Kapitel 2: Der Krupp-ähnliche Faktor 15 unterdrückt die renale glomeruläre mesangiale Zellproliferation über die Verstärkung der P53-SUMO1-Konjugation

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3. ERGEBNISSE

3.1|Screening von KLF15--bindenden Genen durch ChIP-Seq in primären renalen glomerulären MCs

Um die Gene der direkten Bindungspartner von KLF15 zu identifizieren, haben wir eine ChlP-Seq-Analyse durchgeführt und schließlich 2478 Gene gescreent. Die GO-Analyse dieser Gene durch das Tool auf der Website www.uniprot.org (Abbildung 1A, B) enthüllte molekulare Funktionsterme, die mit 1941 Genen assoziiert sind, zelluläre Komponententerme, die mit 1662 Genen zusammenhängen, und biologische Prozessterme, die mit 1766 Genen zusammenhängen. Da es unser Ziel war herauszufinden, wie KLF15 MCs beeinflusst, konzentrierten wir uns auf zellprozessbezogene Gene. Unter den 1315 Zellprozess-bezogenen Genen wurden 74 Gene gefunden, die an Zellzyklusprozessen beteiligt sind; Insbesondere waren diese Gene am mitotischen Zellzyklus, dem Phasenübergang des Zellzyklus und anderen Prozessen beteiligt (Abbildung 1C, D). Darüber hinaus analysierten wir die am Wachstum beteiligten Gene und stellten fest, dass sie mit Entwicklungswachstum, Zellwachstum und anderen Arten von Wachstum zusammenhängen (Abbildung 1E).

3.2|Screening unterschiedlich regulierter Gene in KLF15--überexprimierenden glomerulären Nieren-MCs mit SILAC und LC/MS

Die SILAC- und LC/MS-Analyse von HRMCs, die KLF15 im Vergleich zu Elternzellen überexprimieren, führte zur Identifizierung von 1357 Proteinen. Wir haben DAVID und IPA verwendet, um die GO-Domänen und angereicherten Wege der quantifizierten Proteine ​​zu erwerben, die von SILAC identifiziert wurden. Interessanterweise gehörten die biologischen funktionsbezogenen Begriffe vieler Proteine ​​zu den Top 30 der signifikant angereicherten GO-Begriffe, einschließlich der Regulation des zellulären Aminosäurestoffwechsels, des Proteasomkomplexes, der Proteinbindung sowie der Transkriptions- und Translationsbegriffe, die alle eng miteinander verwandt sind Ubiquitinierung (Abbildung 2A). Abbildung 2B zeigt die Top 30 der signifikant angereicherten Pathway-Terme. Mehrere biologische Prozessbegriffe, einschließlich der Begriffe Proteasom und neurodegenerative Erkrankungen, wurden ebenfalls mit Ubiquitination in Verbindung gebracht.

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3.3|Bioinformatische Analyse von KLF15--bindenden Genen, die potenziell mit der renalen glomerulären MC-Proliferation assoziiert sind

Um die KLF15--Bindungsgene zu untersuchen, die möglicherweise damit assoziiert sindNieren glomerulärMC-Proliferation führten wir eine bioinformatische Analyse der ChIP-Seq-Daten und der SILAC-LC/MS-Daten durch. Zweiundfünfzig Gene wurden gescreent (Tabelle 2 und Abbildung 2C), und fünf dieser Gene, einschließlich SUMO1, Makrophagenmigrations-Hemmfaktor (MIF), Eukaryotischer Initiationsfaktor (EIF), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF) und Reticulocalbin (RCN). ), eng verwandt warenZellvermehrung. Da die GO- und Pathway-Analysen der differentiell exprimierten Proteine ​​darauf hindeuteten, dass die gescreenten Gene hauptsächlich mit dem Ubiquitinierungsprozess zusammenhängen, folgerten wir, dass SUMO1, ein Mitglied der Familie der Ubiquitin-ähnlichen (UBL) Proteine, an der posttranslationalen Modifikation ähnlich beteiligt ist wie Ubiquitinierung als Zielgen von KLF15.

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass HG einer der Hauptfaktoren ist, die die Entwicklung einer diabetischen Nephropathie induzieren, und dass es die MC-Proliferation und eine erhöhte Matrixsynthese in vitro fördert.25 Eine frühere Studie hat gezeigt, dass PDGF-BB für die MC-Proliferation vor der Entwicklung wesentlich ist von Glomerulosklerose bei experimenteller Glomerulonephritis.26 Nachdem wir bestätigt hatten, dass MCs durch HG oder PDGF-BB in vitro stimuliert wurden, entdeckten wir Veränderungen in der Expression von KLF15 und SUMO1 sowohl auf der RNA als auch auf dem Protein

Ebenen und fanden heraus, dass diese Moleküle ähnliche Trends aufwiesen (Abbildung 2D-l). Schließlich bestimmten wir SUMO1 als Zielgen von KLF15.

3.4|KLF15 reguliert die SUMO-1-Genexpression hoch, indem es an eine 16 bp große CACCCA-SUMO-1-Promotorregion und ein C-plus-A-reiches Motiv bindet

Wir haben die MEME-Suite (http://meme-suite.org/tools/meme) verwendet, um die KLF15--Bindungsmotive der 52 gescreenten Gene aus den KLF15-ChlP-Seq-Daten zu charakterisieren und das KLF-Bindungsmotiv zu identifizieren (Abbildung 3A). Darüber hinaus haben wir mehr als tausend Basen stromaufwärts des SUMO1-Promotors weiter analysiert und festgestellt, dass KLF15 eine 16-bp-Sequenz (Nukleotide -205 ~ -199) erkennen und daran binden kann, einschließlich - CACCCA-(Abbildung 3B).ChIP-PCR bestätigte, dass KLF15 an den SUMO1-Promotor gebunden ist, und die Ergebnisse zeigten eine signifikant höhere Expression von SUMO1 in der Anti-KLF15-Antikörpergruppe als in der Hintergrundkontrollgruppe (Abbildung 3C).

Darüber hinaus führten wir einen Dual-Luciferase-Reporter-Assay durch, um die Targeting-Beziehung zwischen SUMO1 und KLF15 zu bestätigen. Die Wildtyp-SUMO1-Promotorgruppe zeigte eine höhere Luciferase-Aktivität als der pGL3-Vektor und Mutantengruppen in HRMCs, und die Aktivität wurde durch Überexpression von KLF15 signifikant erhöht. Die Steigerungen der Luciferase-Aktivität wurden durch Transfektion mit einem Plasmid, das die mutierte Promotorregion exprimiert, rückgängig gemacht (Fig. 3D). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass SUMO1 ein direktes Transkriptionsziel von KLF15 ist.

3.5 |Screening von P53 als SUMOylierungssubstrat von SUMO1

SUMO-Modifikationen sind weit verbreitete posttranslationale Modifikationen in Eukaryoten. Die reversible Konjugation dieser Modifikationen an Substratproteine ​​ist auch als SUMOylierung bekannt, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Funktionen der Zielproteine ​​spielt und ferner an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt ist, wie z. B. nukleozytoplasmatischer Transport, Transkriptionsregulation, Apoptose, Proteinstabilisierung, Stressreaktionen und Zellzyklusprogression.27 Um die direkt von SUMO1 konjugierten nachgeschalteten Signalmoleküle zu untersuchen, führten wir eine Netzwerkanalyse von SUMO1 unter Verwendung der IPA-Datenbank durch, und die Daten zeigten, dass SUMO1 unter anderem direkt mit P53, APP, JUN und AKT konjugieren konnte Proteine ​​(Abbildung 4A-C). Wir haben zunächst P53 als nachgeschaltetes Molekül von SUMO1 ausgewählt, weil es ein bekanntes Protein ist, das eng mit der Zellproliferation verwandt ist.28.29 Darüber hinaus verwendeten wir die SUMOsp-Software, um die möglichen SUMOylierungssequenzen von P53 in verschiedenen Arten vorherzusagen, und fanden heraus, dass P53 die SUMOylierungssequenz hatte（ Abbildung 4D）. Um zu bestimmen, ob P53 tatsächlich durch SUMOylierung modifiziert wird, haben wir HRMCs vorübergehend mit einem SUMO1-Überexpressionsplasmid oder SUMO1-siRNA transfiziert. Sowohl die IP- als auch die Western-Blot-Ergebnisse zeigten Trends bei den Expressionsänderungen von SUMO1-P53 und P53, die mit den Änderungen übereinstimmten in SUMO1 (Abbildung 4E-J). Diese Daten zeigen, dass P53 ein SUMOylierungssubstrat von SUMO1 ist.

3.6 |KLF15 hemmt die MC-Proliferation, indem es die SUMO1-Expression und die P53-SUMOylierung fördert

Um die Regulation der P53-SUMOylierung und MC-Proliferation durch KLF15 und SUMO1 zu etablieren, intervenierten wir mit der KLF15- oder SUMO1-Expression in HRMCs und behandelten HRMCs mit PDGF-BB. Unter den mit PDGF-BB behandelten HRMCs zeigten mit dem KLF15-Überexpressionsplasmid transfizierte Zellen eine höhere Expression von SUMO1-P53, P53, KLF15 und SUMO1 als mit dem KLF15-Kontrollplasmid transfizierte Zellen. Dieselben Veränderungen in SUMO1-P53, P53 und SUMO1 wurden in den mit SUMO1-Überexpressionsplasmid transfizierten Zellen gefunden, während die KLF15-Expression in diesen Zellen unverändert war (Abbildung 5A-F). PDGF-BB ist einer der wirksamsten bisher beschriebenen Wachstumsfaktoren von MCs, und es wurde eine proliferative Reaktion von HRMCs auf PDGF-BB beobachtet. Wie in Fig. 5G, H gezeigt, wurde der Prozentsatz an EdU-positiven Zellen durch die Verabreichung von rekombinantem PDGF-BB signifikant erhöht. Die EdU-Färbungsergebnisse zeigten, dass sowohl die KLF15- als auch die SUMO1-Überexpression die PDGF-BB-induzierte Zellproliferation hemmte (Abbildung 5G, H).

Um weitere Einblicke in die Rolle von KLF15 und SUMO1 in proliferierenden HRMCs zu gewinnen, transfizierten wir Zellen nur mit SUMO1-siRNA oder cotransfizierten sie mit SUMO1-siRNA und einem KLF15-Überexpressionsplasmid. Die Herunterregulierung von SUMO1 hatte keinen Einfluss auf die Expression von KLF15, aber die Expressionsniveaus von SUMO1-P53 und P53 waren nach der SUMO1-siRNA-Transfektion offensichtlich verringert (Abbildung 6A-C). Wenn die Expression von SUMO1 gehemmt wurde, wurden außerdem die SUMO1-P53- und P53-Expressionsniveaus auch in Zellen unterdrückt, die KLF15 überexprimieren (Abbildung 6D-F). Dann wurde die MC-Proliferation unter Verwendung eines EdU-Färbeassays bewertet. SUMO1-RNAi verstärkte die proliferative Wirkung von PDGF-BBon HRMCs, und die mit dem KLF15-Überexpressionsplasmid und SUMO1-siRNA cotransfizierte Gruppe hatte mehr EdU-positive Zellen als die mit dem Überexpressionsplasmid und der Hybridsequenzkontroll-siRNA cotransfizierte Gruppe (Abbildung 6G, H). . Wir schließen daher, dass KLF15 die MC-Proliferation unterdrückt, indem es die P53-SUMOylierung verstärkt.

3.7|Die globale SUMO1- und P53-Expression in glomerulären MCs korreliert negativ mit der MC-Proliferation bei Ratten-Thy-1-Nephritis

Anti-Thy1-Nephritis ist ein klassisches Modell einer selbstlimitierenden mesangialen proliferativen Glomerulonephritis mit einer proliferativen Phase und einer Erholungsphase. Wir haben Wistar-Ratten einen Thy1-Antikörper injiziert, um dieses Modell zu erstellen. Sowohl Serum-Harnstoff-Stickstoff als auch Kreatinin zeigen keine signifikante Veränderung zwischen Kontrollratten und den Modellratten (Abbildung S1). Während der Proliferationsphase (Tage 5 und 7) wurden bei den Modellratten eine deutliche mesangiale Proliferation und ECM-Akkumulation beobachtet, und die Anzahl der MCs nahm während der Erholungsphase am Tag 10 ab (Abbildung 7A). Wir haben auch die Expressionsänderungen im Zellproliferationsmarker PCNA durch IHC nachgewiesen (Abbildung 7A, B). Die PCNA-Spiegel waren am Tag 5 erhöht, erreichten am Tag 7 ihren Höhepunkt und nahmen am Tag 10 ab (Abbildung 7F). Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Proteinexpression von P53, SUMO1 und KLF15 in isolierten Glomeruli in den Modellgruppen niedriger war als in der Kontrollgruppe (Abbildung 7C, D), was mit den immunhistochemischen Ergebnissen übereinstimmt (Abbildung 7E, F). Diese Ergebnisse zeigen, dass die abnormale Proliferation von MCs in Anti-Thy1-Modellratten mit der Expression von KLF15 und SUMO1 auf niedrigem Niveau zusammenhängt. Es wird erwartet, dass die Störung der Expression dieser Moleküle den pathologischen Phänotyp bei Ratten mildert.

4. DISKUSSION

DasGlomerulisind die Filtereinheiten derNiere. Eine Störung der glomerulären Funktion kann durch eine primäre glomeruläre Pathologie verursacht werden oder sekundär zu systemischen Erkrankungen sein. Mesangiale Veränderungen wurden nach einer glomerulären Verletzung beobachtet, einschließlich einer Hyperproliferation von MCs, gefolgt von einer übermäßigen Produktion von ECM (mesangiale Expansion) und einer Produktion von Chemoattraktoren für Entzündungszellen. Daher ist die Modulation von MC-Antworten, insbesondere der abnormalen Proliferation, ein neuer therapeutischer Ansatz. KLF15 ist ein Protein, das als Transkriptionsfaktor eine regulatorische Rolle spielt, indem es an spezifische DNA-Sequenzen bindet. Viele Studien haben berichtet, dass KLF15 an der Regulation der Zellproliferation beteiligt ist. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass KLF15 an der Hemmung von MC-Proliferations-bezogenen Signalwegen beteiligt ist,15,30 aber sein direktes Zielgen wurde nicht in der Literatur beschrieben. Daher umfasste diese Studie hauptsächlich ein gemeinsames Screening von Transkriptions- und Translationsebenen, um das direkte Zielgen von KLF15 zu identifizieren.

KLF15 reguliert verschiedene Gene in verschiedenen Arten und in verschiedenen Geweben und Organen. Im Prozess der Regulierung der Proliferation von MCs beeinflusst KLF15 die Expression mehrerer Gene und ist an mehreren Signalwegen beteiligt.131,32 Um die direkten Zielgene von KLF15 zu untersuchen, verwendeten wir ChIP-Seg. Klein RH und seine Kollegen verwendeten ChlP-seq Technologie, um die Regulation von KLF7 auf die Differenzierung von Hornhautepithelzellen zu untersuchen.33 Ying M et al. verwendeten diese Technik, um die hemmende Wirkung von KLF9 auf die Pluripotenz von Glioblastomen zu untersuchen.34Im Vergleich zum ChlP-Chip ermöglicht ChIP-Seq eine echte Gesamtgenomanalyse mit höherer Auflösung, höherer Nachweisempfindlichkeit und geringerem Bedarf an Probengröße.35 Wir verwendeten ChP, um die direkt von KLF15 gebundenen DNA-Fragmente zu erhalten, und nach Vergleich und Analyse mit GenBank durchsuchten wir 2478 mögliche Zielgene. Durch GO- und Pathway-Analysen identifizierten wir viele Zielgene, die am Zellzyklus und an Proliferationsprozessen beteiligt sind.

ChlP-Seq-Experimente erfordern eine PCR zur Amplifikation des Detektionssignals, und ein gewisses Maß an Verzerrung während des Amplifikationsprozesses ist unvermeidlich. Darüber hinaus erhält ChIP-Seq nur die Gene, die KLF15 binden kann, und zeigt nicht die Änderungen an, die bei der Expression dieser Gene auftreten, wenn sich die Expression von KLF15 ändert. Wir haben die SILAC-LC/MS-Proteomikanalyse verwendet, um diese Mängel auszugleichen. Diese Technik liefert Informationen über alle Proteine, deren Expression sich bei Regulierung durch KLF15 ändert, einschließlich der Proteine, die direkt durch KLF15 reguliert werden, und der Proteine, die indirekt reguliert oder posttranslational modifiziert werden. HRMCs wurden unter Verwendung von SILAC kultiviert, und KLF15 wurde in den Zellen durch Plasmidtransfektion überexprimiert. Die Proteine ​​wurden für den LC/MS-Nachweis gesammelt und 1357 differentiell exprimierte Proteine ​​wurden erhalten. GO- und Pathway-Analysen zeigten, dass einige der differentiell exprimierten Proteine ​​an der Ubiquitinierung beteiligt waren. Die Gen- und Proteindaten wurden geschnitten. Die Gene, die nicht mit dem Forschungszweck in Zusammenhang stehen, und Gene, die nicht direkt von KLF15 reguliert werden, wurden entfernt; schließlich wurden 52 Gene gescreent. Unter diesen wurden die fünf Gene mit den offensichtlichsten Expressionsunterschieden ausgewählt, die am engsten mit der Proliferation in Verbindung standen. Angesichts der kombinierten Ergebnisse von Pathway-Analyse, SUMO1- und KLF15-Expressionsanalyse in proliferierenden HRMCs, ChlP-PCR und Dual-Luciferase-Reporter-Assays wurde das Protein SUMO1 als Zielgen von KLF15 ausgewählt.

Zusätzlich zu Ubiquitin werden immer mehr UBL-Proteine,3637 einschließlich SUMO,38 neurale Vorläuferzellen-exprimiertes, entwicklungsbedingt herunterreguliertes 8(NEDD8)3940 und Interferon-stimuliertes Gen 15(ISG15),41 identifiziert. Diese modifizierenden Proteine ​​regulieren wirkungsvoll eine Vielzahl biologischer Prozesse. Die kovalente Addition von SUMO an Substrate, SUMOylierung genannt, ist eine posttranslationale Modifikation, die an einer Reihe von zellulären Prozessen beteiligt ist, darunter nuklear-zytosolischer Transport, Transkriptionsregulation, Apoptose, Kontrolle der Proteinstabilität, Stressreaktionen und Fortschreiten des Zellzyklus.27 SUMO ist typisch Es ist an Akzeptorlysinreste von Proteinsubstraten mit einer Konsensussequenz gebunden und trägt zur Regulation von Protein-Protein-Wechselwirkungen sowie zur subzellulären Kompartimentierung und Proteinstabilität bei.2 sUMO1 kann als Mitglied der SUMOS-Familie die Zellproliferation durch Modifikation des Substrats beeinflussen und stabilisierende zellzyklusregulierende Proteine.43 Daher konzentrierten wir uns in Kombination mit dem Literaturbericht und den umfassenden Screening- und Analyseergebnissen darauf, wie KLF15 die Wirkung von SUMO1 auf die Proliferation von Mesangialzellen reguliert.

Um die Substrate von SUMO1 zu identifizieren, führten wir eine Netzwerkanalyse von SUMO1 unter Verwendung der IPA-Datenbank und der SUMOsp-Software durch. In Kombination mit veröffentlichten Forschungsergebnissen zu P53 deuteten unsere ersten Screening-Daten darauf hin, dass P53 ein nachgeschaltetes Molekül von SUMO1 mit der SUMOylierungssequenz YKxD/E ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass P53 ein Substrat der SUMOylierung war,45 und eine verstärkte P53-SUMO1-Konjugation förderte die Stabilität und Aktivität von P53 und induzierte Alterung.46 In unserer Studie erzeugte eine Störung der Expression von SUMO1 in HRMCs die gleichen Änderungstrends in SUMO1-P53 und P53, was anzeigt, dass P53 ein SUMOylierungssubstrat von SUMO1 war.

Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass SUMOylierung und De-SUMOylierung bei zahlreichen nephropathischen Erkrankungen, wie z. B. Nierendysgenese, Nierenkarzinom, glomerulären Erkrankungen, Podozytenapoptose und Hypertonus des Nierenmarks, akuter Nierenschädigung und Nephrolithiasis, eine Rolle spielen.7-51 Zur Klärung der Beziehung zwischen KLF15, SUMO1, P53 SUMOylierung und MC-Proliferation, führten wir eine Reihe von Transfektionsbehandlungen an Zellen durch, die einer PDGF-BB-induzierten Proliferation unterzogen worden waren. Die Überexpression von KLF15 regulierte die Expression von SUMO1 hoch, während die Überexpression von SUMO1 die Expression von KLF15 nicht beeinflusste. Die Überexpression von entweder KLF15 oder SUMO1 erhöhte die SUMOylierung von P53 und antagonisierte die durch PDGF-BB induzierte Zellproliferation. Wenn die Expression von SUMO1 gehemmt wurde, wurde auch die SUMOylierung von P53 gehemmt und KLF15 verlor seine antagonistische Wirkung auf die Zellproliferation. In vivo. die Proliferation von MCs nahm mit Verschlimmerung der mesangialen proliferativen Nephritis allmählich zu, während die Expression von KLF15, SUMO1 und P53 signifikant abnahm. Unter Berücksichtigung der integrierten Beobachtungen in Zellen und Geweben schließen wir vorläufig, dass KLF15 die SUMOylierung von P53 durch SUMO1 reguliert und dadurch die MC-Proliferation hemmt.

5. SCHLUSSFOLGERUNGEN

Einige Studien haben gezeigt, dass KLF15 eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Vermehrung von MCs spielt. In dieser Arbeit untersuchten wir die Mechanismen der Unterdrückung der MC-Proliferation, die durch diesen Transkriptionsfaktor vermittelt wird. Wir identifizierten SUMO1 als primäres Ziel von KLF15 in MCs über bioinformatische Analysen mit ChIP-Seq und SILAC-LC/MS. Außerdem stellten wir mit Hilfe der IPA-Datenbank und der SUMOsp-Software fest, dass P53 ein direktes Substrat von SUMO1 war. In-vitro- und In-vivo-Experimente bestätigten, dass KLF15 die Expression von SUMO1 fördern und die SUMOylierung von P53 dann die Proliferation von MCs hemmen könnte (Abbildung S2). Diese Ergebnisse tragen zum Verständnis der regulatorischen Rolle von KLF15 bei der MC-Proliferation bei und liefern eine theoretische Grundlage für die Suche nach neuen Behandlungen für MC-Proliferations-bedingte Nierenerkrankungen.