Zirkulierende Tumor-DNA bei Patienten mit Nierenzellkarzinom. Eine systematische Überprüfung der Literatur
Nov 06, 2023
Abstrakter Kontext:Im letzten Jahrzehnt hat das Interesse am Potenzial von Flüssigbiopsien und systematischen Biomarkern bei der Diagnose und Behandlung von Erkrankungen zugenommenNierenkrebs, da sie möglicherweise ein Werkzeug dafür bereitstellenFrüherkennung von KrankheitenUndÜberwachung des Ansprechens auf die Behandlung. Zielsetzung: Zur Identifizierung und Zusammenfassung relevanter veröffentlichter Daten zur zirkulierenden Tumor-DNA (ctDNA) bei Patienten mitNierenzellkarzinom(RCC). Evidenzbeschaffung: Wir führten eine systematische Überprüfung gemäß dem Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA)-Statement von Studien durch, die bis zum 15. Januar 2021 in PubMed, MEDLINE, EMBASE und Cochrane Library identifiziert wurden. Zwei Gutachter überprüften alle unabhängig voneinander Artikel und führte die Datenextraktion durch.
Beweissynthese:Neunzehn Studien zur Untersuchung von ctDNA bei RCC (1237 Patienten) wurden in die abschließende Überprüfung einbezogen und analysiert. Die Größe und das Design der Studie waren sehr unterschiedlich und die Studien wurden entsprechend der für den ctDNA-Nachweis verwendeten Methode in fünf Gruppen eingeteilt. Die Ergebnisdaten umfassten (1) die Sensitivität/Spezifität, sofern verfügbar; (2) die für den ctDNA-Nachweis verwendete Methode; und (3) die wichtigsten Ergebnisse der Studien.
Schlussfolgerungen:Die Studien zeigen, dass der ctDNA-Spiegel im RCC niedrig zu sein scheint. Studien, die mehrere Methoden zum ctDNA-Nachweis verwenden, deuten darauf hin, dass die tumorgesteuerte Analyse die ctDNA-Nachweisrate verbessert und legen nahe, dass zellfreie methylierte DNA-Immunpräzipitation und Hochdurchsatzsequenzierung eine sehr empfindliche Methode zum ctDNA-Nachweis bei RCC sein könnten.
Patientenzusammenfassung: Wir haben die Literatur systematisch überprüft, um alle relevanten Studien zu identifizieren, die zirkulierende Tumor-DNA bei Patienten mit untersuchenNierenkrebsum seinen Einsatz und sein Potenzial bei dieser äußerst bösartigen Erkrankung zu untersuchen. Wir haben festgestellt, dass die Menge an zirkulierender Tumor-DNA niedrig istNierenkrebsund dass für den Nachweis bei dieser Krankheit sehr empfindliche Methoden eingesetzt werden müssen.
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1. Einleitung
Urologische Malignome stellen weltweit ein zunehmendes Gesundheitsproblem dar. Schätzungsweise werden jährlich mehr als eine Million Patienten neu diagnostiziert [1]. Das Nierenzellkarzinom (RCC) ist eine hochmaligne Erkrankung und macht 3 % aller bösartigen Erkrankungen in westlichen Ländern aus, wobei die Inzidenz jährlich zunimmt [2].
Die Diagnose und Behandlung von Patienten mit RCC stellt viele Herausforderungen dar. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass RCC durch eine asymptomatische Manifestation im Frühstadium und ein schlechtes Ansprechen auf Strahlen- und Chemotherapie in metastasierten Stadien gekennzeichnet ist [3,4]. In den letzten Jahrzehnten besteht ein zunehmendes Interesse an der Forschung an Flüssigbiopsien und zirkulierenden Krebsbiomarkern, da diese ein Instrument zur Früherkennung von Krankheiten und zur Überwachung des Behandlungserfolgs darstellen könnten. Ellinger et al. [5] berichteten, dass das Vorhandensein zellfreier DNA (cfDNA) im Blutkreislauf erstmals vor mehr als 50 Jahren nachgewiesen wurde. cfDNA kann leicht aus peripherem Blut gewonnen werden und es wurde gezeigt, dass sie bei Patienten mit mehreren soliden Malignomen vorhanden ist [6]. Das Vorhandensein von cfDNA im Blutkreislauf von Patienten und Veränderungen im Spiegel dieser zirkulierenden Nukleinsäuren sind mit der Tumorlast und dem Fortschreiten des Tumors verbunden. Die Studien unterscheiden sich jedoch darin, ob sie eine Korrelation zwischen cfDNA-Spiegeln und Tumorstadium und -grad beim RCC nachweisen konnten [7–9]. Zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) ist cfDNA, die aus apoptotischen oder nekrotischen Tumorzellen, Sekreten von Makrophagen oder zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) stammt [10]. Die Analyse von ctDNA eröffnet möglicherweise die Möglichkeit einer nichtinvasiven Erkennung des Mutationsprofils eines bestimmten Krebses während der Tumorprogression, und Studien haben gezeigt, dass das Vorhandensein von ctDNA mit fortgeschrittener Erkrankung und Krankheitsprogression während der Behandlung korreliert [7,11,12]. Obwohl mehrere Studien zu ctDNA bei RCC durchgeführt wurden, gibt es noch keine klaren Empfehlungen oder Zusammenfassungen der Literatur.
Wir berichten hier über eine systematische Überprüfung aller veröffentlichten Daten zu ctDNA bei Patienten mit RCC, um den Einsatz und das Potenzial von ctDNA bei RCC zu untersuchen.
2. Beweiserhebung
2.1. Suchstrategie
Diese systematische Überprüfung wurde gemäß den PRISMA-Richtlinien (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses) [13] durchgeführt (Abb. 1). Die Bewertung wurde auf der PROSPERO-Plattform unter der Identifikationsnummer CRD42020208730 registriert. Es wurden ein Autor (LG) und ein Fachbibliothekar gesucht, für die die Strategie im Zusatzmaterial verfügbar ist. Die Literatursuche wurde in den Datenbanken PubMed, MEDLINE, EMBASE und Cochrane Library durchgeführt, um relevante Studien bis zum 15. Januar 2021 zu identifizieren, wobei die Sortierung und Entfernung doppelter Artikel in Covidence durchgeführt wurde.
2.2. Screening- und Auswahlkriterien
Die Studienauswahl erfolgte in drei aufeinanderfolgenden Schritten: Die Artikel wurden zunächst nach Titel, dann nach Zusammenfassung und drittens nach Volltext bewertet. Studien wurden eingeschlossen, wenn sie die folgenden Einschlusskriterien erfüllten: (1) Patienten, bei denen ein RCC in irgendeinem Stadium diagnostiziert wurde; (2) Analyse von DNA in Plasma/Serum; (3) Analyse von Mutationen auf DNA-Ebene oder epigenetischen Veränderungen; und (4) Artikel in englischer Sprache verfasst. Artikel zu anderen Malignomen als RCC, Tier- und Zelllinienstudien, vor 2010 veröffentlichte Studien und kleine Pilotstudien mit weniger als fünf Patienten wurden ausgeschlossen.
Zwei Autoren (LG und KMK) haben unabhängig voneinander die Titel und Abstracts gesichtet und potenziell geeignete Studien ausgewählt. Anschließend wurde der vollständige Text potenziell förderfähiger Studien gesichtet. Die Autoren diskutierten etwaige Meinungsverschiedenheiten, bis ein Konsens erzielt wurde.
2.3. Datenextraktion
Es wurde ein Datenextraktionsblatt entwickelt und vorab festgelegte, interessante Ergebnisse gesammelt. Zwei Gutachter (LG und KMK) extrahierten unabhängig voneinander Daten aus den eingeschlossenen Studien. Meinungsverschiedenheiten wurden im Konsens gelöst.
Zu den extrahierten Studienmerkmalen gehörten: (1) Name des Erstautors und Erscheinungsjahr; (2) Methode zum Nachweis von ctDNA; (3) Anzahl der Patienten/Fälle; und (4) Anzahl der Kontrollen. Zu den Ergebnisdaten gehörten: (1) Sensitivität und Spezifität, sofern verfügbar; (2) die für den ctDNA-Nachweis verwendete Methode; und (3) Schlüsselergebnisse der jeweiligen Studien.
Aufgrund der unterschiedlichen Studiendesigns und -methoden in den eingeschlossenen Studien wurde die Qualitätsbewertung nicht nach vordefinierten Kriterien durchgeführt. Die Qualität der Studien wurde von einem Autor (KMK) bewertet, der über umfassende Erfahrung mit Methoden zum ctDNA-Nachweis verfügt.
3. Beweissynthese
3.1. Studien inklusive
Gemäß unseren Suchkriterien wurden in der Primärsuche 3439 potenziell relevante Artikel identifiziert und gesichtet. Alle Arbeiten wurden zu EndNote hinzugefügt und Duplikate entfernt, so dass 1670 Studien übrig blieben. Die Titel, Zusammenfassungen und Volltexte wurden manuell überprüft und 19 Studien erfüllten die Einschlusskriterien [9,14–31]. Alle eingeschlossenen Studien wurden zwischen 2010 und 2020 veröffentlicht. Sie wurden vollständig veröffentlicht, aber die Größe und das Design der Studien variierten stark und daher wurden sie entsprechend der für den ctDNA-Nachweis verwendeten Methode in fünf Gruppen eingeteilt: (1) tumorgesteuert Analyse von Plasma; (2) gezielte Sequenzierung von Plasma; (3) globale Sequenzierung von Plasma; (4) gezielte Methylierungsanalyse von Plasma; und (5) globale Methylierungsanalyse von Plasma.
Um die Verwendung von ctDNA bei RCC abzudecken, haben wir die Studien in jeder der ctDNA-Nachweisgruppen gescreent, um die ctDNA-Nachweisrate sowie die Sensitivität und Spezifität, sofern verfügbar, zu ermitteln. Darüber hinaus haben wir Studien identifiziert, die die Übereinstimmung zwischen ctDNA-Proben und Tumorgewebe desselben Patienten untersuchen, sowie Studien, die das Potenzial von ctDNA für Prognose und Krankheitsüberwachung untersuchen. Abschließend haben wir die für den ctDNA-Nachweis verwendeten Methoden zusammengefasst und erklärt, welche Methode wir aufgrund unserer Ergebnisse wählen sollten.
3.2. ctDNA-Erkennungsraten
3.2.1. Tumorgesteuerte Analyse von Plasma
Fünf Studien [14–18] verwendeten eine tumorgesteuerte Analyse von Plasma (Tabelle 1). Diese Art der Analyse basiert auf der Identifizierung von Mutationen in der Tumorgewebe-DNA und der anschließenden Analyse dieser Mutationen in der cfDNA. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass bei Kenntnis der Mutationen des Tumors eine sehr hohe technische Sensitivität erreicht werden kann. Der Nachteil besteht darin, dass die Analyse neu erworbene Mutationen nicht erkennt. Die fünf Studien umfassten zwischen fünf und 24 RCC-Patienten und die ctDNA-Erkennungsrate lag zwischen 17 % und 54 %.
In einer frühen wegweisenden ctDNA-Studie untersuchten Bettegowda et al. [14] das Vorhandensein von ctDNA bei 640 Patienten mit verschiedenen Krebsarten, darunter fünf Patienten mit metastasiertem RCC. Der Nachweis von ctDNA im Plasma erfolgte mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) oder einer sequenzierungsbasierten Analyse einer im Tumor identifizierten Mutation. ctDNA wurde bei 40 % der RCC-Patienten mit metastasierter Erkrankung nachgewiesen, was zur Klassifizierung des RCC als bösartige Erkrankung mit niedrigem ctDNA-Gehalt führte. Obwohl die Klassifizierung auf einer sehr geringen Patientenzahl basierte, wurde sie seitdem durch mehrere Studien gestützt [15–18].
Die Studien von Corrò et al. [15] und Lasseter et al. [18] verwendeten beide eine gezielte Tiefensequenzierung einer oder mehrerer im Tumorgewebe identifizierter Mutationen und hatten eine ctDNA-Erkennungsrate von 17 % bzw. 52 %. Die Patienten in der Studie von Corrò et al. hatten eine nicht metastasierte Erkrankung, während die Patienten in der Studie von Lasseter et al. ein metastasiertes RCC hatten.
Der Unterschied in der Erkennungsrate kann auf die unterschiedlichen Patientenkohorten zurückzuführen sein. Allerdings sind die relativ niedrigen Erkennungsraten in diesen Studien überraschend, da die tumorinformierte Strategie das Potenzial hat, eine der technisch empfindlichsten Methoden zu sein. Die Studie von Lasseter et al. zeigte auch, dass die Sequenzierung von cfDNA bis zu einer extrem hohen Tiefe (122 035 ) die ctDNA-Erkennung verbesserte, da sie die Erkennung von Varianten erhöht, die bei sehr geringen Häufigkeiten vorhanden sind.
Zwei sehr aktuelle Studien mit gemischten Patientenkohorten (nicht metastasiertes und metastasiertes RCC) [16,17] verwendeten die ctDNA-Analyse einer großen Anzahl von Varianten, die im Tumorgewebe identifiziert wurden. In der Studie von Smith et al. [16] wurden 91 Patienten mit verschiedenen Methoden untersucht (Tabellen 1–3). Die Autoren fanden heraus, dass ein personalisierter Ansatz, der auf durchschnittlich 297 tumorspezifische Varianten pro Patient abzielt und eine benutzerdefinierte Panel-Sequenzierung von Mutationen verwendet, die über die Exomsequenzierung von Tumorgewebe identifiziert wurden, die ctDNA-Erkennung im Vergleich zu einem nicht zielgerichteten Ansatz verbesserte. Eine tumorgesteuerte Plasmaanalyse wurde bei 29 Patienten durchgeführt und identifizierte ctDNA bei 54 % der Patienten, bei denen die Analyse die Qualitätskontrolle bestanden hatte. Wan et al. [17] wandten einen ähnlichen methodischen Ansatz auf 24 Patienten an und stellten fest, dass der Anteil der ctDNA bei RCC-Patienten etwa 10 4 betrug. Dieser Befund verdeutlicht, dass für die ctDNA-Analyse bei RCC äußerst empfindliche Methoden erforderlich sind.
3.2.2. Gezielte Sequenzierung von Plasma
Acht Studien [16,18–24] (Tabelle 2) verwendeten eine gezielte Panel-Sequenzierung von DNA aus Plasma ohne vorherige Analyse der Tumorgewebe-DNA. Der Vorteil dieser Strategie besteht darin, dass keine Gewebeprobe erforderlich ist (dh sie ist weniger invasiv) und die Identifizierung neu erworbener Mutationen ermöglicht. Allerdings ist die Analyse möglicherweise weniger empfindlich als die tumorgesteuerte Analyse. Im Allgemeinen umfassten die Studien eine größere Anzahl von Patienten, nämlich 19 bis 220, und die Erkennungsrate war deutlich besser und lag zwischen 19 % und 100 %. Die meisten Studien wurden an Patienten mit metastasierender Erkrankung durchgeführt; Nur 14 Patienten in der Studie von Yama Moto et al. [22] und zwei Patienten in der Studie von Smith et al. [16] hatten ein nicht metastasiertes RCC (Erkennungsraten von 30 % bzw. 19 %). Die hohen Erkennungsraten könnten daher auf eine hohe Tumorlast bei vielen dieser Patienten zurückzuführen sein. Die Ergebnisse der Studie von Maia et al. [20] stützen diese Hypothese. Die Autoren fanden heraus, dass der ctDNA-Nachweis mit der Tumorlast korrelierte; Die Tumorlast war bei Patienten mit nachweisbarer ctDNA signifikant höher als bei Patienten ohne ctDNA. Darüber hinaus korrelierte die Anzahl der Mutationen in der ctDNA auch signifikant mit der Tumorlast.
Bacon et al. [23] fanden im Vergleich zu ähnlichen Studien eine relativ niedrige Erkennungsrate von 33 %. Dies kann daran liegen, dass bei 40 von 55 Patienten Plasmaproben nach der chirurgischen Entfernung des Primärtumors entnommen wurden. In einer Studie von Hahn et al. [19], in der bei 15 von 19 Patienten vor der Probenentnahme auch der Primärtumor operativ entfernt wurde, lag die ctDNA-Nachweisrate jedoch bei 68 %. Die niedrige Erkennungsrate könnte auch durch die technische Empfindlichkeit des Assays erklärt werden, die den Nachweis von Varianten mit einer Varianten-Allele-Frequenz (VAF) von nicht ermöglichte<1% [23].
Es scheint einen Trend zu einer besseren Erkennung in Studien zu geben, in denen die ctDNA-Analyse auf einem Genpanel basierte, das eine große Anzahl von Genen, sehr hohe Sequenzierungstiefen oder eine Kombination davon abdeckte. Beispielsweise sequenzierten die Studien von Maia et al. [20] und Pal et al. [21] beide 73 Gene mit 15 000-Abdeckung und hatten Erkennungsraten von 53 % bzw. 79 %. Im Vergleich dazu sequenzierten Smith et al. [16] zehn Gene bis zu einer Tiefe von 9688 und Lasseter et al. [18] sequenzierten 27 Gene bis zu einer Tiefe von 989 und erzielten ctDNA-Erkennungsraten von 19 % bzw. 28 %.
3.2.3. Globale Sequenzierung von Plasma
Es wurden zwei Studien [16,25] identifiziert, die eine globale Plasmasequenzierung verwendeten (Tabelle 3), die beide eine flache Gesamtgenomsequenzierung (sWGS) verwendeten. Diese nicht zielgerichtete Methode erfordert keine Vorkenntnisse über spezifische Mutationen im Tumor und weist eine geringe Empfindlichkeit für Einzelbasenmutationen auf, kann jedoch große Deletionen und Duplikationen identifizieren. SWGS ist relativ kostengünstig und einfach durchzuführen. Mouliere et al. [25] führten sWGS bis zu einer Tiefe von 0,4 an 344 Proben von 200 Patienten mit verschiedenen Krebsarten durch, darunter 33 mit RCC (unbekanntes Krankheitsstadium). Der ctDNA-Nachweis basierte auf der Analyse der cfDNA-Fragmentlängen bei Krebspatienten und gesunden Personen. Sie fanden heraus, dass die In-silico-Anreicherung von Fragmenten mit einer Größe zwischen 90 und 150 bp den Nachweis von ctDNA bei allen Krebsarten verbesserte. Allerdings ist beim RCC der Anteil der Fragmente höher<150 bp was very similar to that in healthy individuals, indicating a low amount of ctDNA in RCC. The ctDNA detection rate was 65% for ''low-ctDNA cancers'' (RCC, pancreatic cancer, and glioma).
Smith et al. [16] wandten in silico die gleiche Größenauswahl von cfDNA-Fragmenten an wie Mouliere et al. [25] und stellten fest, dass dies den Nachweis von ctDNA verbesserte. In einer Kohorte von Patienten mit verschiedenen RCC-Stadien und einer Kohorte von mRCC-Patienten stellten sie fest, dass die ctDNA-Erkennungsrate 23 % (11 von 48) bzw. 33 % (14 von 43) betrug, wenn der ungezielte sWGS-Ansatz kombiniert wurde mit Größenauswahl.
Obwohl diese nicht zielgerichtete und relativ kostengünstige Methode einige Vorteile bietet, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sie eine relativ geringe Empfindlichkeit für RCC aufweist und eine Optimierung erforderlich ist.
3.2.4. Gezielte Methylierungsanalyse von Plasma
Eine gezielte Methylierungsanalyse von Plasma mittels PCR-basierter Methode ist sehr kostengünstig und einfach durchzuführen. Der Nachteil besteht darin, dass nur sehr wenige Gene analysiert werden und wenn der Patient keine Mutation in einem dieser Gene aufweist, ist das Ergebnis des ctDNA-Tests negativ. Wir identifizierten fünf Studien [9,28–31], die diese Methode verwendeten (Tabelle 4) und zwischen 27 und 157 Patienten mit verschiedenen RCC-Stadien einschlossen. Vier der Studien umfassten eine Gruppe gesunder Kontrollpersonen.
Im Allgemeinen kamen die Autoren zu dem Schluss, dass die Methylierungsanalyse eine hohe Spezifität, aber eine geringe Sensitivität bei der Unterscheidung von Krebspatienten von gesunden Kontrollpersonen lieferte. Hauser et al. [28] und Skrypkina et al. [29] führten eine kombinatorische Analyse mehrerer Gene durch, was die diagnostische Sensitivität und Spezifität erhöhte. Lin et al. [30] und Jung et al. [31] untersuchten den Methylierungsstatus von PCDH17 bzw. SHOX2. Lin et al. fanden heraus, dass das Vorhandensein von PCDH17 mit dem fortgeschrittenen Krankheitsstadium korreliert, und Jung et al. fanden heraus, dass Patienten mit SHOX2-positivem Plasma ein deutlich höheres Sterberisiko hatten.
Die Durchführung einer PCR-basierten Analyse kann wesentlich kostengünstiger sein als eine sequenzierungsbasierte Analyse, sie ermöglicht jedoch nur die Untersuchung einer begrenzten Anzahl von Mutationen. Sowohl Sensitivität als auch Spezifität sind oft relativ gering, wie die Studien von Hauser et al. [28] und de Martino et al. [9] zeigen. Technisch empfindlichere Methoden wie die digitale Tröpfchen-PCR könnten die Empfindlichkeit für Patienten verbessern, deren Tumor eine Mutation an der Zielposition im Genom aufweist [32]. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass für den ctDNA-Nachweis bei RCC andere Methoden erforderlich sind, die auf größere Genomregionen abzielen.
3.2.5. Globale Methylierungsanalyse
Drei Studien [18,26,27] untersuchten globale Methylierungsmuster (epigenetische Aberrationen) in cfDNA (Tabelle 5). Epigenetische Veränderungen kommen beim RCC häufiger vor als genetische Veränderungen und führen dadurch zu mehr tumorspezifischen Veränderungen. Durch die globale Methylierungsanalyse kann somit eine höhere Sensitivität erreicht werden. Zellfreie methylierte DNA-Immunpräzipitation und Hochdurchsatzsequenzierung (cfMeDIP-seq) ist eine Bisulfit-freie Technik, die die Methylierung von cfDNA im gesamten Genom nachweisen kann. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie genomweite CrG-methylierte cfDNA mit einem geringen DNA-Input anreichern kann (<10 ng) [33]. cfMeDIP-seq was applied in two studies: Nuzzo et al [26] had a ctDNA detection rate of 97% (at the specificity of 100%) in a study of 69 patients with various stages of RCC, and Lasseter et al [18] had a ctDNA detection rate of 100% in a study of 34 patients with mRCC, although at lower specificity of 88%.
In einer großen Studie mit mehr als 2000 Patienten mit verschiedenen Krebsarten (darunter 81 Patienten mit verschiedenen RCC-Stadien) stellten Liu et al. [27] fest, dass die ctDNA-Erkennungsrate bei RCC im Vergleich zu anderen Krebsarten niedrig war. Die Studie wurde in zwei Schritten unter Verwendung von Bisulfit-Sequenzierungsdaten des gesamten Genoms von 1531 Krebsfällen und 1521 Kontrollproben durchgeführt, um einen Klassifikator für den ctDNA-Nachweis zu erstellen. Die Autoren wandten den Klassifikator auf eine Validierungskohorte von 654 Krebsfällen und 610 Kontrollproben an. Die Erkennungsrate in dieser Studie betrug 21 % (Spezifität 99,8 %) in der Trainingskohorte und 12 % (Spezifität 99,3 %) in der Validierungskohorte, und der ctDNA-Nachweis wies mit zunehmendem Krankheitsstadium eine zunehmende Empfindlichkeit auf.
Diese Studien deuten darauf hin, dass cfMeDIP-seq eine vielversprechende Strategie für den ctDNA-Nachweis bei RCC sein könnte, aber die Validierung in größeren Studien ist von größter Bedeutung, bevor klare Schlussfolgerungen gezogen werden können.
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