutrophilen und Tumorzellen nach 6, 12 und 24 Stunden angezeigt wurden. R-SiO2-TPZ-Nanopartikel, die bei der Phagozytose von Tumorzellen von CAR-Neutrophilen freigesetzt wurden, wurden von Tumorzellen aufgenommen. Dreifachversuche wurden unabhängig voneinander durchgeführt. b Schematische Darstellung des Neutrophilen-vermittelten Antitumor-Zytotoxizitätstests. Die Zytotoxizität gegen U87MG-Glioblastomzellen wurde bei verschiedenen Verhältnissen von Neutrophilen zu Tumorziel unter Verwendung der angegebenen Neutrophilen nach 24 Stunden (c), 36 Stunden (d), 48 Stunden (e) und 72 Stunden (f) durchgeführt. n=3 biologisch unabhängige Proben. Die Daten werden als Mittelwert ± SD, einfache Varianzanalyse (ANOVA) dargestellt. g Massen-RNA-Sequenzierungsanalyse wurde an U87MG-Zellen unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt. Die Heatmap zeigt die Expressionsniveaus ausgewählter Zytoplasma-, Membran-, oxidativer Stress-, Apoptose- und proliferationsbezogener Gene in den angegebenen Glioblastomzellen. n=2 biologisch unabhängige Proben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Abb. 5|Funktionelle Bewertung von CAR-Neutrophilen, die mit R-SiO2-TPZ-Nanopartikeln beladen sind, unter Verwendung biomimetischer Glioblastom-Modelle (GBM) in vitro. ein Schema unseres In-vitro-Tumormodells von GBM mit Blut-Hirn-Schranke (BBB), das aus Endothelzellen auf der Zelleinsatzmembran und Tumorzellen am Boden desselben Transwells besteht. b Dargestellt ist die Transwell-Migrationsanalyse von Neutrophilen nach 12 Stunden. Die Anti-GBM-Zytotoxizität der angegebenen Neutrophilen nach 24 Stunden (c) und 36 Stunden (d) wurde gemessen und quantifiziert. Es wurde eine ELISA-Analyse von IL-6 und TNF durchgeführt, die nach 36 Stunden von den angegebenen Neutrophilen freigesetzt wurden. f Dargestellt ist die zweite Migration verschiedener Neutrophilen nach 48 Stunden. g Die Anti-GBM-Zytotoxizität der angegebenen Neutrophilen nach 60 Stunden wurde gemessen und quantifiziert. h–j Das Schema eines mit Neutrophilen infiltrierten dreidimensionalen (3D) Tumormodells in vitro wurde in (h) gezeigt. Es wurden repräsentative Fluoreszenzbilder von infiltrierten Neutrophilen in den 3D-Tumormodellen gezeigt. DAPI wurde zur Färbung des Zellkerns und CD45 zur Färbung von Neutrophilen verwendet. Maßstabsbalken, 200 μm. Biologische Triplikate wurden unabhängig voneinander durchgeführt. j Die entsprechende tumortötende Fähigkeit der angegebenen Neutrophilen wurde mithilfe eines Zytotoxizitätskits gemessen und quantifiziert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von fünf unabhängigen biologischen Replikaten dargestellt, einseitige Varianzanalyse (ANOVA). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Während CAR-Neutrophile@R-SiO2-TPZ-NPs das Tumorwachstum bei Xenotransplantatmäusen signifikant verlangsamten, ist der Unterschied im Überleben der Tiere in Versuchsgruppen von CAR-Neutrophilen, SiO2-TPZ-NPs und CAR-Neutrophil@R-SiO2-TPZ-NPs unbedeutend (p > 0.05), was möglicherweise auf den Tod kurzlebiger Neutrophiler während der Zellvorbereitung und -injektion zurückzuführen ist. Als nächstes konzentrierten wir uns auf diese drei Gruppen und stellten fest, ob eine kürzere Zellvorbereitungszeit und erhöhte Dosierungen von CAR-Neutrophilen und Nano-Medikamenten einen Unterschied im Überleben der Tiere bewirken würden (Abb. 7g). Bei sechsmaliger systemischer Verabreichung übertrafen CAR-Neutrophile@R-SiO2–TPZ-NPs die beiden anderen Gruppen bei der Verlängerung der Lebensdauer tumortragender Mäuse (Abb. 7h), wohingegen der Unterschied im Überleben der Tiere in Gruppen von CAR-Neutrophilen und SiO2– TPZ-NPs blieben unbedeutend. Während zwischen diesen beiden unabhängigen Tierversuchen eine ähnliche Überlebenskurve der R-SiO2- TPZ-Gruppe beobachtet wurde, verkürzte sich die Zeit für die Zellisolierung und Vorbereitung für die Injektion von insgesamt ca. 4 Stunden auf 1 Stunde während der ersten 4 Neutrophilen Dosen führten zu einer verbesserten Überlebensrate der Tiere in CAR-Neutrophilengruppen vor dem 32. Tag. Insgesamt zeigten unsere Daten die Bedeutung der Neutrophilenpräparation und Dosierungsoptimierung bei zukünftigen klinischen Anwendungen von Neutrophilentherapeutika.

Diskussion

Maus-Neutrophile haben sich als leistungsstarke Träger für die effiziente Abgabe von Nanomedikamenten an entzündete postoperative Hirntumoren erwiesen8,9. Dennoch sind die Machbarkeit und Sicherheit der Verwendung menschlicher Neutrophilen bei der Arzneimittelverabreichung noch unklar. Die große Menge an Maus-Neutrophilen (zehnmal höher als die Gesamtzahl der zirkulierenden Neutrophilen bei Mäusen11), die in diesen Studien zur Erzielung eines therapeutischen Nutzens verwendet wurde, könnte ihre klinische Umsetzung weiter behindern, da die Extraktion einer großen Anzahl von Neutrophilen aus Krebspatienten zu Neutropenie und Pose führen kann andere Risiken. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, haben wir die Kraft sich selbst erneuernder hPSCs genutzt, um unbegrenzte menschliche De-novo-Neutrophile zu erhalten29. Wir haben mit CAR-Engineering29 ein leistungsstarkes, bioinspiriertes Neutrophilen-vermitteltes Medikamentenverabreichungssystem entwickelt und gentechnisch veränderte menschliche CAR-Neutrophile als Nanoträger mit bemerkenswerten Antitumoraktivitäten verwendet. Raue SiO2-NPs funktionieren in CAR-Neutrophilenträgern besser als glatte SiO2-NPs, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt, dass Neutrophile bevorzugt raue mikrobielle Krankheitserreger phagozytieren30. Es wurde berichtet, dass Neutrophile die Proliferation und das Fortschreiten von Gliomzellen fördern48. Wir haben in unserer Tierstudie eine ähnliche protumorfördernde Wirkung von unmodifizierten Neutrophilen beobachtet, was die Notwendigkeit von CCAR-Engineering oder anderen Modifikationen bei Neutrophilen unterstreicht, um ihre Sicherheit bei der Arzneimittelabgabe und anderen therapeutischen Anwendungen zu gewährleisten. Bemerkenswert ist, dass unsere CAR-Neutrophile-vermittelte Arzneimittelabgabe ausschließlich von der nativen Chemo-Lockstoff-Fähigkeit von GBM abhängt, nicht jedoch von den verstärkten postoperativen Entzündungssignalen, was auf die hohe Spezifität und das therapeutische Potenzial unseres Arzneimittelabgabesystems bei der Ausrottung tief infiltrierter Gliome schließen lässt die nicht operativ entfernt werden kann. Da chirurgische Resektion und adjuvante Chemotherapie/Strahlentherapie die primären klinischen Interventionen für GBM12 sind, kann eine Kombinationsbehandlung mit CAR-Neutrophilen-Nanoträgern und Operation/Strahlentherapie eine optimale therapeutische Wirksamkeit erzielen und ist eine weitere Untersuchung wert. T- und NK-Zell-spezifische CAR-Konstrukte werden häufig verwendet, um die Anti-Tumor-Aktivitäten von T- und NK-Zellen zu verstärken. Neutrophile-spezifische CARs, die die Anti-Tumor-Funktionen von Neutrophilen verbessern, wurden jedoch nicht beschrieben. Es wurde zuvor berichtet, dass chimäre CD4ζ- und CD4-Immunrezeptoren die Zytolyse von Neutrophilen gegen HIVenv-transfizierte Zellen in vitro verstärken. Dennoch betrug die Lyseeffizienz nur ~10 % bei einem Verhältnis von Effektor zu Ziel (E:T) von 10:128. Fc RIIA (CD32a) ist ein einkettiger Transmembranrezeptor mit geringer Affinität für monomeres IgG, der in Neutrophilen stark exprimiert wird (30,000 bis 60,000 Moleküle/Zelle31), und seine Ligation induziert Fc - abhängige Funktionen in Neutrophilen, wie die Freisetzung von Granulatinhalten, Ca2+-Mobilisierung, Antitumor-Zytotoxizität und Phagozytose49. Angesichts der herausragenden Rolle von CD32a bei der Aktivierung und Funktion von Neutrophilen haben wir CD32a-basierte CAR-Konstrukte entworfen und getestet. Unsere Ergebnisse zeigten jedoch, dass CD3ζ eine deutlich bessere Zytolyse vermittelt als CD32a, wenn es in hPSC-abgeleiteten Neutrophilen exprimiert wird, was teilweise auf die höheren Kopien von ITAMs in CD3ζ als CD32a zurückzuführen sein könnte: drei bzw. eine Kopie, und höhere Expressionsniveaus von ζ als auf der Zelloberfläche von Neutrophilen28. Wie CD32a ist Fc RIII (CD16b) ein weiterer Rezeptor mit niedriger Affinität für monomeres IgG und wird auf Neutrophilen in viel höherem Maße exprimiert als CD32a31. Während die Vernetzung von CD16b nur die Ca2+-Mobilisierung und Degranulation induziert, nicht jedoch Phagozytose und Zytolyse in Neutrophilen28,50, wird es in zukünftigen Studien dennoch von Interesse sein, einen systematischen Vergleich der Fähigkeiten von CD3ζ- und CD16b durchzuführen -CARs bei der Auslösung und Verbesserung der Antitumorfunktionen von Neutrophilen.

Abb. 6|In-vivo-Verteilung von durch CAR-Neutrophilen abgegebenen R-SiO2-TPZ-Nanopartikeln (NPs). ein Schema von intravenös verabreichten Cy5-markierten CAR-Neutrophil@R-SiO2-NPs und R-SiO2-NPs für eine In-vivo-Zellverfolgungsstudie. 5 × 105 Luciferase (Luci)-exprimierende U87MG-Zellen wurden stereotaktisch in das rechte Vorderhirn von NRG-Mäusen implantiert. Nach 4 Tagen wurden die Mäuse intravenös mit PBS, 5 × 106 Cy5-markierten CAR-Neutrophil@R-SiO2-NPs und R-SiO2-NPs behandelt. b Die zeitabhängige Bioverteilung von Cy5+-Neutrophilen im gesamten Körper, Gehirn und anderen Organen wurde durch Fluoreszenzbildgebung zu den angegebenen Stunden bestimmt und quantifiziert. c Die Bioverteilung von CAR-Neutrophil@R-SiO2-NPs und R-SiO2-NPs in Mäusen 24 Stunden nach der Injektion wurde durch induktiv gekoppelte plasmaoptische Emissionsspektrometrie (ICP-OES) basierend auf dem Si-Element analysiert und die Daten wurden als Prozentsatz ausgedrückt der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (%ID/g). n=5 biologisch unabhängige Proben. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d Es wurden repräsentative Fluoreszenzbilder von CD45 und SiO2 in den angegebenen Glioblastom-Xenotransplantaten gezeigt, die aus tumortragenden Mäusen isoliert wurden. Maßstabsbalken, 100 μm. Biologische Triplikate wurden unabhängig voneinander durchgeführt.

Abb. 7|In vivo-Antitumoraktivitäten von kombinatorischen CAR-Neutrophilen und R-SiO2-TPZ-Nanopartikeln (NPs) wurden durch intravenöse Injektion bewertet. ein Schema von intravenös verabreichten PBS-, PB-Neutrophilen-, CAR-Neutrophilen- und CAR-Neutrophilen@R-SiO2-TPZ-NPs für eine In-vivo-Tumortötungsstudie. 5 × 105 Luciferase (Luci)-exprimierende U87MG-Zellen wurden stereotaktisch in das rechte Vorderhirn von NRG-Mäusen implantiert. Nach 4 Tagen wurden die Mäuse einen Monat lang wöchentlich intravenös mit den angegebenen Neutrophilen behandelt. Die zeitabhängige Tumorlast wurde an den angegebenen Tagen durch Biolumineszenzbildgebung (BLI) bestimmt (b) und quantifiziert (c). Die Daten sind Mittelwerte ± SD für Mäuse in (b) (n=5), einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA). Es wurde eine d-Kaplan-Meier-Kurve gezeigt, die das Überleben der angegebenen Versuchsgruppen (n=5) zeigt. An den angegebenen Tagen wurden der freigesetzte humane Tumornekrosefaktor (TNF) und IL-6 im peripheren Blut (e) und das Körpergewicht (f) verschiedener Mäusegruppen gemessen. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SD, n=5 biologisch unabhängige Proben. g, h Die Antitumoraktivität erhöhter Dosierungsfrequenzen von CAR-Neutrophilen und RSiO2-TPZ-NPs wurde bewertet. g Schematische Darstellung intravenös verabreichter CAR-Neutrophilen, R-SiO2-TPZ-NPs und CAR-Neutrophil@ R-SiO2-TPZ-NPs für eine In-vivo-Studie zur Tumorabtötung. Die h-Kaplan-Meier-Kurve zeigt das Überleben der angegebenen Versuchsgruppen (n=5). Kaplan-Meier-Kurven wurden mit dem Log-Rank-Test analysiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir haben hier auch eine modulare und vielseitige hPSC-Plattform zur Arzneimittelabgabe an Neutrophile vorgestellt, die in Zukunft möglicherweise überarbeitet und abgestimmt wird, um andere auf Neutrophilen basierende Bemühungen zur Behandlung anderer menschlicher Krankheiten zu unterstützen. Erstens ist CAR-Engineering bei hPSCs leichter zugänglich als bei primären Immun-T-Zellen und Neutrophilen. Es ist lediglich eine einmalige Bearbeitung des Genoms erforderlich, um eine stabile und homogene Expression verschiedener CARs29 zu erreichen. Zusätzlich zu den CLTX-CARs haben wir auch stabile hPSC-Linien konstruiert, die ein universelles Anti-Fluorescein (FITC)51 oder ein Anti-PD-L1-CAR52 exprimieren. Beide könnten genutzt werden, um universelle, auf solide Tumore abzielende Nanoträger-CAR-Neutrophile zu erhalten. Andere genetische Veränderungen, wie z. B. Fibrose, die auf Anti-FAP-CARs53 abzielt, können ebenfalls durchgeführt werden, um neutrophile Nanoträger zur Behandlung tödlicher degenerativer Krankheiten, einschließlich Hirntrauma und Herzfibrose, zu steuern. Darüber hinaus könnten CAR-exprimierende hPSCs auch leicht angepasst werden, um CAR-T- oder CAR-NK-Zellen29 zu produzieren, und Kombinationen dieser Immuntherapien mit CAR-Neutrophilen-Nanoträgern könnten optimale therapeutische Antitumorvorteile erzielen. Schließlich ist unser bioinspiriertes Tumor-Glutathion (GSH)-responsives Nanodrug-System eine modulare und vielseitige Plattform, um vielversprechende chemotherapeutische oder radioaktive Medikamente in CAR-Neutrophile für eine gezielte Medikamentenabgabe zu laden, wie am Beispiel von Clinical TMZ, JNJ64619187 und Pro-Drug TPZ gezeigt wird. Zukünftige Studien zum Testen anderer Nanopartikel könnten zu einer optimierten Wirkstoffbeladung in Neutrophilen führen und eine maximale therapeutische Wirksamkeit in vivo erzielen.

Während wir das therapeutische Konzept der Verwendung von CAR-Neutrophilen zur gezielten und effizienten Verabreichung von Chemo-Medikamenten an Hirntumoren über die gesamte Blut-Hirn-Schranke demonstriert haben, gibt es in dieser Studie einige Einschränkungen. Erstens reicht eine 4-tägige Inokulation von Tumorzellen möglicherweise nicht aus, um Tumore zu etablieren, die das klinische Szenario für therapeutische Untersuchungen nachahmen, und zukünftige Arbeiten mit unterschiedlichen Tumorinokulationsperioden sind erforderlich, um die verschiedenen Stadien der Glioblastomentwicklung und des therapeutischen Ansprechens in verschiedenen Phasen zusammenzufassen Patienten54,55. Zweitens fehlt den hier verwendeten immundefizienten Mäusen die adaptive Immunität, und es werden andere präklinische Modelle mit einem intakten Immunsystem, wie z. B. Haushunde mit spontanem Gliom56, benötigt, um die Sicherheit und Wirksamkeit von in vitro produzierten CAR-Neutrophilen besser beurteilen zu können. Insbesondere ist trotz der kurzen Lebensdauer eine Profilierung der Off-Target-Toxizität von CAR-Neutrophilen mit oder ohne Beladung mit Nano-Medikamenten in infundierten Tieren erforderlich, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms, der Neurotoxizität und der On-Target-Off-Tumor-Toxizitäten, die in CAR-T-Zellen57 beobachtet werden von Neutrophilen. Während praktikable Ansätze, wie die Entwicklung hypoimmunogener Universalspender-hPSCs58–61 und die Banking von humanen Leukozytenantigen (HLA)-homozygoten hPSC-Bibliotheken62, leicht verfügbar sind, um das potenzielle Risiko einer Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD) zu vermeiden, sind präklinische Tiermodelle mit einem Um das Translationspotenzial unserer Neutrophilentherapeutika beurteilen zu können, bedarf es noch eines intakten Immunsystems. Schließlich wurde eine begrenzte Antitumor-Zytotoxizität und eine Verlängerung der Tierlebensdauer von CAR-Neutrophilen-Nanopharmaka-Therapeutika beobachtet. Daher ist die zukünftige Erforschung wirksamerer Chemotherapeutika oder Radiosensibilisatoren sowie Kombinationstherapien mit klassischer CAR-T und chirurgischer Resektion von entscheidender Bedeutung, um eine maximale Antitumorwirksamkeit von CAR-Neutrophilen-Therapeutika zu erreichen. Beispielsweise hat eine kürzlich durchgeführte Studie zum mechanismusbasierten Design zu einem wirksameren Medikament KL-50 geführt, das erworbene Resistenzen überwindet, wie sie bei klinischen TMZ-Medikamenten beobachtet werden63 und daher möglicherweise in unsere modulare CAR-Neutrophile-Nanodrug-Plattform integriert werden kann bessere therapeutische Wirksamkeit. Eine Verlängerung der Haltbarkeitsdauer von Neutrophilen auf 5 Tage durch CLON-G-Behandlung (Caspasen-lysosomale Membranpermeabilisierung-Oxidationsmittel-Nekroptose-Hemmung plus Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor64) und/oder die Verwendung eines längerfristigen kontrollierten Arzneimittelfreisetzungssystems bei CAR-Neutrophilen kann ebenfalls möglich sein eine nachhaltige In-vivo-Antitumorwirksamkeit nach Neutrophilen-Apoptose erreichen. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse deutlich, dass mit R-SiO2–TPZ beladene CAR-Neutrophile den Antitumor-N1-Phänotyp aufrechterhalten und Tumorzellen unter verschiedenen tumornischenähnlichen Bedingungen in vitro effizient abtöten können. Funktionelle CAR-Neutrophile könnten auch in großen Mengen aus manipulierten hPSCs hergestellt werden, um Nanomedikamente, die auf die Mikroumgebung des Tumors reagieren, präzise an GBM in vivo abzugeben, was zu einer kombinatorischen Chemoimmuntherapie mit robusten und spezifischen Anti-GBM-Aktivitäten und minimaler Arzneimittelabgabe außerhalb des Ziels führen würde verlängerte Lebensdauer bei tumortragenden Mäusen.

Verweise

1. Yang F. et al. Synergistische Immuntherapie des Glioblastoms durch duales Targeting von IL-6 und CD40. Nat. Komm. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Aktueller Stand der Immuntherapie bei Glioblastomen. Nat. Rev. Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Die intratumorale IL-12-Verabreichung ermöglicht die CAR-T-Zell-Immuntherapie in einem präklinischen Glioblastommodell. Nat. Komm. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophile als neue therapeutische Ziele. Nat. Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrophile als neues therapeutisches Ziel und Werkzeug für die Krebstherapie. Lebenswissenschaft. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Metaanalyse der Nanopartikelabgabe an Tumore unter Verwendung eines physiologisch basierten pharmakokinetischen Modellierungs- und Simulationsansatzes. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. Analyse der Nanopartikelabgabe an Tumore. Nat. Rev. Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. Neutrophile-vermittelte Verabreichung von Krebsmedikamenten zur Unterdrückung des postoperativen Wiederauftretens eines malignen Glioms. Nat. Nanotechnologie. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. MR-Bildgebungsverfolgung von entzündungsaktivierbaren manipulierten Neutrophilen zur gezielten Therapie chirurgisch behandelter Gliome. Nat. Komm. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Krebstherapie: Neutrophilenverkehr in Krebs-Nanomedikamenten. Nat. Nanotechnologie. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Rollen von Neutrophilen bei Gliomen und Hirnmetastasen. Vorderseite. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. Polarisation des Tumor-assoziierten Neutrophilen-Phänotyps durch TGF-beta: „N1“ versus „N2“ TAN. Krebszelle (2009).

14. Blaisdell, A. et al. Neutrophile wirken der Uterusepithelkarzinogenese durch das Debridement hypoxischer Tumorzellen entgegen. Krebszelle 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. Die Linderung der Tumorhypoxie setzt das tumorizide Potenzial von Neutrophilen frei. J. Clin. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. Menschliche polymorphkernige Neutrophile erkennen und töten gezielt Krebszellen. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. Neutrophile Diversität und Plastizität in der Tumorprogression und -therapie. Nat. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Forschungsfortschritte zu Gliomstammzellen in der Immunmikroumgebung von Gliomen. Vorderseite. Pharmakol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Immune microenvironment of gliomas. Labor. Investig. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. Plastizität, Heterogenität und Resistenz von Tumorzellen in entscheidenden Nischen der Mikroumgebung bei Gliomen. Nat. Komm. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Neue Immuntherapien für maligne Gliome: Von der Immunogenomik zur Zelltherapie. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. Durch Neutrophile induzierte Ferroptose fördert die Tumornekrose beim Fortschreiten des Glioblastoms. Nat. Komm. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Phänotypische Diversität und Plastizität in zirkulierenden Neutrophilen-Subpopulationen bei Krebs. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Menschliche iPSC-abgeleitete natürliche Killerzellen, die mit chimären Antigenrezeptoren entwickelt wurden, verstärken die Antitumoraktivität. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. Hochaffine mutierte Interleukin-13-zielgerichtete CAR-T-Zellen verbessern die Abgabe anklickbarer, biologisch abbaubarer fluoreszierender Nanopartikel an Glioblastome. Bioakt. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Ein neuartiges Ligandenabgabesystem zur nicht-invasiven Visualisierung und therapeutischen Nutzung des tumorbeschränkten Biomarkers IL13R 2. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Chlorotoxin-gesteuerte CAR-T-Zellen zur spezifischen und effektiven Bekämpfung von Glioblastomen. Wissenschaft. Übers. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Antigenspezifische Zytolyse durch Neutrophile und NK-Zellen, die chimäre Immunrezeptoren exprimieren, die Zeta- oder Gamma-Signaldomänen tragen. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Entwicklung chimärer Antigenrezeptor-Neutrophilen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen für eine gezielte Krebsimmuntherapie. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. Neutrophile phagozytieren vorzugsweise längliche Partikel, die eine selektive Wirkung bei akuten entzündlichen Erkrankungen haben. Wissenschaft. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Expression, Rolle und Regulierung neutrophiler Fc-Rezeptoren. Vorderseite. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Bedeutung der fc-Rezeptor-Ketten-ITAM-Tyrosine bei der Neutrophilenaktivierung und in vivo-Autoimmunarthritis. Vorderseite. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Rolle der neutrophilen polymorphen Formen Fc RIIa (CD32) und Fc RIIIb (CD16) bei der Phagozytose menschlicher IgG1-- und IgG3--opsonisierten Bakterien und Erythrozyten. Transfus. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Menschliche neutrophile Fc-Rezeptoren initiieren und spielen spezielle, nichtredundante Rollen bei Antikörper-vermittelten Entzündungskrankheiten. Immunität. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. Chemisch definierte Erzeugung von menschlichem hämogenem Endothel und definitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen. Biomaterialien 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Effektive und schnelle Erzeugung funktioneller Neutrophiler aus induzierten pluripotenten Stammzellen unter Verwendung von ETV2-modifizierter mRNA. Stem Cell Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. Die Rolle der Hypoxie in der Tumormikroumgebung und der Entwicklung von Krebsstammzellen: ein neuartiger Ansatz zur Entwicklung einer Behandlung. Krebszelle Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. Einfluss der hypoxischen Tumormikroumgebung und der Tumorzellplastizität auf die Expression von Immun-Checkpoints. Krebs Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Rolle der Protein-Tyrosinkinase Syk bei der Signalübertragung von oxidativem Stress in B-Zellen. Antioxidantien Redox-Signal. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. ROS und ROS-vermittelte zelluläre Signalübertragung. Oxidat. Med. Zelle. Langlebigkeit. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. Ein Ras-Aktivierungsweg, der von der Syk-Phosphorylierung der Proteinkinase C abhängt. Proc. Natl. Acad. Wissenschaft. USA. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ Die SYK-Tyrosinkinase: Ein entscheidender Akteur bei verschiedenen biologischen Funktionen. Nat. Rev. Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Ein auf die Tumormikroumgebung reagierendes Nanokomposit für die Therapie mit Schwefelwasserstoffgas und trimodal verstärkter Enzymdynamik. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophile zum ROScue: Mechanismen der NADPH-Oxidase-Aktivierung und Bakterienresistenz. Vorderseite. Zelle. Infizieren. Mikrobiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. Neutrophile ermöglichen die lokale und nicht-invasive Liposomenabgabe an entzündete Skelettmuskeln und ischämische Herzen. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. Zusammenfassung der FDA-Zulassung: Tocilizumab zur Behandlung des durch chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen induzierten schweren oder lebensbedrohlichen Zytokinfreisetzungssyndroms. Onkologe 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Zytokinfreisetzungssyndrom und damit verbundene Neurotoxizität bei der Krebsimmuntherapie. Nat. Rev. Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. Neutrophile fördern den Phänotyp des malignen Glioms durch S100A4. Klin. Krebs Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. Zellspezifische, aktivierungsabhängige Regulierung der Neutrophilen-CD32A-Ligandenbindungsfunktion. Blut https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Zytotoxizität, vermittelt durch menschliche Fc-Rezeptoren für IgG. Immunol. Heute. https://doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. Regulierung der CAR-T-Zell-vermittelten Zytokinfreisetzungssyndrom-ähnlichen Toxizität unter Verwendung von Adaptern mit niedrigem Molekulargewicht. Nat. Komm. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Ein neuartiger chimärer Antigenrezeptor, der eine JAK-STAT-Signaldomäne enthält, vermittelt überlegene Antitumorwirkungen. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. Bekämpfung von Herzfibrose mit manipulierten T-Zellen. Natur. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-spezifische NK-Zellen zur gezielten Therapie von Glioblastomen. J. Natl. Krebsinst. https://doi.org/10.1093/jnci/djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. CAR-T-Zellen gegen Hirntumoren: Erkenntnisse und der Weg in die Zukunft. Immunol. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Sicherheits- und vorläufige Überlebensdaten nach intrakranieller Verabreichung von M032, einem gentechnisch veränderten onkolytischen HSV-1, der IL-12 exprimiert, bei Hunden mit sporadischen Gliomen. Neurochirurg. Fokus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Jüngste Fortschritte und Entdeckungen in den Mechanismen und Funktionen von CAR-T-Zellen. Nat. Rev. Cancer 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Erzeugung hypoimmunogener T-Zellen aus gentechnisch veränderten allogenen humanen induzierten pluripotenten Stammzellen. Nat. Biomed. Ing. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Hypoimmunogene Derivate induzierter pluripotenter Stammzellen entgehen der Immunabstoßung bei vollständig immunkompetenten allogenen Empfängern. Nat. Biotechnologie. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Erzeugung hypoimmunogener menschlicher pluripotenter Stammzellen. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. HLA DR-Genomeditierung mit TALENs in menschlichen iPSCs erzeugte immuntolerante dendritische Zellen. Stammzellen Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. MHC-Matching verbessert die Transplantation von iPSC-abgeleiteten Neuronen in nichtmenschlichen Primaten. Nat. Komm. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. et al. Mechanismusbasiertes Design von Wirkstoffen, die selektiv gegen arzneimittelresistente Gliome wirken. Wissenschaft. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. Durch die gezielte Ausrichtung auf mehrere Zelltodwege wird die Haltbarkeit verlängert und die Funktion von Neutrophilen bei Menschen und Mäusen für die Transfusion erhalten. Wissenschaft. Übers. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Fluoreszenzindikatoren für die kontinuierliche und linienspezifische Berichterstattung über Zellzyklusphasen in menschlichen pluripotenten Stammzellen. Biotechnologie. Bioeng. Bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Chemisch definierte Erzeugung menschlicher definitiver hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen. STAR-Protokoll. 4, 101953 (2023).