CaWRKY30 reguliert positiv die Pfefferimmunität, indem es CaWRKY40 gegen die Impfung mit Ralstonia solanacearum durch Modulation verteidigungsbezogener Gene richtet Teil 1

Abstrakt:

Das Netzwerk der WRKY-Transkriptionsfaktoren (TFs) besteht aus der Untergruppe der WRKY-TFs, die eine entscheidende Rolle bei der Immunregulierung von Pflanzen spielen. Die Funktionen des WRKY-TF-Netzwerks bleiben jedoch unklar, insbesondere bei Nicht-Modellpflanzen wie Pfeffer (Capsicum annum L.). Diese Studie charakterisierte funktionell CaWRKY30 – ein Mitglied des Pfeffer-WRKY-Proteins der Gruppe III – für die Immunität von Pfeffer gegen Ralstonia solanacearum-Infektionen. Das CaWRKY30 wurde im Zellkern nachgewiesen und seine transkriptionellen Expressionsniveaus wurden durch R. solanacearum-Inokulation (RSI), Blattapplikation von Ethylen (ET), Abscisinsäure (ABA) und Salicylsäure (SA) deutlich erhöht. Die virusinduzierte Gen-Stummschaltung (VIGS) von CaWRKY30 verstärkte die Anfälligkeit der Paprika für RSI.

Darüber hinaus beeinträchtigte die Stummschaltung von CaWRKY30 durch VIGS den HR-ähnlichen Zelltod, der durch RSI ausgelöst wurde, und regulierte abwehrassoziierte Markergene wie CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, CaHIR1 und CaWRKY40. Umgekehrt löste eine vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 in Pfefferblättern einen HR-ähnlichen Zelltod und eine Hochregulierung verteidigungsbezogener Markergene aus. Darüber hinaus erhöhte die vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 die Transkriptionsniveaus von CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 und CaWRKY40.

Andererseits erhöhte die vorübergehende Überexpression von CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 und CaWRKY40 die Transkriptionsexpressionsniveaus von CaWRKY30. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das neu charakterisierte CaWRKY30 die Immunität von Pfeffer gegen den Ralstonia-Angriff positiv reguliert, die durch synergistisch vermittelte Signale durch Phytohormone wie ET, ABA und SA und die transkriptionelle Assimilation in WRKY-TFs-Netzwerke, bestehend aus CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 und CaWRKY40, gesteuert wird . Insgesamt werden unsere Daten dazu beitragen, den zugrunde liegenden Mechanismus des Crosstalks zwischen der Immunität von Pfeffer und der Reaktion auf RSI zu erklären.

Transkriptionsfaktoren spielen eine Schlüsselrolle im Immunsystem und steuern die Regulierung der Genexpression und die Bildung spezifischer Zelltypen. Das Folgende ist die Beziehung zwischen Transkriptionsfaktoren und Immunität:

1. Transkriptionsfaktor – NF-κB: NF-κB ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der an der Regulierung adaptiver Immunantworten von T- und B-Zellen beteiligt ist. Die Aktivierung von NF-κB kann Entzündungsreaktionen, Immunreaktionen und Zellapoptose fördern.

2. Transkriptionsfaktoren – STATs: STATs sind Transkriptionsfaktoren, die Trägersignale und zelluläre Reaktionen vermitteln. STATs können aktiviert werden, spielen eine Schlüsselrolle bei aktivierten T- und B-Zellen und sind an Prozessen wie der Proliferation, Differenzierung und Aktivierung von Immunzellen beteiligt.

3. Transkriptionsfaktor – AP-1: AP-1 ist eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die an der Regulierung verschiedener Zellfunktionen und Immunantworten beteiligt sind. Die Aktivierung von AP-1 kann Prozesse wie Zellproliferation, -differenzierung und -transformation fördern sowie antivirale und Immunreaktionen aufrechterhalten.

4. Transkriptionsfaktoren – CEBPs: CEBPs sind eine große Familie von Transkriptionsfaktoren, einschließlich CEBP , , , usw. in verschiedenen Gewebezellen. Im Immunsystem ist CEBP an der Aktivierung von Makrophagen und der Freisetzung von Zytokinen sowie an der Differenzierung und Aktivierung von B- und T-Zellen beteiligt.

Zusammengenommen spielen Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der Immunität und sind an der Regulierung und Aufrechterhaltung der Aktivität des Immunsystems in verschiedenen Zelltypen und -funktionen beteiligt. Deshalb müssen wir auch in unserem täglichen Leben auf die Verbesserung der Immunität achten. Cistanche kann die Immunität stärken, und die Polysaccharide im Fleisch können die Immunantwort des menschlichen Immunsystems regulieren, die Stressfähigkeit von Immunzellen verbessern und die Sterilisationswirkung von Immunzellen verstärken.

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Schlüsselwörter:

Chilischote (Capsicum annuum); Ralstonia solanacearum; CaWRKY30; WRKY-TFs.

1. Einleitung

Aufgrund ihrer unbeweglichen Natur sind Pflanzen im Laufe ihres Lebens häufig verschiedenen biotischen und abiotischen Belastungen ausgesetzt [1,2]. Pflanzen haben als Reaktion auf den wiederholten Selektionsdruck aufgrund großer ökologischer und umweltbedingter Zwänge mehrere Abwehrmechanismen entwickelt. Verschiedene Transkriptionsfaktoren (TFs) verbinden sich, um hochentwickelte Transkriptionsnetzwerke zur Regulierung dieser klassischen Abwehrmechanismen auf Transkriptionsebene zu entwickeln [3,4]. Abwehrreaktionen auf verschiedene Stressfaktoren werden ordnungsgemäß synchronisiert und kontrolliert, da sie für Pflanzen in Form von Energieaufwand und -entwicklung von entscheidender Bedeutung sind [5]. Die Abwehrmechanismen können bei verschiedenen Pflanzenarten aufgrund unterschiedlicher Umweltbedingungen, die sich auf ihre Akklimatisierung auswirken, unterschiedlich sein [6–8].

Daher kann das von Modellpflanzen eingesetzte Abwehrsystem nicht vollständig auf Nicht-Modellpflanzen übertragen werden. Daher standen in den letzten Jahrzehnten die Abwehrsysteme von Pflanzen im Mittelpunkt; Diese Studien konzentrierten sich jedoch hauptsächlich auf Modellpflanzen, dh Arabidopsis thaliana und Reis (Oryza sativa L.). Dennoch wurde die funktionelle Synchronisation dieser Transkriptionskomplexe zur Regulierung der Reaktion von Pflanzen auf verschiedene Stressfaktoren nur unzureichend untersucht, hauptsächlich bei Nicht-Modellpflanzen.

Die WRKY-Proteine ​​bilden die größte TFs-Familie in Pflanzen. Die WRKY-TFs enthalten eine oder zwei WRKY-Domänen und üblicherweise eine WRKYGQK-Sequenz am N-Terminus, gefolgt von einem C2HC- oder C2H2-Zinkfingermotiv [4,9,10]. Die WRKY-Proteine ​​werden phylogenetisch in drei Hauptgruppen (d. h. Gruppen I–III) unterteilt, basierend auf mehreren WRKY-Domänen und der Struktur des Zinkfingermotivs.

Gruppe II der WRKY-TFs ist wiederum in fünf Untergruppen (IIa, IIb, IIc, IId und IIe) unterteilt [11–13]. Die WRKY-Mitglieder binden hauptsächlich an W-Boxen [TTGAC(C/T)], die in Promotorregionen verschiedener Zielgene gefunden werden, indem sie durch das WRKY-GQK-Motiv auf dem zweiten b-Strang einen exklusiven Keil vertikal in die Hauptfurche der DNA einfügen [14], was stimuliert Transkriptionelle Modulation der Expression von Zielgenen [14–16]. Die WRKYs sind an mehreren biologischen Systemen in Pflanzen beteiligt, darunter Samenruhe, Samenkeimung, Seneszenz und Samenentwicklung. In ähnlicher Weise sind diese auch an der Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress und der Umstellung der Transkription ihrer Zielgene beteiligt [17–20].

Es wird berichtet, dass eine Gruppe von WRKY-TFs oder ein WRKY-TF, der durch nur einen Stress transkriptionell induziert wird, mehrere Stressfaktoren moduliert. Die W-Boxen sind innerhalb der Promotorregionen angereichert [21–24]. Diese Studien zeigen das Vorhandensein von WRKY-Netzwerken, die als Reaktion auf einen bestimmten Stress oder eine Kombination aus zwei oder mehreren beteiligt sind. Die Rolle von WRKY-Proteinen und die zugrunde liegenden Mechanismen als Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress wurden im letzten Jahrzehnt häufig untersucht; Der Schwerpunkt dieser Studien lag jedoch hauptsächlich auf einem Gen als Reaktion auf einen Stress in Modellpflanzen, z. B. A. thaliana und O. sativa. Kürzlich wurde eine wichtige funktionelle Varianz zwischen engen Homologen von WRKY-TFs aus verschiedenen Pflanzenarten vorgeschlagen [24,25]. Die Funktionen von WRKYs und WRKY-Web in Nicht-Modellpflanzen wie Capsicum annuum L. als Reaktion auf einzelne oder kombinierte Belastungen wurden bisher nur unzureichend untersucht.

Pfeffer ist weltweit für seine wirtschaftliche Bedeutung bekannt. Die Aussaat erfolgt im Hochland während der gemäßigten Jahreszeiten [26,27]. Pfeffer ist verschiedenen bodenbürtigen Krankheiten wie Pfefferfäule und Bakterienwelke ausgesetzt, die durch bakterielle Krankheitserreger, dh Phytophthora capsicum bzw. Ralstonia solanacearum, verursacht werden [28,29]. Das Zusammentreffen dieser Krankheitserreger hat verheerende Auswirkungen auf die Paprikaproduktion bei hohen Temperaturen und hoher Luftfeuchtigkeit (HTHH). Das HTHH beeinträchtigt die durch das R-Protein vermittelte Immunität von Pfeffer und beschleunigt das Wachstum und die Entwicklung von Krankheitserregern. Darüber hinaus üben Krankheitserregerangriffe und HTHH gleichzeitig einen natürlichen Selektionsdruck auf Pfeffer aus, der sich in der Vergangenheit auf die Entwicklung von Pfeffer ausgewirkt hat [30–32]. Umgekehrt hat das gleichzeitige Auftreten einer Pathogeninfektion und von HTHH möglicherweise keinen Einfluss auf die Entwicklung von Modellpflanzen wie A. thaliana und O. sativa. Daher scheint Pfeffer besser für die Forschung zur Immunität gegen biotischen oder abiotischen Stress, also RSI oder HTHH, geeignet zu sein.

Ralstonia solanacearum verursacht bakterielles Welken in zahlreichen Nutzpflanzen, z. B. Paprika, Tomaten, Kartoffeln usw. Es handelt sich um ein bodenbürtiges gramnegatives Proteobakterium [33]. Es bildet schnell Kolonien im Xylemgewebe, was bei den befallenen Pflanzen zu einer bakteriellen Welkekrankheit führt [34].

Es ist bekannt, dass die Reaktionen von Pflanzenarten auf biotischen und abiotischen Stress durch Phytohormone reguliert werden [35]. Phytohormone sind winzige Moleküle, die an der Regulierung des Pflanzenwachstums, der Pflanzenreproduktion und dem Überleben beteiligt sind. Salicylsäure (SA) und Jasmonsäure (JA) sind entscheidend für die Immunantwort von Pflanzenarten. Diese beiden gelten als entscheidende Grundlagen der Immunantwort von Pflanzen gegen Krankheitserreger. Biosynthese und Signalübertragung von SA sind für die Abwehr biotropher Krankheitserreger von entscheidender Bedeutung, während JA für die Abwehr nekrotropher Krankheitserreger sorgt [36,37]. Ethylen (ET) unterstützt Abwehrreaktionen gegen verschiedene Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern [37].

Verschiedene einheimische Pfeffersorten subtropischer Gebiete zeigen selbst unter HTHH eine beschleunigte Krankheitsresistenz [38]. Hitzebedingtes cis-Element-HSE kommt im Allgemeinen zusammen mit Phytohormonen, einschließlich SA, JA, ET, ABA, oder pathogenbedingten cis-Elementen in Promotorregionen der meisten MAPKs und CDPKs vor, die an der Pflanzenimmunität beteiligt sind [39–41]. Es empfiehlt das Vorhandensein eines Crosstalks zwischen Immunität und HTHH. Das Pfeffergenom ist im Vergleich zu A. thaliana und O. sativa 27- bzw. 7,5-mal größer. Es verfügt jedoch nur über 73 WRKY-Gene, während kleinere Genome von A. thaliana und O. sativa 72 bzw. 122 WRKY-Gene aufweisen [9,42,43]. Wir haben zuvor festgestellt, dass CaWRKY6 [44], CaWRKY22 [9], CaWRKY40 [45] und CaWRKY58 [46] an der Reaktion von Pfeffer gegen RSI beteiligt waren.

Unter diesen wirken CaWRKY6, -22, -27 und -40 als positive Regulatoren der pflanzlichen Immunität, während CaWRKY58 ein negativer Regulator ist. Diese Gene besitzen eine Untergruppe von HSE-Elementen und W-Boxen in ihrer Promotorregion und den Promotoren anderer WRKY-TFs, was auf die Rolle von WRKY-Netzwerken bei der Regulierung der Reaktion von Pepper gegen RSI schließen lässt. Darüber hinaus wurde CaWRKY40 direkt durch CaWRKY6 (44) und CabZIP63 (16) reguliert, während CaWRKY40 indirekt durch CaCDPK15 (47) reguliert wurde. Umgekehrt wurden die meisten WRKY-TFs der Paprika noch nicht hinsichtlich ihrer Reaktion auf Krankheitserregerangriffe charakterisiert.

In der aktuellen Studie wurde eine vollständige cDNA für die Pfefferfamilie WRKY TFs isoliert und CaWRKY30 genannt. Wir haben es expressionell und funktionell charakterisiert und festgestellt, dass CaWRKY30 durch RSI und Blattapplikation von SA, JA, ET und ABA induziert wurde. Eine vorübergehende Überexpression von CaWRKY30 in Pfefferblättern löste einen HR-ähnlichen Zelltod und eine H2O2-Produktion aus. Die Stummschaltung von CaWRKY30 in Pfeffer beeinträchtigte die Immunität von Pfeffer gegenüber RSI. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CaWRKY30 die Immunität von Pfeffer gegenüber RSI positiv reguliert.

2. Ergebnisse

2.1. Klonierung und Sequenzanalyse von CaWRKY30

Durch genomweite Analyse wurde ein neues WRKY-Gen CaWRKY30 (CA01g34480) identifiziert. Das CaWRKY30-Gen wurde für die funktionelle Charakterisierung ausgewählt, da das Vorhandensein von immunitätsbezogenen cis-Elementen wie TGA (TGACG-Motivbindungsfaktor), TGACG-Motiv, TATC-Box, TATAbox und W-Box in der Promotorregion darauf schließen lässt, dass dies möglich ist Rolle bei der Immunität von Pfeffer (Abbildung S1). Ein cDNA-Fragment von CaWRKY30 (CA01g34480) mit einem offenen Leserahmen (ORF) von 924 bp wurde unter Verwendung genspezifischer Primer kloniert (Tabelle S1). Die Länge der abgeleiteten Aminosäuresequenz von CaWRKY30 betrug 307 Aminosäurereste, besaß eine konservierte WRKY-Domäne und wurde in Gruppe III eingeteilt (Abbildung 1). Das vorhergesagte Protein hat eine Größe und einen theoretischen pI von 34,55 kDa bzw. 7,32. CaWRKY30 teilt 88, 60, 68 bzw. 57 Prozent Aminosäureidentität mit NsWRKY53, CcWRKY53, NaWRKY53 bzw. StWRKY53 (Abbildung S2).

2.2. Transkriptionelle Expression von CaWRKY30 unter RSI und Behandlung mit verschiedenen Phytohormonen

Das Vorhandensein von immunitätsassoziierten cis-Elementen in der Promotorregion von CaWRKY30 deutete auf dessen mögliche Rolle beim Immunitäts-RSI von Pfeffer hin. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde eine qRT-PCR-Analyse durchgeführt, um die Transkriptionsniveaus von CaWRY30 bei RSI zu bestimmen. Die Transkriptionsniveaus von CaWRKY30 waren in mit Ralstonia behandelten Blättern im Vergleich zu scheinbehandelten Blättern erhöht (Abbildung 2A). Die erhöhten CaWRKY30-Transkriptionsexpressionsniveaus waren zwischen 0 und 48 Stunden nach der Behandlung (HPT) konsistent. Die höchsten Transkriptionsexpressionsniveaus wurden bei 48 hpt aufgezeichnet (Abbildung 2A).

Phytohormone, einschließlich ET-, ABA-, SA- und JA-vermittelter Signalwege, sind wichtige Regulatoren pflanzlicher Reaktionen auf biotischen und abiotischen Stress. Die Regulierung von CaWRKY30 durch Phytohormone-vermittelte Signalwege wurde durch Blattapplikation von ET, ABA, SA und JA mittels qRT-PCR-Analyse untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die relativen Transkriptionsexpressionsniveaus von CaWRKY30 im Vergleich zum Schein von 0 h auf 48 hpt mit 100 µM ET erhöht waren. Diese Transkriptionsniveaus waren mit 48 hpt mit ET am höchsten (Abbildung 2B). Die Blattapplikation von 100 µM ABA erhöhte die Transkriptionswerte von CaWRKY30 im Vergleich zum Schein signifikant. Die Transkriptionswerte erreichten mit ABA den höchsten Wert bei 12 hpt (Abbildung 2C). Die Ergebnisse zeigten, dass die Transkriptionsakkumulation von CaWRKY30 nach der Anwendung von 1 mM SA im Vergleich zum Schein signifikant erhöht war. Diese erhöhten Transkriptionsexpressionsniveaus waren bei 24 hpt am höchsten (Abbildung 2D).

Abbildung 2. Der qRT-PCR-Assay der relativen Transkriptionsexpressionsniveaus von CaWRKY30 in Pfefferblättern, die einer Ralstonia solanacearum-Inokulation (RSI) und einer Blattapplikation verschiedener Phytohormone unterzogen wurden. Die qRT-PCR-Analyse wurde verwendet, um die Transkriptionsniveaus von CaWRKY30 in Pfefferblättern zu überprüfen, die verschiedenen Behandlungen unterzogen wurden, darunter RSI (A), Anwendung von 100 µm ET (B), Anwendung von 100 µm ABA (C) und Anwendung von 1 mM SA (D) in unterschiedlichen Zeitintervallen. Die Transkriptionshäufigkeit in RSI-behandelten Blättern wurde mit MgCl2 -behandelten Kontrollblättern (Schein) verglichen, deren relatives Expressionsniveau auf „1“ gesetzt war. (B–D) Die Transkriptionsexpressionsniveaus in mit Phytohormon behandelten Blättern wurden mit ddH2O-behandelten Blättern (Schein) verglichen, deren Expressionsniveau auf „1“ gesetzt war. Die Höhe des Balkens gibt den Mittelwert an, und der Fehlerbalken gibt den Standardfehler des Mittelwerts an. Verschiedene Buchstaben über den Balken zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten basierend auf dem geschützten LSD-Test von Fisher.

2.3. Es wurde festgestellt, dass CaWRKY30 im Zellkern lokalisiert ist

Die Sequenzanalyse unter Verwendung von WoLFPSORT zeigte, dass die vorhergesagte CaWRKY30-Proteinsequenz ein mutmaßliches Kernlokalisierungssignal besitzt (Abbildung 1), was ihr potenzielles Targeting im Kern zeigt. Um diese Wahrnehmung zu bestätigen, wurde ein aCaWRKY30-GFP-Fusionskonstrukt generiert, das von einem konstitutiven Promotor von CaMV35S angetrieben wurde. Anschließend wurde dieser zusammengesetzte Vektor in den Agrobacterium-Stamm GV3101 übertragen. Wir haben das CaWRKY30-GFP-Konstrukt in Blättern von Nicofiamabenthamiana durch A. tumefacient-Injektion vorübergehend überexprimiert und die GFP-Signale wurden mit einem konfokalen Fluores.science-Mikroskop untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass GFP-Signale von CaWRKY30-GFP in den Kernen vorhanden waren, während GFP der Kontrolle in verschiedenen subzellulären Teilen wie Zytoplasma und Kernen nachgewiesen wurde (Abbildung 3).

Abbildung 3. Subzelluläre Lokalisierung von CaWRKY30. Das CaWRKY30 hat sich vollständig im Kern der Blätter von Nicotiana benthaminna angesiedelt. Die grüne Farbe zeigt GFP. Die blaue Farbe zeigt die DAPI-Färbung des Zellkerns. Die Cyan-Farbe zeigt die Verschmelzung grüner CFP- und blauer DAPI-gefärbter Kerne. CPP signaGreen) für die Kontrolle wurden N. benthamiana-Blätter überall in der Zelle nachgewiesen. Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Inokulation durch konfokale Mikroskopie aufgenommen. Balken=25 ähm.

2.4. Die Stummschaltung von CaWRKY30 durch VIGS schränkte die Immunität von Pepper gegen RSI ein und regulierte immunitätsassoziierte Markergene herunter.

Der CaWRKY30 wurde durch virusinduzierte Gen-Stummschaltung (VIGS) zum Schweigen gebracht, um seine Rolle bei der Pfefferimmunität zu untersuchen. Insgesamt wurden 50 CaWRKY30-nicht schallgedämpfte (TRV:00) und 50 CaWRKY30- schallgedämpfte (TRV: CaWRKY30) Pflanzen erworben. Sechs CaWRKY30-stummgeschaltete Pflanzen wurden zufällig ausgewählt, um ihre Effizienz der Gen-Stilllegung durch Wurzelimpfung mit Zellen des kompatiblen virulenten R. solanacearum-Stamms zu überprüfen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Transkriptionswerte von CaWRKY30 in mit Ralstonia behandelten, mit CaWRKY30 zum Schweigen gebrachten Pflanzen im Vergleich zu nicht zum Schweigen gebrachten Pflanzen um etwa 30 Prozent verringert waren, was die Stummschaltung von CaWRKY30 bestätigt (Abbildung 4A).

Die mit CaWRKY30 zum Schweigen gebrachten Pflanzen zeigten im Vergleich zu nicht zum Schweigen gebrachten Pflanzen eine deutlich höhere Anfälligkeit für RSI. Die Anfälligkeit von Pfeffer gegenüber Krankheitserregern wurde durch einen Anstieg des Ralstonia-Populationswachstums erhöht, der durch höhere CFU-Werte in CaWRKY30-stillgelegten Pfefferpflanzen im Vergleich zu nicht-stillgelegten Pflanzen 3 Tage und 5 Tage nach der Inokulation (dpi) gekennzeichnet war (Abbildung 4B). Ein histochemischer Färbetest wurde durchgeführt, um die H2O2-Produktion und Zellnekrose in mit Ralstonia inokulierten CaWRKY30-stillgelegten (TRV: CaWRKY30) und nicht-stillgelegten (TRV:00) Pfefferblättern nachzuweisen. Eine dunkle DAB-Färbung (ein Zeichen der H2O2-Produktion) und ein HR-ähnlicher Zelltod, der durch eine dunkle Trypanblau-Färbung angezeigt wird, wurden in nicht schallgedämpften Pfefferblättern bei 48 PSi (Stunden nach der Inokulation) festgestellt. Umgekehrt waren die Konzentrationen von Trypanblau und DAB-Färbung in CaWRKY30-stillgelegten Pfefferblättern signifikant verringert (Abbildung 4C). Die elektrische Leitfähigkeit – ein Indikator für den Ionenaustritt – wurde berechnet, um die Schädigung der Plasmamembran und den Zelltod nach RSI zu untersuchen.

Die Ergebnisse zeigten, dass mit RSI behandelte, nicht schallgedämpfte Pflanzen bei 24 und 48 dpi eine höhere Ionenleckage aufwiesen als mit Ralstonia behandelte, mit CaWRKY30 schallgedämpfte Pflanzen (Abbildung 4D). Der relative Krankheitsindex wurde auf bis zu 10 dpi geschätzt, um das Ausmaß der Krankheit in CaWRKY30--stillgelegten und nicht-schallgedämpften Pflanzen nach RSI abzuleiten (Ergänzungstabelle S2). Bei mit CaWRKY30 zum Schweigen gebrachten Pflanzen wurden bei 10 dpi deutliche Krankheitssymptome festgestellt, während nicht zum Schweigen gebrachte Pflanzen nur geringe Krankheitssymptome aufwiesen (Abbildung 4E). Sechs zum Schweigen gebrachte und nicht zum Schweigen gebrachte CaWRKY30--Pflanzen wurden zufällig ausgewählt und für die Phänotyp-Analyse mit R. solanacearum in die Wurzeln infiltriert. Offensichtliche Welkekrankheitssymptome wurden bei CaWRKY30-gedämpftem Pfeffer bei 10 dpi festgestellt, während nicht gedämpfte Pflanzen nur sehr schwache Welkesymptome aufwiesen (Abbildung 4F). Die qRT-PCR-Analyse wurde durchgeführt, um die Transkriptionsakkumulation von immunitätsbezogenen Markergenen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Transkriptionsexpressionsniveaus von immunitätsbezogenen Markergenen wie CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 und CaHIR1 in CaWRKY verringert waren. 25}}stummgeschaltete Pflanzen im Vergleich zu nicht schallgedämpften Pflanzen bei 48 dpi (Abbildung 4G).

Abbildung 4. Die Stummschaltung von CaWRKY30 durch VIGS verringerte die Resistenz von Pfeffer gegenüber RSI und regulierte immunitätsassoziierte Markergene hoch. Der qRT-PCR-Assay der CaWRKY30-Expressionsniveaus in mit R. solanacearum inokulierten, simulierten (mit MgCl2-Lösung inokulierten), CaWRKY30-stillgelegten Pfefferpflanzen (TRV: CaWRKY30) und Kontrollpflanzen (TRV:00) (A). Der Unterschied im Wachstum von R. solanacearum zwischen CaWRKY30-schallgedämpften und nicht schallgedämpften (Kontroll-)Pfefferpflanzen, die mit R. solanacearum bei 3 und 5 dpi inokuliert wurden (B). Histochemische Färbung (DAB- und Trypanblau-Färbung) in mit R. solanacearum inokulierten CaWRKY30-stillgelegten (TRV: CaWRKY30) und nicht stillgelegten (TRV:00) Pfefferblättern bei 48 dpi. Maßstabsbalken=50 µm (C). Messung des Elektrolytaustritts als Ionenleitfähigkeit zur Bewertung der Zelltodreaktionen in den Blattscheiben von CaWRKY30-stummgeschalteten (TRV: CaWRKY22) und nicht schallgedämpften (TRV:00) Pfefferpflanzen bei 24 und 48 hpi mit und ohne R. solanacearum (D). Die CaWRKY30-Stummschaltung durch VIGS erhöhte die Anfälligkeit von Pfefferpflanzen für eine Infektion mit R. solanacearum.

Der Krankheitsindex stieg mit der Zeit deutlich an. CaWRKY30-stummgeschaltete (TRV: CaWRKY30) Pflanzen zeigten im Laufe der Zeit im Vergleich zu nicht stummgeschalteten (TRV:00) Pflanzen eine hohe Anfälligkeit für R. solanacearum-Infektionen. Die Durchschnittswerte basieren auf vier biologischen Replikaten mit fünf Pflanzen pro Replikat (E). Die phänotypische Wirkung der Behandlung mit R. solanacearum auf CaWRKY30-stummgeschaltete (TRV: CaWRKY30) und nicht stummgeschaltete (TRV:00) Pfefferpflanzen bei 10 dpi (F). qRT-PCR-Assay der Transkriptionsniveaus verteidigungsassoziierter Markergene in CaWRKY30-stummgeschalteten (TRV: CaWRKY30) und nicht stummgeschalteten (TRV:00) Pfefferpflanzen 48 Stunden nach der Inokulation mit R. solanacearum (G). Das relative Transkriptionsexpressionsniveau von scheinbehandelten, nicht zum Schweigen gebrachten Pflanzen wurde auf „1“ gesetzt. Die Höhe des Balkens gibt den Mittelwert an, und der Fehlerbalken gibt den Standardfehler des Mittelwerts an. Die Daten stellen die Mittelwerte ± SE aus vier biologischen Replikaten dar. Unterschiedliche Buchstaben über den Balken zeigen signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten.

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