CD73-Überexpression in Podozyten: Ein neuartiger Marker für Podozytenverletzungen bei menschlichen Nierenerkrankungen
Feb 26, 2022
Abstrakt:Der CD73-Signalweg ist ein wichtiger entzündungshemmender Mechanismus bei verschiedenen Krankheitsbildern. Beobachtungen in Mausmodellen deuteten darauf hin, dass CD73 eine schützende Rolle spielen könnteNierenschäden; jedoch kein direkter Beweis für seine Rolle beim MenschenNierenerkrankungwurde bisher beschrieben. Hier haben wir diese Podozytenverletzung beim Menschen angenommenNierenerkrankungenverändert die CD73-Expression, was die Diagnose von Podozytopathien erleichtern kann. Wir untersuchten die Expression von CD73 und einem seiner funktionell wichtigen Ziele, dem CC-Chemokinrezeptor Typ 2 (CCR2), in Podozyten ausNiereBiopsien von 39 Patienten mit Podozytopathie (einschließlich fokaler segmentaler Glomerulosklerose (FSGS), Minimal Change Disease (MCD), membranöser Glomerulonephritis (MGN) und Amyloidose) und einer Kontrollgruppe. Die Podozyten-CD73-Expression war in jeder der Krankheitsgruppen im Vergleich zu den Kontrollen signifikant erhöht (p < 0.0{{10}}1–p="">< 0,0001).="" darüber="" hinaus="" gab="" es="" eine="" deutlich="" negative="" korrelation="" zwischen="" cd73-="" und="" ccr2-expression,="" wie="" durch="" immunhistochemie="" und="" immunfluoreszenz="" bestätigt="" wurde="" (pearson="" r="−" 0,5068,="" p="0" 0,0031;="" pearson="" r="−" 0,4705,="" p="0,0313)," was="" auf="" eine="" schützende="" rolle="" von="" cd73="" in="">Nierenverletzung.Schließlich identifizieren wir CD73 als einen neuen potenziellen diagnostischen Marker für menschliche Podocytopathien, insbesondere für MCD, die für das Fehlen von pathologischen Merkmalen bekannt ist, die durch Lichtmikroskopie und Immunhistochemie erkennbar sind.
Schlüsselwörter:Podozyt; Minimal-Change-Krankheit; CD73; CCR2;Nierenverletzung;Nierenversagen
Einführung
Die evolutionär entscheidende Rolle von Adenosintriphosphat (ATP) als allgegenwärtige intrazelluläre Energiequelle wurde vor mehr als drei Jahrzehnten mit einer revolutionären Vorstellung aktualisiert, dass die Mitglieder des purinergen Systems (ATP, Adenosindi- und -triphosphat (ADP bzw. AMP)) kann auch extrazelluläre Signale liefern, um zelluläre Interaktionen zu vermitteln [ 1 , 2 ] Dieses Konzept führte zu dem Verständnis, dass das purinerge System an der Gestaltung von Immunantworten durch Modulation des Rezeptorexpressionsprofils, Zytokinsekretion, Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und beteiligt ist intrazelluläre Pathogenverdauung [3–7] Extrazelluläres ATP wird über CD39 (Ecto-Nukleosidtriphosphat-Diphosphohydrolase 1) in ADP und AMP umgewandelt/dephosphoryliert und schließlich wird AMP durch CD73 (Ecto-5 0-Nukleotidase) zu Adenosin abgebaut [ 8 ] CD73 kann in membrangebundener oder löslicher Form vorliegen.Die Membranform hat eine Dimerstruktur, die aus zwei identischen 70-kD-Untereinheitenbesteht, die an binden die Plasmamembran über eine Verbindung zwischen C-terminalem Serin und Glycosylphosphatidylinositol (GPI) [ 9 ]. Bemerkenswerterweise scheinen die CD39-Substrate ATP und ADP kompetitive Inhibitoren von CD73 zu sein [ 9 – 11 ]. Die CD73-Expression repräsentiert somit den entscheidenden Weg zur Einstellung des Adenosinspiegels im extrazellulären Raum. CD73 ist kein zell- oder organspezifisches Molekül; seine Expression auf Leukozyten, Endothel, Epithel- oder Mesenchymzellen verschiedener Organe (Niere, Lunge, Leber, Dickdarm, Gehirn und Herz) und Stammzellen ist gut dokumentiert [ 12 – 14 ]. Eine schützende Rolle von Adenosin über den Stickoxid (NO)-Syntheseweg bei einer Leberischämie-induzierten Verletzung wurde erstmals von Peralta et al. [ fünfzehn ]. In Übereinstimmung mit diesen Daten wurde gezeigt, dass seine Wirkung akute Lungenschäden, Allotransplantat-Atemwegsabstoßung, akute Graft-versus-Host-Erkrankung und Sepsis verbessert [4,16–19].
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENVERSAGEN VERBESSERN
Wie in mehreren Mausmodellen überzeugend demonstriert, kann CD73 an der tubulo-glomerulären Interaktion in der beteiligt seinNiere. Es wurde gezeigt, dass die CD73--vermittelte Erzeugung von Adenosin, das durch CD73 aus ATP tubulären Ursprungs während einer Ischämie-Reperfusionsschädigung stammt, die Entzündung über die Hemmung der Effektorfunktion von Neutrophilen abschwächt [ 20 ]. Darüber hinaus zeigen CD73--defiziente Mäuse eine Autoimmunentzündung, die von einer verringerten Anzahl von Podozyten und endothelialen Fenestrationen begleitet wird [ 21 ]. Dieses Phänomen war mit erhöhten Serumspiegeln von entzündungsfördernden Zytokinen wie Tumornekrosefaktor (TNF)-alpha oder dem Chemokin CXC-Motivliganden 2 (CXCL-2) verbunden. In der Einstellung MenschNierenerkrankung,Es wurde postuliert, dass Podozytenschäden wahrscheinlich eine Mischung aus adaptiven und destruktiven Mechanismen der zellulären Reaktion auf pathologische Stimuli darstellen, was nicht unbedingt veröffentlichte Beobachtungen aus In-vitro- oder Tiermodellen widerspiegelt. Die Ätiologie der Podozytenverletzung variiert von mechanischem Stress (glomeruläre Hyperfiltration), oxidativem Stress (wie bei hypertensiver oder diabetischer Nephropathie, toxischer Verletzung, entzündlicher Zellinfiltration oder Tiermodellen der Minimal-Change-Krankheit) bis zu immunologischem Stress (d. h. durch Immunkomplexe und Komplement vermittelte Schäden). bei Glomerulonephritis) [ 22 ]. Die entzündliche Einstellung der Glomerulonephritis kann Podozyten dazu anregen, verschiedene Zytokine zu synthetisieren, möglicherweise über eine CC-Chemokinrezeptor-2 (CCR2)-vermittelte Signalübertragung. Dennoch ist wenig über die Rolle von CD73 beim Menschen bekanntNierenerkrankung, insbesondere bei chronischer Entzündung und Podozytenverletzung.
In der vorliegenden Studie stellten wir die Hypothese auf, dass CD73 eine Rolle bei der Pathogenese menschlicher glomerulärer Erkrankungen spielt, und analysierten die Podozyten-CD73-Expression beim MenschenNiereBiopsien von Patienten mit Pathologien im Zusammenhang mit Podozytopathie. Wir zeigen, dass die Podozytenoberflächenexpression von CD73 ein zuverlässiger Marker für Podozytenschäden ist, was insbesondere den diagnostischen Wert von CD73 bei der Minimal Change Disease (MCD) unterstützt. Darüber hinaus berichten wir über eine negative Korrelation zwischen der Podozyten-CCR2- und CD73-Expression, was darauf hindeutet, dass die Überexpression von CD73 eine adaptive Reaktion auf eine glomeruläre Läsion darstellt.
Ergebnisse
Klinische Daten und ultrastrukturelle Bildgebung von PodozytenschädenTabelle 1 skizziert die klinische Präsentation der in die Studie eingeschlossenen Fälle in Bezug auf Alter, Geschlecht, Kreatinin und Gesamtproteinurie-Werte. Alle FSGS-Patienten hatten eine primäre NOS-Form (nicht anders angegeben). Von 12 MGN-Patienten waren 5 Phospholipase-A2-Rezeptor (PLA2R)-positiv (42 Prozent). In der Amyloidose-Gruppe hatten 2 Patienten AA-Amyloidose (16,7 Prozent) und 10 AL-Amyloidose (83,3 Prozent); bei 2 Patienten mit AL-Amyloidose war die leichte Kappa-Kette offensichtlich (20 Prozent) und 8 waren positiv für Lambda (80 Prozent der AL-Amyloidose-Gruppe). Bei allen Patienten mit MCD, FSGS, MGN und Amyloidose wurde elektronenmikroskopisch eindeutig eine Podozytenschädigung nachgewiesen (Abbildung 1).
Abbildung 1. Ultrastrukturelles Bild der primären und sekundären Podozytenschädigung. ( a ) Ausbreitung des Podozytenkörpers auf der glomerulären Basalmembran (Pfeil) mit Retraktion der Fußfortsätze bei MCD. (b) Ausgedehnte Auslöschung des Podozytenfußfortsatzes (Pfeil) und zytoplasmatische Vakuolisierung (Stern) bei einem Patienten mit primärem FSGS. (c) Auslöschung des Fußfortsatzes (Pfeil), Vakuolisierung und prominente Organellen (Doppelpfeil) mit darunter liegendem epimembranösem elektronendichtem Material (Stern) bei primärer membranöser Glomerulonephritis. (d) Subepitheliale Ansammlung von Amyloidfibrillen (Doppelpfeil) mit konsekutiver Podozytenablösung (als Zeichen einer irreversiblen Podozytenschädigung) bei einem Patienten mit AL-Amyloidose (Lambda). Alle elektronenmikroskopischen Aufnahmen sind mit 4000-facher Vergrößerung dargestellt. Inserts – entsprechende lichtmikroskopische Mikrofotografien (40 × /0,65 NA; Skalenbalkengröße: 50 µm in (a,c,d) und 100 µm in (b); PAS-Färbung).
Die Oberflächenexpression von CD73 ist mit Podozytenverletzungen bei menschlichen Nierenerkrankungen assoziiert
Um zu untersuchen, ob Podozyten CD73 in der physiologischen Umgebung exprimieren, und um das Muster von CD73 in verschiedenen Krankheitssituationen im Zusammenhang mit Podozytenschäden zu bewerten, führten wir eine immunhistochemische Analyse der CD73-Expression durch. Die ultrastrukturelle Analyse bestätigte eine Podozytenschädigung als Zytoskelett-Unregelmäßigkeit mit mindestens einer Auslöschung des Fußfortsatzes (Abbildung 1). In unserer negativen Kontrollgruppe ohne Podozytenläsion konnte keine signifikante Podozytenexpression von CD73 nachgewiesen werden, obwohl eine interne Kontrolle (peritubuläre Kapillaren) positiv war, die sich typischerweise positiv färbt (Abbildung 2). Andererseits zeigten Gruppen mit Podozytenschädigung (MCD, FSGS, MGN und Amyloidose) eine statistisch hochsignifikante Hochregulation von Podozyten-CD73 (p < 0.{{1{{20}}}}="" 001);="" der="" signifikante="" anstieg="" war="" auch="" konsistent,="" wenn="" einzelne="" entitäten="" mit="" negativkontrollen="" verglichen="" wurden="" (mindestens="" p="">< 0,001).="" interessanterweise="" war="" das="" ausmaß="" der="" cd73-hochregulierung="" in="" der="" mcd-gruppe="" tendenziell="" niedriger,="" wenn="" auch="" signifikant="" niedriger="" nur="" im="" vergleich="" zu="" mgn-proben="" (p="0.0043)" (abbildung="" 2).="" in="" podozytenschadensgruppen="" gab="" es="" keine="" korrelation="" zwischen="" semiquantitativem="" cd73-score="" und="" proteinurie="" auf="" binärer="" (nephrotischer/nicht="" nephrotischer)="" oder="" quantitativer="" (g/24="" h)="" ebene="" (spearman="" r="−" 0,0807,="" p="0" 0,6302="" und="" spearman="" r="−" 0,076="" bzw.="" p="0" 0,6497="" (abbildung="" 3a).="" insgesamt="" gab="" es="" keine="" korrelation="" zwischen="" dem="" cd73-score="" und="" dem="" kreatininspiegel="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" abbildung="" 3b).="" außerdem="" konnten="" wir="" keine="" signifikante="" korrelation="" zwischen="" cd73-expression="" und="" bluthochdruck="" (spearman="" r="−" 0,03024,="" p="0" 0,8384)="" oder="" diabetes="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0,1784,="" p="" {{45="">
Die Hochregulierung von aus Podozyten stammendem CD73 bei menschlichen glomerulären Erkrankungen korreliert negativ mit der Expression des CCR2-Rezeptors und korreliert nicht mit der Nephrin- und Podocin-ExpressionUnter Berücksichtigung veröffentlichter Daten zur Herunterregulierung der CCR2-Expression von Makrophagen nach einer CD73-Überexpression in einem Stammzellmodell stellten wir die Hypothese auf, dass die Hochregulierung von CD73 während einer Podozytenverletzung umgekehrt mit der Expression von proinflammatorischem CCR2 korreliert, und führten eine immunhistochemische CCR2-Analyse durch. In der Kontrollgruppe konnte keine oder nur geringe Expression von CCR2 nachgewiesen werden, ohne signifikante Abweichung im Vergleich zur CD73-Signatur in denselben Proben. Im Gegensatz dazu war eine meist signifikante Hochregulierung von Oberflächen-CCR2 (allerdings unterschiedlicher Intensität) in der Mehrzahl der Proben aus Podozytenschädigungsbiopsien zu sehen und war im Allgemeinen im Vergleich zur Kontrollgruppe hochreguliert (p=0.0206; ergänzende Abbildung S1). Die Krankheitsgruppen unterschieden sich diesbezüglich nicht signifikant voneinander.
Wir haben ferner eine mögliche Korrelation zwischen den Expressionsintensitäten von CD73 und CCR2 analysiert. Tatsächlich konnte beim Vergleich der CD73- und CCR2-Scores aus der Podozyten-Verletzungsbiopsie-Kohorte eine deutlich negative Korrelation beobachtet werden (Spearman r=− 0.4821, p=0.{{18} }052), (Abbildung 4). Bemerkenswerterweise zeigten Glomeruli mit CD73--positiven Podozyten tendenziell eine reduzierte CCR2-Expression nicht nur in Podozyten, sondern auch in umgebenden Zellen wie Parietalepithelzellen (Abbildung 4). Die inverse Korrelation wurde durch Auswertung der immunfluoreszierenden Co-Färbung für CD73/CCR2 in beschädigten Podozyten durch konfokale Mikroskopie (Spearman r=– 0,4478, p=0,0282) bestätigt (Abbildung 5). Um einen eventuellen Zusammenhang zwischen CD73-Positivität und (Verlust der) podozytenspezifischen Proteinexpression zu untersuchen, führten wir zusätzliche Immunfluoreszenzfärbungen für Nephrin und Podocin durch und bewerteten ihr Expressionsmuster in Kontroll-, MCD- und FSGS-Gruppen (Abbildung 6a) sowie Co-Färbung mit CD73 in Proben mit Podozytenläsion (Abbildung 6b–e). Wir konnten keine signifikante Korrelation zwischen der mittleren Fluoreszenzintensität der Podocin- oder Nephrin-Expression auf der einen Seite und der mittleren Expression von CD73 auf der anderen Seite feststellen (n=39, Spearman r=0.212, p {{33} }.1948 für Podocin und n=60, Spearman r=0.01906, p=0.8851 für Nephrin).
Diskussion
Wir beschreiben hier zum ersten Mal die Expression von CD73 auf der Oberfläche von verletzten Podozyten im MenschenNierenkrankheit. AnalysierenNieren-Biopsien von Patienten mit ausgeprägter Podozytenschädigung wie bei MCD, FSGS, MGN und Amyloidose, berichten wir über eine signifikante Hochregulierung der Podozyten-CD73-Expression in jeder dieser Gruppen im Vergleich zur KontrolleNieren,unabhängig von der Ätiologie der Podozytenschädigung. Darüber hinaus berichten wir über eine inverse Korrelation zwischen CD73- und CCR2-Expression durch Podozyten von Podozyten-Schadensgruppen. Es wurde gezeigt, dass geboostetes Podozyten-spezifisches CCR2 Diabetes vermitteltNierenverletzungbei Mäusen [ 23 ]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Blockade von CCR2 in einem Adriamycin-induzierten Mausmodell von FSGS Proteinurie und glomeruläre Schädigung reduziert [ 24 ]. Eine aktuelle Studie von Lee et al. – ebenfalls unter Verwendung eines Mausmodells – weist darauf hin, dass eine CCR2-Depletion die durch Fettleibigkeit induzierte Albuminurie durch Blockade von oxidativem Stress und Lipidakkumulation verbessern könnte [ 25 ]. Tatsächlich wurde in einem In-vitro-System mit mesenchymalen Stammzellen (MSC) aus murinem Perikardgewebe gezeigt, dass CD73--überexprimierende MSCs reparative Prozesse über entzündungshemmende Aktivität diktieren, neben anderen Faktoren auch aufgrund der Hemmung von CCR{ {9}} positive Makrophageninfiltration [ 13 ]. Angesichts unserer Ergebnisse und veröffentlichten Daten ist es daher verlockend zu postulieren, dass die CD73-Expression durch Podozyten eine schützende Wirkung haben könnteNierenverletzung, möglicherweise über Wege, die CCR2 abschwächen. Die CCR2-Signalgebung steht in engem Zusammenhang mit der Adhäsion und Aktivierung von Makrophagen [ 26 , 27 ]. Da Makrophagen die Pathogenese der Podocytopathie-assoziierten beeinflussen könnenNierenerkrankungen(wie primäres MGN, bei dem die Infiltration von CD68 plus, CCR2 plus Makrophagen als signifikanter Indikator für das Endstadium erkannt wurdeNierenversagen[ 28 ]), weitere Studien zum Zusammenhang zwischen Monozyten-/Makrophagengehalt, Herkunft (infiltrierend vs. resident), Aktivierungsprofilen (M1 – proinflammatorisch vs. M2 – alternativ aktiviert) und CD73-Expression beim MenschenNierenerkrankungsind notwendig, um die Übereinstimmung unserer Ergebnisse mit früheren Daten aus Mausmodellen zu überprüfen.
In einem entzündlichen Mikromilieu, das bei Hypoxie, Ischämie-Reperfusion oder autoimmunen Gewebeschäden zu beobachten ist, setzen mehrere Zellen Mitglieder des purinergen Signalsystems frei, vorwiegend in Form von proinflammatorischem ATP oder ADP [ 29 , 30 ]. In diesen Situationen sind die Ecto-Nukleotidase CD73 und ihr Produkt Adenosin wichtige Faktoren bei der Regulierung und Stummschaltung der Immunantwort. In Tiermodellen hat sich CD73 als schützend erwiesenNiereIschämie-Reperfusionsverletzung und deren Mangel induzierte Podozyten-Dysfunktion, was zu einer Autoimmunentzündung führt undNierenerkrankung[21, 31]. Andere In-vivo-Experimente an Mäusen unter Verwendung von Ischämie-Reperfusionsverletzungen zeigten den wichtigen entzündungshemmenden Einfluss von CD73, das von proximalen tubulären Epithelzellen exprimiert wird, und seine entscheidende Wirkung inNiereSchutz während diabetischer Nephropathie über Adenosin-endothelialen Adora2b-Rezeptor-Signalweg [20,32]. Podozytopathien sind die häufigste Gruppe glomerulärer Läsionen, die zu einer Proteinurie führen. MCD, ein Prototyp einer „primären“ Podozytopathie, ist die häufigste Ursache einer nephrotischen Proteinurie bei Kindern > 1 Jahr [ 33 , 34 ]. Aktuelle Hypothesen zur Pathogenese von MCD deuten auf eine signifikante Rolle von Zytokinen und anderen Immunmediatoren bei der Störung der Integrität der Podozyten-glomerulären Basalmembran hin [ 35 – 38 ]. Die Diskrepanz zwischen dem Fehlen von sichtbaren Veränderungen in der Lichtmikroskopie und schwerer Proteinurie ist das Kennzeichen von MCD; Der elektronenmikroskopische ultrastrukturelle Nachweis einer Podozytenschädigung ist somit eine conditio sine qua non für die bisherige Diagnose einer MCD. Dieser Diagnosealgorithmus unterstreicht die Bedeutung weiterer First-Line-Diagnosetools in diesem Zusammenhang. Die Untersuchung der CD73-Expression, insbesondere bei begrenzter Verfügbarkeit von Elektronenmikroskopie, könnte daher helfen, zwischen glomerulären (dh podozytopathischen) und extraglomerulären (zB tubulären oder paraproteinämischen) Proteinuriequellen zu unterscheiden. Der Vergleich zwischen Immunhistochemie und Immunfluoreszenz in unserer Studie würde für Letzteres sprechen.
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN
Mehrere Veröffentlichungen haben überzeugend eine abweichende Verteilung und den Verlust von Podozyten-spezifischen Proteinen in verschiedenen dokumentiertNierenerkrankungEinstellungen, die Podozytenverletzung und Proteinurie umfassen, wie kürzlich überprüft [ 39 ]. In unserer Studie konnten wir innerhalb der Gruppe mit Podozytenschäden keine signifikante Korrelation zwischen der Intensität der Podocin/Nephrin-Fluoreszenz und der Intensität der CD73-Expression feststellen. Spezifische Einschränkungen schließen jedoch eine pathophysiologische Interpretation der statistischen Daten von Podocin/Nephrin vs. CD73 aus. Zunächst haben wir für die Bewertung der Fluoreszenzintensität Podozyten unter Verwendung der technischen Vergrößerung und des Auflösungsvermögens der konfokalen Mikroskopie ausgewählt. Obwohl diese Bedingungen den Nachweis von Podozytenkörpern leicht ermöglichen, bleiben Hauptfortsätze und insbesondere Fußfortsätze undeutlich und werden daher möglicherweise nicht markiert/analysiert. Zweitens kann die Korrelation zwischen der Expression von CD73 und Podozyten-spezifischen Proteinen in ganzen Glomeruli nicht gerechtfertigt werden: Obwohl eine Bewertung von Podocin und Nephrin auf dieser Ebene legitim wäre (da vernünftigerweise davon ausgegangen werden kann, dass keine anderen glomerulären Zellen diese Proteine exprimieren), kann dies nicht sein für CD73 beansprucht, das zumindest teilweise von Endothelzellen exprimiert wird. Drittens ist die Bewertung der mittleren Fluoreszenzintensität allein als unabhängiger Marker für eine Podozytenschädigung fragwürdig, da sie das pathologische, körnige Verteilungsmuster von Podocin und Nephrin innerhalb des Glomerulus nicht abdeckt, das wir in Abbildung 6 deutlich beobachten konnten. Daher sind wir zurückhaltend das Fehlen von CD73-Podocin- und CD73-Nephrin-Korrelation in unserer Analyse auf divergierende molekulare Wege dieser Marker zurückzuführen. Weitere Podozyten-in-vitro- und Tierstudien sind notwendig, um mögliche Interferenzen zwischen diesen Signalkaskaden zu untersuchen.
Zusammenfassend erkennen wir, dass die kleine Probengröße die Haupteinschränkung unserer Studie ist, und zeigen hier eine konsistente CD73-Überexpression durch verletzte Podozyten und schlagen CD73 als neuen diagnostischen Marker für Podozytopathie vor. Bei der Minimal-Change-Krankheit können unsere Ergebnisse helfen, beschädigte Podozyten zu identifizieren und zu einem weniger zeit- und kostenaufwändigen Diagnoseprozess führen. Darüber hinaus stimmen unsere Ergebnisse mit veröffentlichten Daten aus murinen experimentellen Ansätzen überein und legen eine schützende Wechselwirkung zwischen CD73 und CCR2 beim Menschen naheNierenerkrankung. Weitere multizentrische Studien mit größeren Patientenkohorten sind notwendig, um die Mechanismen der CD73-Signalübertragung beim Menschen zu untersuchenNiereKrankheit und ihr prognostischer Wert. In ähnlicher Weise wären größere Kohortenzahlen erforderlich, um eine potenzielle Korrelation zwischen der Schwere der Erkrankung und der CD73-Expression herzustellen.
Material und Methoden
StudienkohorteInsgesamt 49 in diese Studie eingeschlossene Biopsien von 49 verschiedenen Patienten wurden zwischen dem 1. Januar 2018 und dem 31. Dezember 2019 am Universitätsklinikum Mannheim der Universität Heidelberg diagnostiziert. Weitere Auswahlkriterien waren eine repräsentative Biopsie mit der Möglichkeit zur Durchführung einer Triple-Diagnostik mit Immunhistochemie und EM, adäquate klinische Informationen, eindeutige Diagnose und ausreichendes Material für diese Studie. Alle Patienten waren Erwachsene und Kaukasier. Die Untersuchungen umfassten 39 Biopsien von Patienten mit Podozytenschädigung unterschiedlicher Genese (7 Biopsien von Patienten mit primärer fokaler segmentaler Glomerulosklerose – FSGS; 8 Biopsien von Minimal Change Disease – MCD; 12 von Patienten mit membranöser Glomerulonephritis – MGN; 12 von Patienten mit Amyloidose). Negativkontrollen warenNiereBiopsien von 10 Patienten ohne Podozytenläsion und ohne Proteinurie (6 Patienten mit leichter Nephrosklerose, 2 Patienten mit interstitieller Nephritis und 2 Patienten ohne pathologische Veränderungen). Alle oben erwähnten Biopsien wurden in die Analyse der Podozyten-CD73-Expression eingeschlossen; für CCR2, nach Ausschluss von Paraffinschnitten mit unzureichender Anzahl nicht sklerotischer Glomeruli (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Histologie, Immunhistochemie, Immunfluoreszenz und ElektronenmikroskopieDie 1 um Serienschnitte wurden in Paraffineingebettet durchgeführtNiereBiopsien und gefärbt mit Hämatoxylin/Eosin (H/E), Perjodsäure-Schiff (PAS), Masson-Trichrom-Färbung sowie Standard-Routine-Immunhistochemie für diagnostische Zwecke. Immunhistochemische und immunfluoreszente Färbungen von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Biopsien wurden manuell unter Verwendung von monoklonalem Kaninchen-Anti-Human-CD73-Antikörper (Klon D7F9A, Cell Signaling, Frankfurt am Main, Deutschland) und Maus-monoklonalem Anti-Human-CCR2-Antikörper (Klon 7A7; Abcam, Cambridge, UK), polyklonaler Kaninchen-Anti-Human-Antikörper gegen Nephrin (Abcam, Cambridge, UK) und Kaninchen-Anti-Human-Podocin-Antikörper (Sigma, Saint Louis, MO, USA), gemäß den Protokollen des Herstellers. Alle Biopsien wurden in die Analyse der Podozyten-CD73-Expression durch Immunhistochemie eingeschlossen; für CCR2 Paraffinschnitte mit unzureichender Anzahl nicht sklerotischer Glomeruli (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN
Lichtmikroskopie und morphometrische AnalysenDie Bilderfassung und -analyse erfolgte mit dem PreciPoint Scanning Mikroskop M8 mit Olympus PlanCN 40 × /0.65 Objektiv und MicroPoint Software (v.5 May 2016; PreciPoint, Freising , Deutschland). Die semiquantitative Bewertung der Podozyten-CD73-Oberflächenexpression in der immunhistochemischen Färbung wurde anhand einer Bewertungsskala von 0–3 bewertet (0 – keine Expression; 1 – fokale segmentale Positivität (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 Prozent Podozyten positiv in<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 Prozent Glomeruli). CD73-positive und -negative Podozyten wurden mit einem intensitätsbasierten semiquantitativen Scoring-System (0 – keine Expression, 1 – schwache Expression, 2 – mäßige Expression und 3 – starke Expression, gemäß biopsieinterner CCR2-Positivkontrolle) auf CCR2-Koexpression analysiert. Endothel und infiltrierende Immunzellen). Die Auswertung erfolgte unabhängig voneinander durch zwei Pathologen (SP und ZP) verblindet.
Konfokale MikroskopieBilder von CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) und Zellkernen (DAPI) von Podozyten wurden nacheinander mit dem motorisierten konfokalen Mikroskop Olympus FV1000 aufgenommen, das mit einem HeNe 594 nm ausgestattet war, Argon 488 nm und eine UV-Diode 405 nm Laser und Photomultiplier-Röhren (PMTs), gesteuert von der FluoView-Software, unter Verwendung des 60 × /1,35 UPlanSApo-Objektivs. Die 12--Bit-Bilder mit 512 × 512 Pixelrahmen und einer Pixelgröße von 0,41 µm für Übersichten und 0,10 µm für hohe Auflösung wurden aufgenommen, indem alle Einstellungen am Mikroskop konstant gehalten wurden. Die Bilder wurden mit einem eigens entwickelten ImageJ-Makro halbautomatisch weiterverarbeitet und analysiert (Zugriffsdatum: 15. Dezember 2020). In Kürze wurden die Bilder für einzelne Podozyten segmentiert, ein Schwellenwert angewendet und die mittlere Intensität gemessen, statistisch analysiert und geplottet. Alle Bilder wurden mit konstanten Einstellungen verarbeitet und mit der gleichen Pseudofarbe angezeigt, die für einzelne Kanäle auf zusammengeführten Bildern gleichermaßen linear angepasst wurde
Statistische AnalysenStatistische Analysen wurden mit GraphPad Prismv durchgeführt. 8.4.3 Software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Statistische Unterschiede wurden wie angegeben unter Verwendung von gepaarten oder ungepaarten t-Tests sowie Pearson-Korrelationsanalysen berechnet.