CaWRKY30 reguliert positiv die Immunität von Pfeffer, indem es CaWRKY40 durch Modulation verteidigungsbezogener Gene gegen die Impfung mit Ralstonia solanacearum richtet Teil 2

2.5. Die vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 stimulierte den HR-ähnlichen Zelltod, die Produktion von H2O2 und die transkriptionelle Hochregulierung immunitätsbezogener Markergene

Die VIGS-Experimente zeigten, dass CaWRKY30 die Immunität von Pfeffer gegenüber RSI positiv reguliert. Experimente zur vorübergehenden Überexpression wurden durchgeführt, indem GV3101-Zellen, die 35S:00 (EV) oder 35S: CaWRKY30 trugen, in Pfefferblätter infiltriert wurden, um diese Spekulation weiter zu validieren. Wir untersuchten die Rolle der vorübergehenden Überexpression von CaWRKY30 bei der Induktion des HR-ähnlichen Zelltods und der H2O2-Akkumulation in Pfefferpflanzen. Die Expression von CaWRKY30 in Pfefferpflanzen wurde durch Western-Blot-Experimente nachgewiesen (Abbildung 5A).

Der HR-ähnliche Zelltod und die H2O2-Anreicherung wurden durch Trypanblau- bzw. DAB-Färbung bestätigt. Die Ergebnisse zeigten, dass eine vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 einen HR-ähnlichen Zelltod und eine H2O2-Ansammlung in Pfefferblättern verursachte, was sich in einer dunkleren Trypanblau-Färbung und einer dunkelbraunen DAB-Färbung äußerte (Abbildung 5B). Die Leitfähigkeit wurde durchgeführt, um die Intensität der Zellnekrose zu untersuchen, die durch eine vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 verursacht wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass Pfefferblätter, die CaWRKY30 vorübergehend überexprimierten, 24 und 48 Stunden nach der Agro-Infiltration einen stärkeren Ionenaustritt aufwiesen als Pfefferblätter, die CaWRKY30 vorübergehend überexprimierten. Ausdruck eines leeren Vektors (Abbildung 5C). Relative Transkriptionsexpressionsniveaus von verteidigungsassoziierten Markergenen wie ET-Biosynthese-bezogenem CaPR1, SA-bezogenem CaNPR1, ABA-responsivem CaABR1 und HR-assoziiertem Markergen CaHIR1 wurden durch qRT-PCR-Analyse nachgewiesen.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 in Pfefferblättern die Transkriptionsakkumulation von CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 und CaHIR1 in Pfeffer deutlich verstärkte, verglichen mit einer vorübergehenden Überexpression leerer Vektorpfefferpflanzen bei 48 dpi (Abbildung 5D). Diese Ergebnisse zeigen, dass CaWRKY30 als positiver Regulator des HR-ähnlichen Zelltods von Pflanzen, der H2O2-Produktion und der Hochregulierung der Transkription von immunitätsbezogenen Markergenen fungiert.

Abbildung 5. Vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 induzierte HR-ähnlichen Zelltod, H2O2-Akkumulation und Expression von immunitätsassoziierten Markergenen in Pfefferblättern. Die erfolgreiche Überexpression von CaWRKY30-Flag wurde durch Western-Blot-Experiment (A) bestätigt, HR-ähnlicher Zelltod ausgelöst durch vorübergehende Überexpression von 35S: CaWRKY30, bestätigt durch Phänotyperkennung, Exposition unter UV-Licht usw DAB- und Trypanblau-Färbung bei 48 hpi; Maßstabsbalken=50 µm (B), Messung der Elektrolytleckage (Ionenleitfähigkeit) zur Abschätzung der Zelltodreaktion in Pfefferblattscheiben 24 bzw. 48 Stunden nach der Agro-Infiltration (C), qRT-PCR-Assay zu Überprüfen Sie die Transkriptionsexpressionsniveaus von immunitätsassoziierten Markergenen, einschließlich CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 und CaHIR1 in 35S: CaWRKY30 exprimierte Pfefferblätter mit jeweils 48 dpi (D). Das relative Expressionsniveau bekannter verteidigungsbezogener Markergene in Pfefferblättern, die den leeren Vektor vorübergehend überexprimieren, wurde auf „1“ gesetzt. Daten, die den Mittelwert ± SE aus vier biologischen Replikaten darstellen. Fehlerbalken sind Standardfehler der Mittelwerte. Unterschiedliche Buchstaben über den Balken weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten hin.

2.6. Wechselbeziehung zwischen CaWRKY30 und CaWRKY40

Es wird berichtet, dass verschiedene WRKY-TFs miteinander Netzwerke bilden, und wir haben zuvor berichtet, dass verschiedene Mitglieder von WRKY-TFs, d. h. CaWRKY6, CaWRKY22 und CaWRKY40, expressiv und funktionell miteinander verknüpft sind. Daher postulieren wir, dass CaWRKY30 möglicherweise mit anderen Mitgliedern der WRKY-Familie zusammenhängt, einschließlich CaWRKY40, das ein positiver Regulator der Immunität von Pfeffer gegen RSI ist. Die qRT-PCR-Analyse wurde zur weiteren Untersuchung einer möglichen Rückkopplungsregulation von CaWRKY40 durch CaWRKY30 und zur Untersuchung der möglichen Modulation von CaWRKY30 durch den CaWRKY40-Überexpressionstest oder durch Stummschaltung von CaWRKY40 durch VIGS durchgeführt.

CaWRKY40 ist ein WRKY-Transkriptionsfaktor, der an Pflanzenreaktionen auf verschiedene biotische und abiotische Belastungen beteiligt ist. Studien haben gezeigt, dass CaWRKY40 in Tomaten induziert wird und die Pflanzenresistenz bei Trockenheit und Behandlungen mit niedrigen Temperaturen verbessern kann. Darüber hinaus ergab die Studie auch, dass die Überexpression von CaWRKY40 die Trockenresistenz von Tomaten verbessern und die durch Salzstress verursachte Wachstumshemmung lindern kann, die Resistenz gegen Krankheitserreger bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. Daher spielt CaWRKY40 eine wichtige Rolle bei der Immunantwort von Pflanzen und hat ein gewisses Potenzial für die Steigerung des landwirtschaftlichen Ertrags. Gleichzeitig müssen wir auch auf unsere Immunität achten. Die Immunität unseres Körpers ist sehr wichtig. Cistanche hat einen erheblichen Einfluss auf die Verbesserung der Immunität. Cistanche ist reich an verschiedenen antioxidativen Substanzen wie Vitamin C, Vitamin C, Carotinoiden usw. Diese Inhaltsstoffe können freie Radikale abfangen, oxidativen Stress reduzieren und die Widerstandskraft des Immunsystems verbessern.

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Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Transkriptionswerte von CaWRKY30 in Pfefferblättern, die CaWRKY40 vorübergehend überexprimierten, bei 24 und 48 PS im Vergleich zu Pflanzen, die vorübergehend den leeren Vektor (EV) überexprimierten, anstiegen (Abbildung 6A), wohingegen die Transkriptionswerte von CaWRKY40 in diesen Pflanzen vorübergehend anstiegen überexprimierendes CaWRKY30 im Vergleich zu Pflanzen, die vorübergehend EV überexprimieren (Abbildung 6B). Im Gegensatz dazu zeigten unsere Ergebnisse, dass die Transkriptionsakkumulation von CaWRKY40 in mit Ralstonia infizierten, mit CaWRKY30-zum Schweigen gebrachten Pflanzen im Vergleich zu nicht zum Schweigen gebrachten Pflanzen deutlich herunterreguliert war (Abbildung 6C). Darüber hinaus wurde die Transkriptionsakkumulation bekannter immunitätsbezogener Markergene, z. B. CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 und CaHIR1, in CaWRKY30-stillgelegten Pflanzen, die durch CaWRK40 ausgelöst wurden, ganz oder teilweise unterdrückt (Abbildung 6D).

Diese Daten weisen auf die Transkriptionsregulation von CaWRKY40 durch CaWRKY30 und das Vorhandensein eines positiven Regelkreises zwischen CaWRKY30 und CaWRKY40 hin.

Abbildung 6. Wechselbeziehung zwischen CaWRKY30 und CaWRKY40. Transkriptioneller Ausdruck lev. Mengen von CaWRKY40 in Pfefferblättern, die CaWRKY30 in einem Zeitintervall von 24 und 48 dpi vorübergehend überexprimieren (A), Transkriptionelle Expressionsniveaus von CaWRKY30 in Pfefferblättern, die CaWRKY40 in einem Zeitintervall von 24 und 48 dpi vorübergehend überexprimieren (B), gRT-PCR-Analyse der transkriptionellen Expressionsniveaus von CaWRKY40 in CaWRKY30-stummgeschalteten und nicht stummgeschalteten Pfefferpflanzen bei 48 dpi (C)gRT-PCR-Analyse der Transkriptionsniveaus von verteidigungsassoziierten Markergenen in CaWRKY30-stummgeschalteten und nicht stummgeschalteten Pfefferpflanzen Nicht gedämpfte Pfefferpflanzen überexprimieren vorübergehend 35S: CaWRKY40-HA und 35S:00bei 48 hpi (D). Die Daten bedeuten plus SE aus vier biologischen Replikaten. Fehlerbalken sind Standardfehler der Mittelwerte. Unterschiedliche Buchstaben über den Balken zeigen signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten.

2.7. Wechselbeziehung zwischen CaWRY30 und CaWRKY6, CaWRKY22 und CaWRKY27

In unseren früheren Studien wurde festgestellt, dass CaWRKY40 expressiv und funktionell mit verschiedenen WRKY-TFs wie CaWRKY6 und CaWRKY22 assoziiert ist. Die Beziehung zwischen CaWRKY30 und CaWRKY40 weist darauf hin, dass CaWRKY30 möglicherweise mit verschiedenen WRKY-TFs verknüpft ist, die an der Immunität von Pfeffer gegen RSI beteiligt sind. Um diese Annahme zu bestätigen, wurde eine qRT-PCR-Analyse durchgeführt, um die Beziehung zwischen CaWRKY30 und verschiedenen WRKY-TFs zu untersuchen, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie an der Immunität von Pfeffer gegen RSI beteiligt sind, einschließlich CaWRKY6, CaWRKY22 und CaWRKY27. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Transkriptionsakkumulation von CaWRKY30 in CaWRKY6-, CaWRKY22- und CaWRKY27-Paprikapflanzen mit vorübergehender Überexpression bei 48 dpi verstärkt wurde (Abbildung 7A), während die Transkriptionsakkumulation von CaWRKY6, CaWRKY22 und CaWRKY27 auch in vorübergehend überexprimierenden Pfefferblättern erhöht war CaWRKY30 bei 48 dpi (Abbildung 7B). Unsere Ergebnisse des qRT-PCR-Assays deuten darauf hin, dass CaWRKY30 und CaWRKY6, CaWRKY22 und CaWRKY27 expressiv und funktionell miteinander verbunden sind.

3. Diskussion

Das WRKY-Protein ist eine der größten Familien pflanzlicher Transkriptionsfaktoren (TFs). Es ist bekannt, dass eine Gruppe von WRKY-TFs-Familienmitgliedern, die aus Arabidopsis thaliana und Oryza sativa stammen, an der Immunregulierung von Pflanzen beteiligt ist und eine entscheidende Rolle spielt. Es wurde über beträchtliche funktionelle Unterschiede zwischen eng strukturellen Homologen von WRKYs berichtet [17,48], und die Funktionen von WRKY-TFs bei der Immunität von Nicht-Modellpflanzen wie Pfeffer sind unzureichend untersucht.

Das CaWRKY30, ein WRKY-Gen der Gruppe III, wurde in der aktuellen Studie funktionell charakterisiert. Die Ergebnisse legen nahe, dass CaWRKY30 die Immunität von Pfeffer gegen RSl positiv reguliert und ein wichtiger Bestandteil des WRKY-Netzes ist, das aus CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 und CaWRKY40 besteht. Die Verstrickung von CaWRKY30 in die Immunität von Pfeffer wird durch auf Krankheitserreger reagierende cis-Elemente unterstützt, einschließlich des TGA-Elements, der TGACG-Motiv-IATC-Box, der TATA-Box und der W-Box, die in der Promotorregion von CaWRKY30 vorhanden sind. Diese Annahme stimmte mit der Hochregulierung der Transkriptionsniveaus von CaWRKY30 nach und nach exogen zugeführter ETH, ABA und SA überein [49,50].

Da oft bekannt ist, dass Gene, die durch die Exposition gegenüber einem bestimmten Stressfaktor ausgelöst werden, an der Reaktion auf diesen Stress beteiligt sind [51], spekulierten wir, dass CaWRKY30 die Immunität von Pfeffer gegenüber RSI positiv regulieren könnte. Diese Spekulation wurde durch die Daten zur Stummschaltung von CaWRKY30 durch VIGS und durch den Assay zur vorübergehenden Überexpression von CaWRKY30 gestützt. Diese eingeschränkte Immunität aufgrund des Funktionsverlusts von CaWRKY30 ging mit einem verstärkten Wachstum von RSI und einer Herunterregulierung immunitätsbezogener Markergene wie SA-abhängigem CaPR1 (52CaNPR1 [53], JA-verwandtem CaDEF1 (54), ABA-assoziiertem CaABR1 [55] einher ] und HR-assoziiertes CaHIR1 (561). Andererseits wurden HR-ähnlicher Zelltod und HO-Sekretion durch die vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 ausgelöst, begleitet von einer transkriptionellen Hochregulierung von immunitätsbezogenen Markergenen wie CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 und CaHIR1. Dies deutet auf die Rolle von CaWRKY30 als positiver Regulator des HR-ähnlichen Zelltods und der Immunität von Pfeffer gegen RSI hin. Ebenso wurde in früheren Studien beobachtet, dass AtWRKY30, ein Homolog von CaWRKY30 in Arabidopsis, die Impotenz von Pflanzen positiv reguliert -munitv gegen biotischen und abiotischen Stress 157.581. Dies lässt darauf schließen, dass CaWRKY30 bei einer Ralstonia-Infektion hochreguliert wird, was zu einer verringerten Anfälligkeit von Pfeffer für eine Infektion mit bakteriellen Krankheitserregern führt.

Phytohormone wie ET, ABA und SA sind essentielle Signalmoleküle, die an der Reaktion von Pflanzen auf Krankheitserregerangriffe und Hochtemperaturstress beteiligt sind. Diese sind auch an der Wechselwirkung zwischen den Reaktionen der Pflanzen auf biotischen und abiotischen Stress beteiligt [59]. Die SA löst Resistenzen gegen biotrophe Krankheitserreger aus, während ET eine entscheidende Rolle bei der Immunität von Pflanzen gegen nekrotrophe Krankheitserreger spielt [60]. Im Allgemeinen ist die Synthese von SA, ET und JA mit PAMP-ausgelöster Immunität (PTI) oder Effektor-ausgelöster Immunität (ETI) gekoppelt. Diese Phytohormone können je nach Konzentration während der Abwehrsignale ihre Rolle sowohl synergistisch als auch antagonistisch spielen [61]. Bei PTI wurde eine synergistische Assoziation zwischen diesen drei Signalelementen festgestellt, während bei ETI eine kompensatorische Assoziation festgestellt wurde [62]. Der CaWRKY30 wurde ständig durch exogen zugeführte Phytohormone induziert. Die bekannten SA-, ET- und ABA-abhängigen immunitätsbezogenen Markergene wie CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 und CaABR1 wurden durch die Stummschaltung von CaWRK30 herunterreguliert; Sie wurden jedoch durch vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 in Pfefferpflanzen hochreguliert, was zeigt, dass CaWRKY30 an der synergistisch vermittelten Abwehrsignalisierung durch SA, ET und ABA beteiligt ist, was zu PTI führt.

Eine genomweite Analyse zeigte die Beteiligung mehrerer WRKY-TFs an der Pflanzenimmunität [63–65]. Durch funktionelle Genomstudien wurden WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75] und -75 [78] wurden funktionell in der Immunität von Arabidopsis charakterisiert und regulieren die Immunität positiv oder negativ. Es wurde vorgeschlagen, dass sich diese WRKY-TFs in einem WRKY-Transkriptionsnetz anordnen, das aus Plus-Ve- und –V-Feedback-Schleifen und Feed-Forward-Modulen besteht [12]. Allerdings ist die Konfiguration dieser WRKY-Netzwerke noch immer kaum verstanden.

In früheren Studien haben wir entdeckt, dass CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 und CaWRKY40 positive Regulatoren der Immunität von Pfeffer gegenüber RSI sind [9,44,45], während CaWRKY58 ein negativer Regulator ist [46]. Die aktuelle Studie kommt zu dem Schluss, dass CaWRKY30 als positiver Regulator beim HR-ähnlichen Zelltod von Pfeffer und der Reaktion von Pfeffer auf eine R. solanacearum-Infektion fungiert. Die transkriptionellen Expressionsniveaus von CaWRKY30 wurden bei vorübergehender Überexpression von CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 und CaWRKY40 hochreguliert. Umgekehrt steigerte die vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 die Transkriptionsakkumulation von CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 und CaWRKY40, was auf das Vorhandensein von WRKY-TFs-Netzwerken und mehr als fünf Rückkopplungsschleifen zwischen CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 und CaWRKY40 schließen lässt. Gleich plus fünf Rückkopplungsschleifen sollen an der Immunität von Pflanzen beteiligt sein [47]. Die gleiche Art von Plus-V-Rückkopplungsschleife war bei CaWRKY40 und CaWRKY6, CaWRKY40 und CabZIP63, CaWRKY40 und CaCDPK15 vorhanden. In früheren Studien wurde auch festgestellt, dass CaWRKY6 [44] und CabZIP63 [16] direkt und transkriptionell an der Regulierung der CaWRKY40-Expression gegen RSI beteiligt sind. Angesichts dieser Ergebnisse kann vermutet werden, dass CaWRKY40 möglicherweise von verschiedenen TFs koordiniert wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die CaWRKY40-Expression durch CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30 und CabZIP63 bei RSI co-reguliert wird und die CaWRKY40-Expression durch CaWRKY6 und CabZIP63, jedoch nicht durch CaWRKY30 in Pfeffer nach Einwirkung hoher Temperaturen reguliert wird.

4. Materialien und Methoden

4.1. Pflanzenmaterialien und Wachstumsbedingungen

Samen der Pfeffersorte „Mexi“ und Nicotiana benthamiana wurden vom Ayub Agriculture Research Institute, Faisalabad, Pakistan, bezogen. Pfeffer- und N.-benthamiana-Samen wurden in Plastiktöpfe mit einer Erdmischung [Torfmoos und Perlit; 2/1 (v/v)] und in einem Wachstumsraum unter kontrollierten Bedingungen aufbewahrt, d. h. 25 ◦C Temperatur, 60–70 µmol Photonen m−2 s −1 Lichtintensität und 70 Prozent relative Luftfeuchtigkeit unter 16 h Licht/8 h dunkle Photoperiode.

4.2. Generierung von Vektoren

Zur Generierung von Vektoren wurde die Gateway-Klontechnik eingesetzt. Um Satellitenvektoren zu konstruieren, wurde CaWRKY30-ORF voller Länge (mit terminalem Codon oder ohne terminales Codon) mithilfe einer BP-Reaktion in den Eintrittsvektor pDONR207 kloniert. Anschließend wurde dieses Konstrukt durch Durchführung einer LR-Reaktion in die Zielvektoren pMDC83, CD3687 (HA-Tag), CD3688 (Flag-Tag) und Pk7WG2 übertragen, um Vektoren für die subzelluläre Lokalisierung bzw. Überexpression zu erzeugen.

Für die Konstruktion von Vektoren für VIGS wurde ein 364-bps-Fragment in der 30 -untranslatierten Region (UTR) von CaWRKY30 ausgewählt und die Spezifität durch BLAST gegen die Genomsequenz in der Datenbank von CM334 (http://peppergenome.snu) bestätigt. ac.kr/ (abgerufen am 29. Oktober 2021)) und Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast. jsp (abgerufen am 29. Oktober 2021)). Als nächstes wurde die BP-Reaktion durchgeführt, um dieses Fragment in pDONR207/201 zu klonen, nachdem dieses Konstrukt durch Durchführung einer LR-Reaktion in den Vektor PYL279 übertragen wurde.

4.3. Wachstums- und Impfverfahren des Krankheitserregers

Wir haben einen kompatiblen virulenten Stamm von R. solanacearum aus mit Ralstonia infizierten Pfefferpflanzen aus Dera Ghazi Khan, Pakistan, isoliert. Die Tetrazoliumchlorid-Methode wurde verwendet, um oberirdische Gefäßgewebe-Exsudate der pathogeninfizierten Pflanzen zu reinigen [9,45]. Das isolierte R. solanacearum wurde in SPA-Medium in einem Thermokontrollschüttler (200 g Kartoffel, 20 g Saccharose, 3 g Rindfleischextrakt, 5 g Trypton und 1 l doppelt destilliertes H2O) bei 200 U/min und 28 °C kultiviert über Nacht. Als nächstes wurde der kultivierte R. solanacearum-Stamm 10 Minuten lang bei 6500 µm und 28 °C zentrifugiert. Der flüssige Überstand nach der Zentrifugation wurde ausgegossen und die Pellets am Boden des Zentrifugenröhrchens wurden in sterilisierter 10 mM MgCl2-Lösung verdünnt. Die Bakterienzelldichte wurde auf 108 cfu ml−1 (OD600=0.8) eingestellt.

Um die Auswirkungen von RSI auf die Transkriptionsniveaus von CaWRKY30 und auf die Resistenz von Pfefferpflanzen gegenüber R. solanacearum-Angriffen zu untersuchen, wurde das obere Drittel der Blätter von Pfefferpflanzen mit einer Spritze ohne Nadel mit 10 µL R. solanacearum-Lösung infiltriert. Mit Krankheitserregern behandelte Blattproben wurden zu bestimmten Zeitpunkten für histochemische Färbeexperimente (z. B. DAB-Färbung oder Trypanblau-Färbung), elektrische Leitfähigkeit, KBE und RNA-Extraktion für weitere Experimente geerntet. Für das Phänotypisierungsexperiment von mit CaWRKY30-zum Schweigen gebrachten und nicht zum Schweigen gebrachten Pflanzen wurden Wurzeln mit einem Glasstab verletzt und mit kompatiblem virulentem R. solanacearum infiltriert. Die Pflanzen wurden in einer Wachstumskammer unter Kontrollbedingungen bei einer Temperatur von 28 ± 2 ◦C, einer Lichtintensität von 60–70 µmol Photonen m−2 s −1, 70 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit und unter 16-hLicht/{{12 }}h dunkle Photoperiode nach R. solanacearum-Inokulation. Bilder des Phänotyps wurden nach RSI in bestimmten Zeitintervallen aufgenommen.

4.4. Blattanwendung von Phytohormonen

Um die Wirkung von Phytohormonen zu untersuchen, wurden gesunde Paprikapflanzen im vierten Blattstadium mit 100 µM ETH, 100 µM ABA und 1 mM SA besprüht. Scheinpflanzen (Kontrollpflanzen) wurden mit sterilem ddH2O behandelt. Mit Phytohormonen behandelte Proben wurden zu gewünschten Zeitpunkten für die RNA-Extraktion und weitere Untersuchungen gesammelt.

4.5. Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von CaWRKY30

Agrobacterium-Zellen mit 35S: CaWRKY30-GFP oder 35S: GFP (Kontrolle) wurden über Nacht in einem LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika kultiviert. Das Kulturmedium wurde bei 6500 U/min zentrifugiert, der flüssige Überstand wurde abgegossen und das Pellet am Boden wurde in einem Induktionsmedium (10 mM MES, 10 mM MgCl2, pH 5,7 und 150 µM Acetosyringon) verdünnt und auf OD{{ 10}}.8. Agrobacterium, das 35S: CaWRKY30-GFP und 35S: GFP enthielt, wurde mit einer Spritze ohne Nadel in die Blätter von N. benthamiana injiziert. Die zuvor beschriebene Methode wurde zur Durchführung der 4,6-Diamidino-2-Phenylindol-Färbung (DAPI) verwendet [9]. Bei 48 hpt wurden GFP- und DAPI-Fluoreszenzsignale beobachtet und Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (TCS SP8, Leica, Solms, Deutschland) mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Bandpassemission von 505–530 nm aufgenommen Filter.

4.6. Histochemische Färbung

Die histochemische Färbung (Trypanblau und 3, 30 -Diaminobenzidin) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [9,11,79]. Um den Trypanblau-Färbungstest durchzuführen, wurden Pfefferblätter 30 Minuten lang in Trypanblau-Lösung (10 ml Milchsäure, 10 ml Glycerin, 10 ml Phenol, 40 ml Ethanol, 10 ml ddH2O und 1 ml Trypanblau) gekocht. Anschließend wurden die Blätter 8 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten, in eine Chloralhydratlösung (2,5 g Chloralhydrat gelöst in 1 ml destilliertem Wasser) getaucht und durch 30-minütiges Kochen von Flecken befreit. Die Chloralhydratlösung wurde mehrmals gewechselt, um den Hintergrund zu reduzieren, und dann wurden die Proben in 70-prozentiges Glycerin eingelegt. Für den DAB-Färbungstest wurden die Blätter über Nacht in 1 mg/ml DAB-Lösung gelegt. Die mit DAB gefärbten Blätter wurden in Milchsäure:Glycerin: absolutem Ethanol [1:1:3 (v/v/v)] gekocht und dann über Nacht in absolutem Ethanol entfärbt [80]. Die Bilder von Trypanblau- und DAB-gefärbten Blättern wurden mit einer Kamera und einem Lichtmikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen.

4.7. Stummschaltung von CaWRKY30 durch Virus-Induced Gene Silencing (VIGS)

Ein zuvor beschriebenes, auf dem Tobacco Rattle Virus (TRV) basierendes virusinduziertes Gen-Silencing-System (VIGS) wurde für die CaWRKY30-Stilllegung in Pfefferpflanzen durchgeführt [47,81,82]. Agrobacterium GV3101 mit den Konstrukten PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279 und PYL279-PDS (OD600=0.8) wurde im Verhältnis 1:1 gemischt. Diese Mischung wurde mit einer Spritze ohne Nadel in die Keimblätter von 2-Wochen alten Pfefferpflanzen infiltriert. Die infiltrierten Pflanzen wurden 56 Stunden lang im Dunkeln bei einer Temperatur von 16 °C und 45 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit in einer Wachstumskammer inkubiert und dann in einen Wachstumsraum unter kontrollierten Bedingungen bei 25 ± 2 °C und 60–70 µmol Photonen m−2 überführt s −1 und eine relative Luftfeuchtigkeit von 70 Prozent bei einer Photoperiode von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit.

4.8. CaWRKY30 Vorübergehende Überexpression in Pfefferblättern

Agrobacterium-Zellen GV3101, die CaWRKY30-Flag und EV enthielten, wurden in LB-Medium in einem Thermokontrollschüttler mit entsprechenden Antibiotika über Nacht auf OD600=1,0 kultiviert. Anschließend wurde dieses Agrobacterium GV3101 10 Minuten lang bei 6000 Uhr und 28 °C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der flüssige Überstand entfernt und das feste Pellet am Boden in einem Induktionsmedium (10 mM MES, pH 5,4, 10 mM MgCl2, 200 µM Acetosyringon) auf OD600=0,8 verdünnt. Diese Mischung wurde mit einer Spritze ohne Nadel in die Blätter infiltriert. Diese vorübergehend überexprimierten Blätter wurden auf HR-ähnlichen Zelltod untersucht, oder es wurden Proben gesammelt, um DAB- und Trypanblau-Färbeexperimente sowie zur RNA-Isolierung für weitere Experimente durchzuführen.

4.9. RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-RT-PCR

Die TRIzol-Reagenzmethode (Invitrogen) wurde verwendet, um Gesamt-RNA aus Blattproben behandelter Pfefferpflanzen und aus Scheinkeimlingen zu extrahieren. Anschließend wurde das Prime Script RT-PCR-Kit (TaKaRa, Dalian, China) verwendet, um extrahierte RNA rückwärts zu transkribieren. Eine Echtzeit-qRT-PCR-Analyse wurde durchgeführt, um die relativen Transkriptionsniveaus der gezielten Markergene zu untersuchen. Die Datenverarbeitung erfolgte gemäß den zuvor beschriebenen Methoden [45,82] mit spezifischen Primern (Ergänzungstabelle S3) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers für das Bio-Rad-Echtzeit-PCR-System (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) und SYBR-Premix-Ex-Taq-II-System (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. Schätzung der ELEKTRISCHEN Leitfähigkeit

Die elektrische Leitfähigkeit (Ionenleckage) wurde mit der zuvor beschriebenen Methode mit kleinen Änderungen berechnet [44,83]. Mit einem Locher wurden sechs Blattscheiben (4 mm breit) hergestellt. Die Scheiben wurden dreimal mit sterilisiertem ddH2O gewaschen und sofort in 10 ml ddH2O inkubiert. Danach wurden diese Blattscheiben 1 Stunde lang in einem leicht schüttelnden (60 U/min) Schüttler bei Raumtemperatur aufbewahrt. Zur Aufzeichnung der Daten zur elektrischen Leitfähigkeit wurde ein Leitfähigkeitsmessgerät (Mettler Toledo 326 Mettler, Zürich, Schweiz) verwendet.

4.11. Immunblotting

Ein zuvor beschriebenes Verfahren mit Proteinextraktionspuffer wurde verwendet, um Protein aus Pfefferblättern zu extrahieren [3]. Das extrahierte Protein wurde über Nacht mit AntiHA-Agarose bei 4 °C inkubiert (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Magnetischer Crack wurde zum Sammeln der Perlen verwendet und dreimal mit Tris-Puffer-Kochsalzlösung (TBS) und Tween 20 (0,05 Prozent) gewaschen. Eluiertes Protein wurde mittels Immunblotting und Anti-HA-Peroxidase (Abcam, Cambridge, UK) beobachtet.

5. Schlussfolgerungen

Zusammenfassend sind wir der Ansicht, dass CaWRKY30 die Immunität von Pfeffer gegen RSI transkriptionell aktiviert. Die Stummschaltung von CaWRKY30 durch VIGS schränkte die Immunität der Pfefferpflanzen gegen bakterielle Pathogeninfektionen ein, wohingegen eine vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 eine Resistenz gegen R. solanacearum induzierte. Insgesamt ist die Bildung einer positiven Rückkopplungsschleife und ihre Funktion parallel zu anderen TFs ein ausreichender Beweis für ihre Aktivierung unter biotischem Stress. Darüber hinaus schlagen wir die Erzeugung stabiler transgener CaWRKY30-Paprikapflanzen und des CaWRKY30-Zielproteins vor, um die Rolle dieses Gens gegen bakterielle Krankheitserreger und auch in verschiedenen Stoffwechselwegen umfassend zu erklären.

Autorenbeiträge:

Konzeptualisierung, AH, MIK, MA, BSA, ZL und ATKZ; Datenkuration, AH, MIK und AME-S.; Formale Analyse, ZL und SF; Finanzierungseinwerbung, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. und ATKZ; Projektverwaltung, AH und MIK; Ressourcen, AH; Validierung, SM; Visualisierung, SM und SF; Schreiben – Originalentwurf, AH und MIK; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF und ATKZ Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung:

Der Hauptautor ist der pakistanischen Hochschulkommission für die finanzielle Unterstützung zur Durchführung dieser Studie im Rahmen des SRGP-Zuschusses Nr. 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020 zu großem Dank verpflichtet. Die aktuelle Arbeit wurde vom Taif University Researchers Supporting Project mit der Nummer (TURSP2020/245) der Taif University, Taif, Saudi-Arabien, finanziert. Die Studie wurde auch vom Development Fund Project der Fujian Agriculture and Forestry University (CXZX2018114, CXZX2020008A und CXZX2019024G) unterstützt.

Erklärung des Institutional Review Board: Nicht zutreffend.

Einverständniserklärung: Nicht zutreffend.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit: Alle Daten sind im Manuskript und seinen Zusatzdateien enthalten.4

Interessenkonflikte: Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Verweise

1. Arif, M.; Atta, S.; Bashir, MA; Khan, MI; Hussain, A.; Shahjahan, M.; Alwahibi, MS; Elshikh, MS Der Einfluss des Zeitpunkts der FosetylAluminium-Anwendung auf die Karnal-Bunt-Unterdrückung und den wirtschaftlichen Ertrag von Brotweizen (Triticum aestivum L.). PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

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