Herausforderungen und Schwierigkeiten bei der Anwendung der CAR-T-Zelltherapie

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Die Immuntherapie mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (chimäre Antigenrezeptor-T-Zelle, CAR-T) besteht darin, aus Patienten oder allogenen Spendern isolierte T-Zellen gentechnisch zu manipulieren, um den chimären Antigenrezeptor (chimären Antigenrezeptor) zu exprimieren. Rezeptor, CAR), eine adoptive Zelltherapie, die Tumorzellen spezifisch erkennt und abtötet. CAR-T ist einer der wichtigsten Durchbrüche auf dem Gebiet der Krebsimmuntherapie in den letzten Jahren. Es hat große Vorteile bei der Behandlung hämatologischer Malignome und breite Entwicklungsperspektiven. Auch die CAR-T-Zelltherapie steht derzeit vor großen Herausforderungen. Die folgenden Inhalte führen Sie dazu, die Herausforderungen der CAR-T-Zelltherapie zu verstehen, die Mechanismen zu identifizieren, die zu Einschränkungen führen, und diese Hindernisse zu überwinden, damit CAR-T-Zellen ihr Potenzial besser entfalten, Behandlungsstrategien optimieren und die Behandlungsergebnisse verbessern können. Mehrere Schlüsselfaktoren, von denen festgestellt wurde, dass sie die Wirksamkeit der CAR-T-Zelltherapie beeinflussen, umfassen die Herstellung von CAR-T-Zellen, das Management toxischer Nebenwirkungen und das Wiederauftreten von Arzneimittelresistenzen.

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1 Problem bei der Herstellung von CAR-T-Zellen

Die Herausforderungen, denen sich die Herstellung von CAR-T-Zellen gegenübersieht, umfassen mehrere Verknüpfungen wie T-Zell-Akquisition, Isolierung und Screening, Transduktion, Kulturexpansion und anfängliche Auswahl des T-Zell-Phänotyps. Durch die Optimierung der Methoden in jedem Glied können CAR-T-Zellprodukte mit höherer klinischer Wirksamkeit und weniger toxischen Nebenwirkungen realisiert werden. Derzeit sind die von der FDA zugelassenen CAR-T-Zellen alle autolog, und es besteht kein Risiko einer allogenen Abstoßung und einer Graft-versus-Host-Erkrankung (GVHD), aber es ist schwierig, sie zu erhalten, und die Zellqualität ist oft nicht verfügbar . Versichern. Die Verwendung von Zellen gesunder Spender zur Herstellung von CAR-T-Produkten ist eine Lösung für das Problem minderwertiger CAR-T-Zellquellen. Frühe klinische Studien haben die Machbarkeit der Verwendung von CAR-T-Zellen aus Spendern bei Patienten mit Krankheitsrückfall nach allogener Transplantation mit einem geringeren Risiko für GVHD gezeigt. Darüber hinaus erleichtern von Spendern stammende T-Zellen die Entwicklung universeller CAR-T-Produkte, was von großer Bedeutung ist, um die bestehenden Probleme unzureichender CAR-T-Zellquellen, schlechter Qualität und langer Produktionszyklen zu überwinden, aber zusätzliche genetische Modifikationen sind erforderlich um das Risiko einer Immunabstoßung und GVHD zu reduzieren. Außerdem enthalten CAR-Strukturen häufig exogene Sequenzen. Aufgrund der schwierigen Herstellung sind die meisten scFvs von CAR-T-Zellen murinen Ursprungs und immunogen. Bei behandelten Patienten wurden humane Anti-Maus-Antikörper gegen scFv nachgewiesen.

Studien haben gezeigt, dass der anfängliche T-Zell-Phänotyp von CAR-T-Zellprodukten eine wichtige Rolle bei späteren klinischen Reaktionen spielt. Spezifische T-Zell-Phänotypen wie zentrale Gedächtnis-T-Zellen, stammähnliche Gedächtnis-T-Zellen und Vorläufer-T-Zellen können die Expansionsfähigkeit und Persistenz von CAR-T-Zellen verbessern. Eine Studie zur CD19--gerichteten CAR-T-Zelltherapie bei CLL-Patienten ergab, dass die CAR-T-Zellpopulation von Respondern im Vergleich zu Non-Respondern eine reichliche T-Zell-bezogene Gedächtnis-Genexpression aufwies. Ein anderes Forschungsteam brachte das CAR-Protein dazu, in einen Ruhezustand überzugehen, indem es die Herunterregulierung des CAR-Proteins durch ein Arzneimittelregulationssystem oder Dasatinib erzwang, wodurch ein gedächtnisähnlicher Phänotyp erhalten wurde, wodurch der Phänotyp und die transkriptionellen Eigenschaften erschöpfter CAR-T-Zellen erfolgreich umgekehrt wurden , und dann die Wiederherstellung der Antitumorfunktion von CAR-T-Zellen.

Darüber hinaus hat auch der Zeitpunkt der Infusion von CAR-T-Zellen einen wichtigen Einfluss auf das Ansprechen auf die Behandlung. Durch die Verkürzung des Produktionszyklus von CAR-T-Zellen durch technologische Optimierung soll die Verzögerung der Erkrankung der Patienten verringert und mehr Patienten davon profitiert werden. Darüber hinaus werden die Gene, die CAR-Strukturen codieren, normalerweise durch Retroviren oder Lentiviren in T-Zellen transduziert, aber mit der Entwicklung von Transposonsystemen ist es wirtschaftlicher, Transposons anstelle von viralen Vektoren für die Produktion von CAR-T-Zellen zu verwenden. Gegenwärtig wurde das Dornröschen-Transposonsystem auf die Herstellung von CD19--gerichteten CAR-T-Zellen angewendet.

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2 Toxizität und Nebenwirkungen der CAR-T-Zelltherapie

Fast alle Patienten, die mit CD19--gerichteten CAR-T-Zellen behandelt wurden, entwickelten toxische Nebenwirkungen unterschiedlichen Ausmaßes, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms (CRS) und des Immuneffektor-assoziierten Neurotoxizitätssyndroms (ICANS) usw., letzteres auch als neurotoxisch bekannt Nebenwirkungen. Die American Society for Transplantation and Cellular Therapy (ASTCT) hat standardisierte Einstufungsempfehlungen für CRS und ICANS entwickelt und veröffentlicht, die für das Management und die Behandlung von CAR-T-Toxizität von grundlegender Bedeutung sind.

Die klinischen Symptome von CRS beginnen oft mit Fieber, und schwere Fälle können zu einer systemischen Entzündungsreaktion, Hypotonie, Hypoxie und Organversagen führen. ICANS manifestiert sich hauptsächlich als toxische Enzephalopathie, schwere Fälle können zu Krampfanfällen, Hirnödemen und Koma führen. Die meisten Patienten mit ICANS hatten eine Vorgeschichte von CRS, was darauf hindeutet, dass CRS als ein auslösender Faktor oder fördernder Faktor für ICANS fungieren kann. Wenn die frühen Symptome von CRS und ICANS erkannt und effektiv interveniert werden können, ist der klinische Verlauf beider reversibel, aber schwere CRS und ICANS können tödlich sein. Das Verständnis der pathophysiologischen Mechanismen von CRS und ICANS ist hilfreich für die Entwicklung zielgerichteter Medikamente zur Unterdrückung der Toxizität von CAR-T-Zellen auf der Grundlage, dass die Anti-Tumor-Aktivität von CAR-T-Zellen so weit wie möglich erhalten bleibt. CRS ist mit erhöhten Spiegeln verschiedener Zytokine verbunden, unter denen IL-6 ein wichtiges Immunmolekül ist, das CRS vermittelt. Tocilizumab, das den IL-6-Rezeptor blockiert, ist derzeit die Hauptbehandlung für CRS. Präklinische Studien haben gezeigt, dass CRS durch ein multizelluläres Netzwerk aus CAR-T-Zellen und Wirtszellen ausgelöst wird, wobei das Monozyten-Makrophagen-System eine zentrale Rolle im Aktivierungsprozess spielt. IL-1 ist eines der wichtigsten Zytokinprodukte des Monozyten-Makrophagen-Systems und kann an der treibenden Verbindung von CRS beteiligt sein, und die Blockierung dieses Ziels ist wirksam bei der Linderung von CRS. TNF, Interferon- (IFN-), Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und andere entzündungsfördernde Zytokine sind ebenfalls am Prozess von CRS beteiligt, der das Ziel des Potenzials sein könnte. Derzeit wird CRS mit niedrigem Schweregrad hauptsächlich mit fiebersenkenden und unterstützenden Behandlungen behandelt, und andere Komplikationen, die zu Fieber führen können, wie z. B. Infektionen, werden aktiv verhindert. Bei mittelschwerer bis schwerer CRS wird im Allgemeinen Tocilizumab verwendet, und Steroide werden je nach Zustand des Patienten selektiv als adjuvante Therapie eingesetzt, und die Wirkung ist signifikanter. Bei Patienten mit schwerer CRS werden im Allgemeinen Steroide verwendet, um die Proliferation und Zytokin-Sekretion von CAR-T-Zellen und anderen "begleitenden" Zellen zu hemmen. Es sollte beachtet werden, dass Steroide nicht in hohen Dosen verwendet werden können und ihre hemmende Wirkung auf das Immunsystem zu einer Verringerung der Wirksamkeit von CAR-T führt. Einige niedermolekulare Inhibitoren wie Ruxolitinib und Ibrutinib können die Produktion und Signalübertragung verschiedener Zytokine umfassend hemmen und an mehrere Ziele binden, wodurch die Immunfunktion von CAR-T-Zellen reguliert und Nebenwirkungen reduziert werden.

Der Mechanismus von ICANS kann mit der Akkumulation von CAR-T-Zellen und entzündungsfördernden Zytokinen im zentralen Nervensystem zusammenhängen. Präklinische Studien haben eine Korrelation zwischen der Anzahl von CAR-T-Zellen im Liquor cerebrospinalis und dem Zytokinspiegel und dem Schweregrad von ICANS beobachtet. Die Inzidenz von ICANS bei CD19--gerichteter CAR-T-Therapie ist höher als bei CD22--gerichteter CAR-T-Zelltherapie, was daran liegen könnte, dass CD19 in medialen Belegzellen des menschlichen Gehirns exprimiert wird. Die klinische Behandlungsmethode für ICANS-Patienten besteht darin, Steroide zu verabreichen, und die Dosierung sollte die niedrigste sein, um die Auswirkungen auf die Wirksamkeit von CAR-T und eine ernsthafte Immunsuppression zu vermeiden. Tocilizumab hat gute Ergebnisse bei der Behandlung von CRS erzielt, aber seine Wirkung auf ICANS ist sehr begrenzt, was möglicherweise mit seiner Schwierigkeit zusammenhängt, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren.

Toxische Nebenwirkungen sind derzeit ein wichtiger Faktor, der die Wirksamkeit von CAR-T einschränkt und die Verstärkung der Antitumorwirkung von CAR-T-Zellen durch Erhöhung der Dosis von CAR-T-Zellen oder Verstärkung der Effektoraktivität behindert. Es wird angenommen, dass eine hohe Tumorlast, fortgeschrittenes Alter und eine hochintensive lymphodepletierende Präkonditionierung mit dem Auftreten von immuntoxischen Nebenwirkungen assoziiert sind. Mit der Zunahme der Behandlungsfälle und der Verlängerung der Nachbeobachtungszeit traten mehr toxische Nebenwirkungen und Nebenwirkungen auf, wie z Hirnödem usw. Bestehende Studien haben ergeben, dass das Hinzufügen von Suizidgenen wie induzierbarer Caspase -9 oder Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase zu CAR ein möglicher Weg ist, die zytotoxischen Nebenwirkungen von CAR-T zu reduzieren, aber das wird es verursachen eine irreversible Clearance von CAR-T-Zellen und verringern die Resistenz. Tumorwirksamkeit.

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3 Rezidiv der Arzneimittelresistenz nach CAR-T-Zelltherapie

Obwohl CAR-T-Zellen große Durchbrüche bei der Behandlung hämatologischer Malignome erzielt haben, liegt die Rückfallrate bei Patienten, die eine CD19--gerichtete CAR-T-Zelltherapie erhalten, bei 30 bis 50 % der Rückfälle treten 12 Jahre nach der Behandlung auf. innerhalb eines Monats. Diese Art von Rückfall betrifft jedoch nicht nur das CD19-Ziel, und verwandte Studien zu anderen Zielen wie CD22 und BCMA haben auch gezeigt, dass ein arzneimittelresistenter Rückfall eine große Herausforderung darstellt, mit der die CAR-T-Zelltherapie häufig konfrontiert ist. Gegenwärtig werden Rückfallereignisse üblicherweise in Antigen-negative Rückfälle und Antigen-positive Rückfälle unterteilt.

Der primäre Mechanismus eines Antigen-negativen Rückfalls ist ein Antigenverlust. Gegenwärtig anerkannte Mechanismen des Antigenverlusts umfassen Spleißmutationen, kryptische Epitope und Änderungen der Zelllinie aufgrund des Verlusts von Zielepitopen. Aber selbst wenn das Antigen nicht vollständig verloren geht, reicht eine verringerte Antigenexpression oder -dichte durch Immunmodulation aus, um Tumorzellen zu entkommen. In einer klinischen Studie mit CD22--gerichteten CAR-T-Zellen zur Behandlung von Leukämiepatienten wurde festgestellt, dass Leukämiepatienten mit positiven Antigenen einen Rückfall erlitten, was darauf hindeutet, dass die Aufrechterhaltung der CAR-T-Zellaktivität die minimale Antigenexpressionsschwelle erreichen muss . Es wird erwartet, dass kombinatorische, multimolekular zielgerichtete CAR-T-Zellen das Entweichen von Tumorzellen aus Antigenverlust- oder Herunterregulationsmechanismen überwinden. Für Patienten, die nach einer CD19--gerichteten CRA-T-Zelltherapie einen Rückfall erleiden, ist CD22 ein ideales Ziel, da die meisten CD19--negativen Patienten positiv für die CD22-Expression bleiben. In klinischen Studien waren CAR-T-Zellen, die auf CD22 abzielen, bei der Behandlung von Patienten mit CD19--negativem B-Zell-Lymphom und rezidivierender Leukämie wirksam, aber im Verlauf der sequentiellen Immuntherapie kam es zu einem Rezidiv der Arzneimittelresistenz, das durch Herunterregulierung von verursacht wurde CD22-Expression durch Tumorzellen wurde ebenfalls gefunden. Daher könnte die Entwicklung von CAR-T-Zellen, die gleichzeitig auf CD19 und CD22 abzielen, ein größeres Potenzial zur Überwindung von Arzneimittelresistenzen haben. Neben der Auswahl der Zielantigene muss auch auf den genauen Mechanismus von CAR-T bei der Bildung von Immunsynapsen und der Abtötung von Zielzellen geachtet werden. Natürliche TCRs können Antigene mit niedriger Dichte erkennen, und es wird spekuliert, dass strukturelle Unterschiede zwischen CARs und natürlichen TCRs zu unterschiedlichen Anforderungen an die Antigenerkennungsdichte führen können.

Es ist erwähnenswert, dass nicht alle rezidivierten Patienten CD19-negativ sind, was auch zeigt, dass es neben dem Antigenverlust und dem Entweichen von Tumorzellen noch andere Faktoren gibt, die zu einer CAR-T-Resistenz führen. Die Hauptursache für einen Antigen-positiven Rückfall ist die Erschöpfung der CAR-T-Zellen, die aufgrund der langfristigen Exposition gegenüber hohen Antigenspiegeln zu einer Abnahme der Selbstfunktion führt. Es wird allgemein angenommen, dass die Antigen-unabhängige Signaltransduktion von CAR-T-Zellen eng mit der Zellerschöpfung zusammenhängt, und eine hohe Tumorlast ist auch ein wichtiger Faktor, der zur Erschöpfung führt. Die Immun-Checkpoint-Blockade-Technologie in Kombination mit CAR-T-Zellen ist vielversprechend bei der Überwindung der Erschöpfung und der Verbesserung des Effektors und der Persistenz von CAR-T-Zellen. Die Koexpression des IL-7-Rezeptors mit CAR kann die Stimulierung von "Zuschauer"-Zellen vermeiden und die Proliferationsfähigkeit, Antitumoraktivität und Persistenz von CAR-T-Zellen verbessern. Die CAR-Struktur von CAR-T-Zellen enthält fremde Komponenten, die immunogen sind und eine humorale und zelluläre Anti-CAR-Immunität induzieren können, wodurch die Wirksamkeit eingeschränkt und die Proliferationsfähigkeit und Persistenz von CAR-T-Zellen beeinträchtigt wird. Studien haben gezeigt, dass 5 Prozent der DLBCL-Patienten und 36,7 Prozent der B-ALL-Patienten nach der Infusion von CAR-T-Zellen erhöhte Anti-CAR-Antikörperspiegel aufweisen. Die Vorbehandlung mit Cyclophosphamid oder Fludarabin gilt als wichtiger Faktor bei der Verringerung des Grades der zellulären Anti-CAR-Immunität. Die Entwicklung humanisierter CAR-T-Produkte ist ein wirksames Mittel zur Lösung dieses Problems, das in klinischen Studien eine dauerhafte Wirksamkeit bei rezidivierter/refraktärer B-ALL gezeigt hat. Die costimulatorische Domäne in der CAR-Struktur beeinflusst auch die Persistenz von CAR-T-Zellen. Es wird allgemein angenommen, dass von CD28- abgeleitete CARs im Vergleich zur kostimulatorischen Domäne von 4-1BB weniger haltbar und anfälliger für Erschöpfung sind; wohingegen CAR-T-Zellen, die die costimulatorische Domäne 4-1BB enthalten, höhere Konzentrationen der anti-apoptotischen Proteine ​​BCL-2 und BCL-XL aufweisen, und es möglicherweise einen Mechanismus gibt, der die Bildung von Gedächtnis-Phänotyp-T-Zellen fördert. Verbesserungen, die sich derzeit in klinischen Studien befinden, umfassen die Verwendung künstlicher Antigen-präsentierender Zellen zur Aktivierung von CAR-T-Zellen, die Regulierung von CAR-T-Phänotypen und die kombinierte Hemmung von Immun-Checkpoint-Molekülen. Auf die Ergebnisse darf man gespannt sein.

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