Die zirkuläre RNA CircDVL1 hemmt das Fortschreiten des klarzelligen Nierenzellkarzinoms über die MiR-412-3p/PCDH7-Achse

Abstrakt

Das klarzellige Nierenzellkarzinom (ccRCC) ist ein primärer Nierenkrebs mit einem sehr aggressiven Phänotyp und einer extrem schlechten Prognose. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass zirkuläre RNAs (circRNAs) eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Entwicklung verschiedener Krebsarten beim Menschen spielen. Allerdings bleiben die Expression, die klinische Bedeutung und die regulatorische Rolle von circRNAs beim ccRCC weitgehend unklar. Hier berichten wir, dass circDVL1 in den Seren und Geweben von ccRCC-Patienten reduziert ist und negativ mit malignen ccRCC-Merkmalen korreliert. Eine Überexpression von circDVL1 hemmt die Proliferation, induziert einen G1/S-Stillstand, löst Apoptose aus und reduziert die Migration und Invasion in verschiedenen ccRCC-Zellen in vitro. Dementsprechend unterdrückt die Überexpression von circDVL1 die Tumorentstehung von ccRCC in einem Maus-Xenotransplantatmodell. Mechanistisch gesehen dient circDVL1 als Schwamm für onkogenes miR-412-3p und verhindert so die durch miR-412-3p vermittelte Unterdrückung seines Zielprotocadherin 7 (PCDH7) in ccRCC-Zellen. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass circDVL1 eine tumorsuppressive Funktion während des Fortschreitens des ccRCC über die circDVL1/miR-412-3p/PCDH7-Achse ausübt, und legen nahe, dass circDVL1 ein neuer diagnostischer und prognostischer Marker und ein therapeutisches Ziel für ccRCC sein könnte.

Schlüsselwörter

circDVL1; Nierenzellkarzinom; miR-412-3p; PCDH7; Biomarker

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Einführung

Das Nierenzellkarzinom (RCC) ist ein äußerst tödliches bösartiges Karzinom des urologischen Systems und beeinträchtigt die menschliche Gesundheit erheblich [1]. Die RCC-Inzidenz hat in den letzten Jahrzehnten zugenommen, wobei im Jahr 2020 in den Vereinigten Staaten 73.750 neue Fälle diagnostiziert wurden [2, 3]. Klarzelliges RCC (ccRCC), der häufigste und aggressivste Subtyp des RCC, macht 70–75 Prozent der RCC-Fälle aus [4]. Wichtig ist, dass mehr als 30 Prozent der ccRCC-Patienten bei der Erstdiagnose mit Metastasen assoziiert sind. Obwohl die radikale Operation die Hauptbehandlungsoption für primäres ccRCC ist, kam es dennoch bei etwa 40 Prozent der Patienten zu Rückfällen und Metastasen mit einer Gesamtüberlebensrate von weniger als 10 Prozent nach 5-Jahren [5, 6]. Diese Dilemmata unterstreichen die dringende Notwendigkeit, die molekularen Mechanismen zu erforschen, die der Entwicklung von ccRCC zugrunde liegen, sowohl als diagnostische und prognostische Biomarker als auch als potenzielle therapeutische Ziele.

Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind nichtkodierende RNAs mit einkettigen Closed-Loop-Strukturen, die sie äußerst stabil machen [7, 8]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass circRNAs im Blut [9, 10], im Speichel [11] und in Exosomen [12] reichlich vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass sie als neuartige diagnostische Biomarker dienen könnten [13]. Da die Flüssigbiopsie weniger invasiv ist als die herkömmliche Gewebebiopsie [14], gelten circRNAs als wertvolle Vorhersageinstrumente für die Präzisionsmedizin [15-17]. Insbesondere können mehrere circRNAs wie cricNOX4, circEGLN3 und circPRRC2A als potenzielle Biomarker für die RCC-Diagnose und/oder -Prognose fungieren, die in unserem aktuellen Review zusammengefasst wurden [18]. Darüber hinaus konzentriert sich die aktuelle Forschung hauptsächlich auf den Wechsel der circRNA-Expression in ccRCC-Geweben [19, 20]. Deren Werte in der Flüssigbiopsie sind jedoch weitgehend unbekannt, was die Erforschung potenzieller Biomarker behindert. Obwohl gezeigt wurde, dass mehrere circRNAs, darunter circHIAT1 [21], circ-AKT3 [22] und cRAPGEF5 [23], eine wichtige Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten von ccRCC spielen [18], wurden circRNAs, die an ccRCC beteiligt sind, systematisch untersucht Entwicklung sowie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen fehlen noch.

Hier haben wir zunächst die Expression von circRNAs in Serumproben von ccRCC-Patienten und gesunden Kontrollpersonen mithilfe eines circRNA-Microarrays bestimmt. Bezeichnenderweise haben wir eine neue ccRCC-assoziierte circRNA circDVL1 (Karkassen-ID: hsa_circ_ 0009267) identifiziert, die im DVL1-Gen kodiert ist. CircDVL1 ist im Serum von ccRCC-Patienten signifikant reduziert und seine Expression korreliert umgekehrt mit der ccRCC-Fuhrman-Einstufung, was auf das Potenzial als Biomarker schließen lässt. Darüber hinaus ist CircDVL1 in ccRCC-Tumorgeweben verringert. Dementsprechend kann circDVL1 die Proliferation hemmen, einen Stillstand des Zellzyklus induzieren, Apoptose auslösen und die Migration und Invasion von ccRCC-Zellen reduzieren. Mechanistisch gesehen fungiert circDVL1 als miR-412-3p-Schwamm, um die PCDH7-Expression hochzuregulieren. Insgesamt identifizieren diese Ergebnisse circDVL1 als Tumorsuppressor für ccRCC und legen sein Potenzial sowohl als diagnostischer Biomarker als auch als therapeutisches Ziel nahe.

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Materialen und Methoden

1. Klinische Proben

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Zhejiang University (2021-104) genehmigt. Achtzehn übereinstimmende Proben von ccRCC und angrenzendem Nicht-Tumorgewebe wurden von ccRCC-Patienten entnommen. Die Proben wurden nach der Operation schnell in flüssigem Stickstoff konserviert und dann bis zur weiteren Verwendung bei -80 Grad gelagert. Es wurden Serumproben von 60 ccRCC-Patienten und 66 gesunden Kontrollpersonen entnommen. Anschließend wurden die Proben mit geeigneten Methoden verarbeitet und das erhaltene Serum bis zur weiteren Verwendung bei -80 Grad gelagert.

2. Zelllinien und Zellkultur

Alle Zelllinien wurden von der National Collection of Authenticated Cell Cultures (China) erworben. 786-O- und Caki-1-Zellen wurden in RPMI 1640 (HyClone) kultiviert, ACHN-Zellen wurden in MEM (HyClone) kultiviert und 293T-Zellen wurden in DMEM (Gibco)-Medium kultiviert. Alle Zellkulturmedien wurden mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (Gibco) und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin-Mischung (Gibco) ergänzt. Die Zellkulturen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad und 5 Prozent CO gehalten₂.

3. CircRNA-Microarray-Analyse

Das CircRNA-Microarray-Profiling in Serumproben wurde mit einem Arraystar Human CircRNA Array V2 (Capital Biotechnology, China) durchgeführt. Für die Datenzusammenfassung, Normalisierung und Microarray-Qualitätskontrolle wurde die GeneSpring-Software V13.0 (Agilent Technologies) verwendet. CircRNAs mit einem Schwellenwert der Faltungsänderung von größer oder gleich 2 und kleiner oder gleich –2 und einem P-Wert < 0.05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die hierarchische Clusteranalyse wurde unter Verwendung einer standardisierten euklidischen Distanz mit vollständiger Verknüpfung durchgeführt.

4. RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und Datenanalyse

Die RNA-Seq der nächsten Generation wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (24, 25). Für die RNA-Sequenzierung wurden miR-412-3p- und Kontroll-Mimic-transfizierte 786-0-Zellen verwendet. Der Bibliotheksaufbau und die bioinformatischen Analysen der Rohdaten wurden von Novogene Co., Ltd. (Peking, China) durchgeführt. Die RNA-seq-Daten wurden im Gene Expression Omnibus (GEO) unter der Zugangsnummer GSE175492 hinterlegt.

5. RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-RT-PCR (RT-qPCR)

RT-qPCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (26, 27). Gesamt-RNA wurde aus Serum, Zellen und Tumorgeweben unter Verwendung von AG RNAex Pro Reagent (AG, Hunan, China) isoliert. Für den circRNA-Nachweis wurde 1 μg Gesamt-RNA mit RNase R (3 U/ug, Epicenter Technologies, Madison, USA, Kat.-Nr. RNR07250) 10 Minuten lang bei 37 °C verdaut und komplementäre DNA (cDNA) mit dem HiScript II 1st erzeugt Strang-cDNA-Synthese-Kit (Vazyme). Die CircRNA- und mRNA-Expressionsniveaus wurden auf -Actin normalisiert. Um die miRNA-Expression zu bestimmen, wurde eine reverse Transkription mit einem miR-XTM miRNA First-Strang Synthesis Kit (Takara Bio USA, CA, USA, Kat.-Nr. 638313) mit U6 (Rnu6–1)-Expression als endogene Kontrolle durchgeführt. Das relative RNA-Expressionsniveau wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode bestimmt. Alle Primersequenzen für die qRT-PCR-Analyse sind in Tabelle S2 aufgeführt.

6. Plasmidkonstruktion und stabile Transfektion

Um den circDVL1- und circDVL1-MUT-Überexpressionsvektor zu konstruieren, wurden die circDVL1- und die mutierte circDVL1-Sequenz in den pcDNA 3.1(plus) Laccase 2 MCS Exon-Vektor kloniert, der bei Addgene (#69893) bestellt wurde [28]. ACHN- und 786-O-Zellen wurden mit circRNA und negativen Kontrollvektoren unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) transfiziert. Nach 48 Stunden wurden stabil transfizierte Zellen, die circDVL1 exprimierten, durch Zugabe von 800 μg/ml G418 zum Kulturmedium selektiert.

7. Lebensfähigkeit der Zellen

Der Zelllebensfähigkeitstest wurde mit dem CCK8-Kit (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan, Kat.-Nr. CK04) wie zuvor beschrieben bestimmt (29). 786-O- und ACHN circDVL1-überexprimierende und Kontrollzellen wurden in 96--Well-Platten ausgesät. Zum angegebenen Zeitpunkt wurde eine CCK8-Lösung (10 μl) zugegeben und 2 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert, und die Absorption wurde mit einem Spektrophotometer gemessen.

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8. Koloniebildung

Koloniebildungstests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (24). ACHN (800 Zellen/Well) und 786-O-Zellen (400 Zellen/Well) wurden 10 Tage lang kultiviert und anschließend etwa 30 Minuten lang mit 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von einer Färbung mit 0,1 Prozent Kristallviolettlösung für ca. 15 Min. Klone mit mehr als 50 Zellen wurden als einzelne Kolonie gezählt.

9. Zellzyklusanalyse

Die Zellen wurden über Nacht in RPMI 1640-Medium ohne FBS synchronisiert und für die nächsten 48 Stunden auf Medium mit 10 Prozent FBS umgestellt. Die Zellen wurden gewaschen, in 70-prozentigem Ethanol in PBS resuspendiert und über Nacht bei -20 Grad gelagert. Als nächstes wurden die Zellen zur Zellzyklusanalyse mit Propidiumiodid (PI)-Lösung gefärbt, die RNase A enthielt.

10. Apoptose-Analyse

Die ACHN- und 786-O-Zell-Apoptoseanalyse wurde mit einem Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Nachweiskit (Beijing Biosea Biotechnology, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

11. Zellmigrations- und Invasionstests

In vitro wurde die Zellmigrationskapazität unter Verwendung von Transwell-Kammern mit 8 μm Poren-Polycarbonatmembranen (Millipore, MA, USA) bewertet. Zellinvasionstests wurden mit mit 100 μl Matrigel (BD Biosciences, USA) beschichteten Transwell-Kammern durchgeführt. 786-O-Zellen (2×104) oder ACHN-Zellen (4×104) wurden in 200 μL RPMI 1640 ohne Serum suspendiert und in die oberen Transwell-Kammern ausgesät, und dann wurden 600 μL Medium mit 20 Prozent FBS hinzugefügt in die unteren Kammern. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden lang kultiviert, um die Migration zu messen, und 48 Stunden lang, um die Invasion zu bewerten. Zellen in der oberen Kammer wurden sorgfältig abgekratzt, und Zellen in der unteren Kammer wurden mit 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Es wurden Bilder aufgenommen und die Zellen mit einem Mikroskop gezählt.

12. Western-Blot

Das Gesamtprotein wurde extrahiert, quantifiziert und auf 10-prozentigen SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und dann auf Polyvinylidendifluoridmembranen (Millipore, MA, USA) übertragen, die mit primärer Anti-Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) inkubiert wurden. (Proteinch, 60004-1-Ig), Anti-PCDH7 (Abcam, ab139274) Primärantikörper bei 4 Grad über Nacht.

13. Immunfluoreszenzfärbung

Die Zellen wurden 24 Stunden lang auf Deckgläser ausgesät und mit 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert, 20 Minuten lang mit 0,2 Prozent Triton X-100 permeabilisiert und mit 5 Prozent Rinderserumalbumin inkubiert. Als nächstes wurden die Zellen mit einem für Ki67 spezifischen Primärantikörper (1:400, ab48027, Abcam) bei 4 Grad über Nacht inkubiert und anschließend mit einem 488-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:150, D110088, Sangon) inkubiert ) bei 37 Grad für 1 Stunde. Die Zellen wurden mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt und Bilder wurden mit einem Leica-Fluoreszenzmikroskop (DM4000) aufgenommen.

14. In-vivo-Tumorbildung und Ki67-Färbung

Sechs Wochen alte männliche BALB/c-Nacktmäuse (gekauft von Shanghai SLAC) wurden in zwei Gruppen aufgeteilt (n=5 für jede Gruppe). Den Mäusen wurden durch subkutane Injektion etwa 3 × 106 Kontrollzellen oder circDVL1 überexprimierende ACHN-Zellen inokuliert. Die Tumorgröße wurde alle 3 Tage, beginnend am 6. Tag nach der Injektion, mit einer Schieblehre gemessen. Das Tumorvolumen wurde als Länge × Breite × Höhe/2 berechnet. Alle Experimente wurden gemäß den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichung 80-23, überarbeitet 1996) durchgeführt und vom Animal Care Committee der Zhejiang-Universität, Hangzhou, China, genehmigt.

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15. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Eine circDVL1-Doppeldigoxigenin (DIG)-Meerrettichperoxidase (HRP)-Sonde (Exon Biotechnology, Guangzhou, China) wurde synthetisiert. Kontroll- und circDVL1-überexprimierende ACHN-Zellen wurden auf Deckobjektträgern kultiviert und mit der markierten Sonde 24 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Objektträger 1 Stunde lang bei 37 Grad in einem Anti-DIG-Sekundärantikörper inkubiert. Zum Nachweis von circDVL1-Signalen wurde eine Tyramin-Signalverstärkungsmethode verwendet, und die Zellen wurden mit DAPI gegengefärbt. Für Co-FISH wurden Deckobjektträger mit DIG-markiertem circDVL1 und Biotin-markiertem miR-412-3p inkubiert.

16. RNA-Immunpräzipitationstest (RIP).

RIP-Assays wurden mit dem Magna RIP™ RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit (Millipore, MA, USA) durchgeführt. 786-O-Zellen wurden in vollständigem RIP-Lysepuffer lysiert und dann mit Immunpräzipitationspuffer, der Magnetkügelchen enthielt, die mit AGO2 (Abcam, MA, USA) oder IgG-Antikörperkomplex konjugiert waren, über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Anschließend wurden immunpräzipitierte RNAs mittels RT-qPCR getestet.

17. Dual-Luciferase-Reporter-Assay

CircDVL1-, PPM1H-3'UTR- und PCDH7-3'UTR-Sequenzen, die mutierte miR-412-3p-Bindungsstellen enthielten, und ihre entsprechenden mutierten Sequenzen wurden synthetisiert und dann in den Luciferase-Reporter subkloniert Vektor psiCHECK-2 (Promega), um circDVL1-WT, circDVL1-Mut1, circDVL1-Mut2, PPM1H-3'UTR-WT, PCDH{ zu erzeugen {14}}'UTRWT-, PCDH7-3'UTR-Mut1- und PCDH7-3'UTR-Mut2-Vektoren. Die verschiedenen 3'UTR-Sequenzen von PPM1H und PCDH7 enthalten das 500-bp-Fragment mit potenziellen miR-412-3p-Bindungsstellen (flankiert von 250 bp). Die relative Luciferase-Aktivität wurde mit einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay (Promega, USA) bewertet. Alle Tests wurden in drei unabhängigen Wiederholungen durchgeführt.

18. Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit Student-t-Tests oder einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) bewertet. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn die P-Werte < 0.05 waren.

Diskussion

Verschiedene Arten von ccRCC-Biomarkern wurden vorgeschlagen und experimentell bewertet, darunter mRNAs (32), miRNAs (33), lncRNAs (34) und circRNAs (35). Allerdings wurde keiner von ihnen als genauer diagnostischer Biomarker für den routinemäßigen klinischen Einsatz bei ccRCC-Patienten bestätigt. Hier hat unsere Studie gezeigt, dass circDVL1 eine wichtige Rolle bei der Progression des ccRCC spielt. Zunächst untersuchten wir das Serum von ccRCC-Patienten und gesunden Kontrollpersonen, um mithilfe eines circRNA-Microarrays unterschiedlich exprimierte circRNAs zu identifizieren. Die RT-qPCR-Daten zeigten, dass circDVL1 in ccRCC-Proben drastisch herunterreguliert war. Frühere Studien haben gezeigt, dass circRNAs als latente Serumbiomarker bei verschiedenen Krebsarten dienen könnten [36, 37]. Beispielsweise haben Bei et al. zeigten, dass der exosomale has-circ-0004771 im Serum von Patienten mit Darmkrebs erhöht war [38]. Dennoch ist die Forschung zur spezifischen Rolle von circRNA als nicht-invasiver Biomarker bei ccRCC noch begrenzt. Unsere Studie ergab, dass circDVL1 im Serum von ccRCC-Patienten signifikant herunterreguliert war und dass die verminderte Expression von circDVL1 im Serum tumorbedingt sein könnte. Darüber hinaus hatte der Serum-CircDVL1-Spiegel einen signifikanten diagnostischen Wert bei der Unterscheidung zwischen Patienten mit Tumoren des Fuhrman-Grades I–II und Fuhrman-Tumoren des Grades III–IV. Daher könnte circDVL1 im Serum ein vielversprechender diagnostischer Marker für ccRCC sein. Allerdings wiesen mehrere gesunde Patienten niedrige circDVL1-Spiegel in ihrem Serum auf, was darauf hindeutet, dass eine Patientenüberwachung, die ausschließlich auf der Analyse dieser zirkulierenden RNA basiert, zu falsch positiven Ergebnissen führen könnte. Daher ist der Wert von circDVL1 als einzelner diagnostischer Marker etwas begrenzt und eine Kombination verschiedener zirkulierender RNAs muss möglicherweise analysiert werden, um eine zuverlässige Vorhersage für die Tumorentwicklung und Metastasierung zu erhalten.

Als neu identifizierte circRNA wurde die biologische und pathologische Rolle von circDVL1 nicht untersucht. In dieser Studie haben wir die Rolle und den Regulierungsmechanismus von circDVL1 bei ccRCC untersucht. Funktionelle Tests zeigten, dass überexprimiertes circDVL1 die Proliferation von ccRCC-Zellen, die Fähigkeit zur Koloniebildung und das tumorigene Potenzial verringern könnte, was wahrscheinlich auf eine erhöhte Zellapoptose in vitro und eine unterdrückte Tumorentwicklung in vivo zurückzuführen ist. Die Daten deuten darauf hin, dass circDVL1 bei ccRCC eine Tumorsuppressorfunktion haben könnte.

CircRNAs können die Entstehung und das Fortschreiten von Tumoren fördern, indem sie als miRNA-Schwämme fungieren. Daher untersuchten wir, ob circDVL1 die miRNA-Biogenese während der ccRCC-Karzinogenese regulieren kann. Mithilfe der Software miRanda und miRWalk haben wir herausgefunden, dass circDVL1 eine potenzielle Bindungsstelle für miR-412-3p aufweist. Luciferase-Reporter-Assays zeigten einen direkten Zusammenhang zwischen circDVL1 und miR-412-3p. Frühere Studien haben gezeigt, dass miR-412-3p über verschiedene molekulare Mechanismen an der Pathogenese verschiedener Krebsarten beteiligt ist [31, 39, 40]. Beispielsweise spielte miR-412-3p eine onkogene Rolle bei Dickdarmkrebs und förderte die Migration, Invasion und Zellproliferation von Krebsstammzellen [31]. Darüber hinaus war die miR-412-3p-Expression in extrazellulären Vesikeln von Patienten mit oralem Plattenepithelkarzinom (OSCC) hochreguliert [39]. In ähnlicher Weise legen unsere Ergebnisse nahe, dass miR-412-3p ein wichtiger Tumorpromotor bei ccRCC ist.

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Darüber hinaus wurde auch das Ziel von circDVL1/miR-412-3p identifiziert. Protocadherine (PCDHs) sind Transmembranproteine, die zur Cadherin-Superfamilie gehören und eine wichtige Rolle bei der Zelladhäsion und den Signalwegen spielen. PCDH7 ist ein Mitglied der PCDH-Familie und spielt eine etablierte Rolle bei der Zell-Zell-Erkennung und Zelladhäsion [41]. Es ist allgemein bekannt, dass der Verlust der Adhäsion ein früher Schritt bei der Invasion und Metastasierung von Tumorzellen ist. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass PCDH7 in einer Vielzahl von Tumortypen fehlerhaft exprimiert wird. Beispielsweise wurde PCDH7 bei menschlichem nichtkleinzelligem Lungenkrebs häufig überexprimiert und fungierte als Onkogen, um die Zelltransformation zu induzieren und die Lungentumorentstehung durch Potenzierung der MAPK-Signalisierung zu fördern [42]. Umgekehrt hemmte PCDH7 die Migration und Invasion von Magenkrebszellen über E-Cadherin [43]. Darüber hinaus wurde eine verringerte PCDH7-Expression bei Darmkrebs [44] und Blasenkrebs [45] festgestellt. Diese Daten zeigten, dass PCDH7 bei verschiedenen Tumortypen verschiedene Funktionen hatte. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die PCDH7-Spiegel in ccRCC-Tumorproben reduziert waren. Interessanterweise ergaben funktionelle Rettungsexperimente, dass die Tumorsuppressoreigenschaften von circDVL1 teilweise auf seine Wirkung auf PCDH7 zurückzuführen sind. Unsere Studie weist stark auf die Bedeutung der regulatorischen Achse circDVL1/miR-412-3p/PCDH7 für das Fortschreiten des ccRCC hin.

Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Wir haben drei spezifische siRNAs auf endogenes circDVL1 getestet, aber leider konnten alle diese siRNAs circDVL1 nicht ausschalten, wahrscheinlich aufgrund der einzigartigen Struktur dieser circRNA sowie ihrer geringen Basalexpression in ccRCC-Zellen. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass circDVL1 ein therapeutisches Ziel bei ccRCC-Patienten sein könnte. Um seine klinische Bedeutung weiter zu belegen, sind klinische Studien mit großen Patientenkohorten erforderlich. In unserer Studie haben wir die Ursache für die Herunterregulierung von circDVL1 in ccRCC-Läsionen nicht untersucht. Es wurde berichtet, dass RNA-bindende Proteine ​​(RBPs), darunter Quaking (QKI), Epithel-Splicing Regulatory Protein 1 (ESRP1) und Fused-in-Sarcoma (FUS), an der posttranskriptionellen Bildung von circRNAs beteiligt sind [{{10 }}]. Darüber hinaus sind einige Transkriptionsfaktoren (z. B. ZEB1, c-Myb und c-Jun) auch an der Biogenese spezifischer circRNAs beteiligt [49-52]. Studien haben außerdem gezeigt, dass die m6A-Modifikation den circRNA-Abbau vermittelt. Park et al. berichteten, dass m6A-modifizierte circRNAs auch über eine YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP-Achse herunterreguliert wurden [53]. Ob diese RBPs, Transkriptionsfaktoren und die m6A-Methylierung an der Herunterregulierung von circDVL1 beteiligt sind, bleibt ungewiss. In unserer zukünftigen Forschung werden wir versuchen, den vorgelagerten Regulationsmechanismus von circDVL1 bei der Entwicklung und Tumorentstehung von ccRCC zu untersuchen.

Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass der circDVL1-Spiegel im Serum von ccRCC-Patienten reduziert war. Insbesondere haben wir die Regulationsmechanismen von circDVL1 weiter untersucht und gezeigt, dass circDVL1 die ccRCC-Tumorentstehung unterdrückt, indem es die PCDH7-Expression durch Schwämmen von miR-412-3p fördert. Daher zeigte unsere Studie, dass circDVL1 ein potenzielles therapeutisches Ziel für zukünftige ccRCC-Behandlungen sein könnte.

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Ying Wang1,2, Yunjing Zhang1,2, Xinwan Su3, Qiongzi Qiu4, Yuan Yuan2, Chunhua Weng2, Sailan Zou5, Yan Tian5, Weidong Han6, Pengyuan Liu4,

1. The Fourth Affiliated Hospital und International Institutes of Medicine, Zhejiang University School of Medicine, Jinhua 322000, Zhejiang, China.

2. Kidney Disease Center, das erste angegliederte Krankenhaus und Institut für translationale Medizin, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, China.

3. Abteilung für Urologie, erstes angegliedertes Krankenhaus, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, China.

4. Abteilung für Atemwegsmedizin, Sir Run Run Shaw Hospital und Institut für Translationale Medizin, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310016, Zhejiang, China.

5. Abteilung für Endokrinologie und Stoffwechsel, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University und Collaborative Innovation Center of Biotherapy, Chengdu 610041, Sichuan, China.

6. Abteilung für Medizinische Onkologie, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310016, Zhejiang, China.

7. Abteilung für Epidemiologie, Abteilung für Medizin, Vanderbilt Epidemiology Center und Vanderbilt-Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville 37203, TN, USA.

8. Abteilung für Nephrologie, Nationales klinisches Forschungszentrum für Kindergesundheit, Kinderkrankenhaus, Medizinische Fakultät der Zhejiang-Universität, Hangzhou 310003, Zhejiang, China.