Wie untersucht man die genetische Vielfalt von Herba Cistanches?
Mar 14, 2022
Studie zur genetischen Vielfalt von Herba Cistanches von RAPD
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da
(Institut für Chinesische Materia Medica, Chinesische Akademie für Chinesische Medizin, Peking 100700)
Abstrakt
Zweck:Um die Bevölkerung zu studierengenetische VielfaltvonCistanche DeserticolaundCistanche tubulosa.
Methoden:Zwei wilde Populationen vonCistanche Deserticolaund vier Wildpopulationen vonCistanche tubulosawurden von RAPD analysiert, und diegenetische Vielfaltder Populationen wurde mit der Softwareversion 1.31 von POPGENE analysiert.
Ergebnisse:Der durchschnittliche Prozentsatz polymorpher Loci vonCistanche Deserticolalag bei 47,37 Prozent, die polymorphen Loci der beiden Populationen bei 39,47 Prozent und 35,53 Prozent und die durchschnittliche Gendiversität von Nei bei 0.135 8. Shannons war mehr. Der Statusinformationsindex ist 0.207 2 und der Gendifferenzierungskoeffizient Gst {{1{{20}}}}}.254 6. Der durchschnittliche Prozentsatz polymorpher Loci in Cistanche betrug 27,59 Prozent, und der Prozentsatz polymorpher Loci in jeder Population reichte von 19,54 Prozent bis 25,29 Prozent, wobei die Andier-Population die höchsten 25,29 Prozent aufwies, und die durchschnittliche Gendiversität von Nei war 0. { {21}}, Shannons Polymorphismus-Informationsindex ist 0,1258, Gendifferenzierungskoeffizient Gst =0.175 5.
Fazit:Cistanche DeserticolaundCistanche tubulosahaben eine gewisse Differenzierung zwischen den Populationen. Dasgenetische Vielfaltvon Desert Cistanche ist deutlich höher als die von Cistanche tubulosa und hat sich in zwei Ökotypen differenziert.
Schlüsselwörter: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; genetische Vielfalt
[Chinesische Bibliotheksklassifikationsnummer] S 567 [Dokumentidentifikationscode] A [Artikelnummer] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Cistanche ist eine parasitäre Pflanze, die zur Gattung Cistanche in der Familie der Lidanaceae gehört, auch bekannt als Dayun, die ein wertvolles chinesisches medizinisches Material ist. Die Hauptquellenpflanzen von Cistanche deserticola in meinem Land sindCistanche DeserticolaYCMa und C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Die Wirtspflanzen der Cistanche deserticola sind Haloxylon ammodendron und Haloxylon ammodendron, die hauptsächlich in der Alashan-Liga in der Inneren Mongolei, im Norden von Xinjiang, Qinghai, Gansu und anderen Orten verbreitet sind. Die Verbreitung von Cistanche deserticola entspricht der der Wirtspflanzen. In meinem Land ist Cistanche cistanche nur in Landkreisen rund um die Taklimakan-Wüste südlich des Tianshan-Gebirges in Xinjiang verbreitet, und ihre Verbreitung ist nicht vollständig mit der Wirts-Tamarix synchronisiert. Andere Regionen wie das nördliche Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, die Innere Mongolei, Shaanxi und andere Orte der Tamarix-Pflanze sind keine parasitären Cistanche Tubula[2]. Aufgrund des rapiden Anstiegs der Nachfrage nach Cistanche in den letzten Jahren, was zum Aussterben seiner Ressourcen führte, sind die wilden Cistanche-Ressourcen auf nur wenige Hauptproduktionsgebiete geschrumpft. Beide wurden in meinem Land als gefährdete geschützte Pflanzenarten aufgeführt [3], darunterCistanche Deserticolawurde in CITES Anhang II [4] aufgenommen.
Nach mehreren Jahren der Forschung war die Forschung zur künstlichen Züchtung von Cistanche erfolgreich und befindet sich im Stadium der groß angelegten Förderung und Anpflanzung. Wie jedoch der Rückgang der Cistanche-Arten während der industriellen Produktion verhindert werden kann, wie die begrenzte Wildpopulation so schnell wie möglich wiederhergestellt und wertvolle wilde Keimplasma-Ressourcen erhalten werden können, sind die Schlüssel zu einer nachhaltigen Nutzung. Bezüglich des geschützten Erbes von Cistanche [Empfangsdatum], 2004-03-11 [Fondsprojekt] Sozialhilfeprojekt des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (2001.109); Projekt „Zehnter Fünfjahresplan“ des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (2001BA701A09a) [korrespondierender Autor] * Huang Luqi, Tel: (010) 64014411-2955, E-Mail: huangluqi @263.net Das Studium der Übertragung ist noch nicht abgeschlossen leer. Diese Studie verwendet die RAPD-Technologie, um 2 Wildpopulationen von zu untersuchenCistanche Deserticolaund 4 Wildpopulationen vonCistanche tubulosa, und analysieren Sie beide Der Unterschied ingenetische Vielfaltsoll eine wichtige experimentelle genetische Basis für den Schutz von Cistanche, einer wertvollen chinesischen Medizin, liefern.
1. Material und Methoden
1.1 Materialien
Cistanche Deserticolawurde aus dem Bezirk Jimsar in Xinjiang und dem Jilantai-Gebiet der alten Alxa-Liga in der Inneren Mongolei gesammelt. Cistanche-Populationen wurden in den Landkreisen Minfeng und Yutian, Xinjiang, gesammelt. Der Landkreis Minfeng ist derzeit das Gebiet mit dem größten Ertrag an Cistanche-Cistanche, mit der höchsten Dichte und relativ vollständigen Gemeinschaften natürlicher Wälder. Die Probenahmestellen Andil, Sawuzek, Yatongguz und Daheyan im Landkreis Yutian sind die Hauptproduktionsgebiete, die sich im Andir-Fluss, Yeyike-Fluss, Yatongguzi-Fluss und Kelaniya befinden 50km. Jede Population hat zufällig 19-30 Individuen ausgewählt. Die Proben wurden schnell in Kieselgel getrocknet und für die DNA-Extraktion verwendet (Tabelle 1).
Tabelle 1 Stichprobenpopulationen und Produktionsgebiete von Cistanche deserticola und Cistanche tubulosa
1.2 DNA-Extraktion
Die Gesamt-DNA-Extraktionsmethode verwendet eine Methode mit hohem Salzgehalt und niedrigem pH-Wert [5]. Die DNA-Probe wurde einem Spektrophotometer unterzogen, um die Konzentration der DNA-Matrize nachzuweisen, dann wurden 1-prozentige Agarose-Gelelektrophorese, EB-Färbung, Beobachtung und Fotografie unter UV-Licht, Elektrophorese-DNA mit klaren Banden und weniger Tailing für die RAPD-Analyse verwendet.
1.3 Screening von RAPD-Primern
Da das Experiment ergab, dass der gleiche Primer eine unbefriedigende Wirkung auf die gleichzeitige Amplifikation von beiden hatCistanche Deserticolaund Cistanche tubulosa wurden die Primer unabhängig voneinander gescreent. 150 zufällige Primer (10 bp), 25 &mgr;l Reaktionssystem von Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. wurden für Amplifikation und Screening verwendet; Jeder Primer verwendete 2 Populationsmatrizen und 1 sterilisiertes doppelt destilliertes Wasser als Blindkontrolle und erhielt 10 Primer für die Amplifikation von Cistanche deserticola mit klaren Banden, starkem Polymorphismus und guter Wiederholbarkeit: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 Primer vonCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 PCR-Amplifikation und Produktnachweis
Die ausgewählten Primer wurden verwendet, um die Matrizen-DNA zu amplifizierenCistanche DeserticolaundCistanche tubulosadurch PCR. Genomische DNA wurde entsprechend der gemessenen Konzentration als Matrize auf 50 ng·μL -1 verdünnt. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 25 μL, davon 10 × PCR-Puffer 2,5 μL, Mg2 plus 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP-Mischung (je 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, Matrizen-DNA 1 μL, sterilisiertes doppelt destilliertes Wasser 18,8 μL, die obige PCR-Amplifikationslösung ist das Produkt von Shanghai Sangon. Die Amplifikation wurde auf einem PTC-100-Thermocycler durchgeführt. Das Amplifikationsprogramm war 94 Grad Vordenaturierung für 5 Minuten und dann 40 Zyklen. Jeder Zyklus umfasste 94 Grad 45 s, 34 Grad 1 min, 72 Grad 1 min 30 s und schließlich Verlängerung bei 72 Grad für 5 min. Die amplifizierten Produkte wurden auf einem 2,0-prozentigen Agarosegel (mit EB) in 1 × TAE-Puffer einer Elektrophorese unterzogen und unter dem SYNGENE-Gelbildgebungssystem beobachtet und fotografiert.
1.5 Statistik und Datenanalyse
Im Elektrophoresespektrum wird die entsprechende Position des Reaktionsprodukts auf dem Gel nach dem Molekulargewichtsstandard verglichen und das Molekulargewicht des amplifizierten Produkts abgeschätzt. Das Band mit dem Band wird als 1 aufgezeichnet, und das Band ohne Band wird als 0 aufgezeichnet, wodurch ein 0/1-Matrixdiagramm gebildet und in den Computer eingegeben wird, wobei POPGENE32 verwendet wird, um den Prozentsatz der polymorphen Stellen zu berechnen (PPL) jeder Population, Gendiversitätsindex von Nei (H), Polymorphismusinformationsindex von Shannon (I), Gendifferenzierungskoeffizient (Gst), Gendiversität (Ht),Genetische Vielfalt(Hs), Neis (1978) genetische Identität (I) und genetische Distanz (D) innerhalb einer Population, und eine Clusteranalyse wurde unter Verwendung des UPGMA-Verfahrens durchgeführt.
2. Ergebnisse und Analyse
2.1 Genetische Vielfalt von Cistanche
Alle Proben erhielten Banden mit einem Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 2 200 bp (Abbildung 1, 2). Insgesamt 76 Loci wurden in 60 Proben aus 2 Populationen nachgewiesenCistanche Deserticola, von denen 36 polymorphe Loci waren, die 47,37 Prozent ausmachten , H=0.135 8, I=0.207 2. Unter ihnen beträgt der PPL von Jimsar 39,47 Prozent und der von Gilanty 35,53 Prozent. H ist 0. 0 95 3 bzw. 0.1 070 und I ist 0.15 12 bzw. 0.163 7. Insgesamt 87 Loci wurden bei {{20}}-Individuen aus 4 Cistanche-Populationen nachgewiesen, von denen 24 polymorphe Loci waren, was 27,59 Prozent entspricht, H=0.084 8, Ich=0.1278. Der höchste PPL war Andil mit 25,29 Prozent, während der PPL in Savuzek und Yatungusi (beide mit 19,54 Prozent) niedriger war. H ist 0.062 1 -0.080 0, I ist 0.095 0 -0.116. Die Größe von H und I stimmt mit dem Größentrend der PPL jeder Population überein, und die Koeffizienten sind in Andier am größten, gefolgt von Dayan. Im Fall derselben PPL ist Savuzeks H=0.{{40}} Die Summe I=0.097 0 ist etwas höher als die 0.{{44 }} und 0.095 0 von Yatunguska (Tabelle 2).
Abbildung 1 RAPD-verstärkte Banden einiger WüstenprobenCistanche Deserticola, Grundierung S490 1-10. Garantieproben; 11-20. Jimpster-Proben M-DNA-Marker (200 - 2 000 bp)
Abbildung 2 RAPD-amplifizierte Banden einiger Proben von Cistanche Tubulosa, Primer S2 042 1-20. Xinjiang Andier-Probe M-DNA-Marker (200 - 2 000 bp)
Tabelle 2 Diegenetische VielfaltvonCistanche DeserticolaundCistanche tubulosaBevölkerungen
2.2 Genetische Variationsanalyse von Cistanche
Je nach Niveaugenetische Vielfaltin Populationen (Hs), der Differenzierung zwischen Populationen (Dst) und dem Anteil genetischer Unterschiede zwischen Populationen an den gesamten genetischen Unterschieden (Gst) ist ersichtlich, dass die gesamte genetische Vielfalt von Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, wobei Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, davon Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabelle 3). Die obigen Ergebnisse zeigen, dass es ein gewisses Maß an genetischer Variation zwischen den Populationen gibt. Die Variation zwischen den Wüstenpopulationen von Cistanche deserticola machte 25,46 Prozent der Gesamtvariation aus, und die Variation der Populationen von Cistanche tubulosa machte 17,55 Prozent der Gesamtvariation aus.
Tabelle 3 Genetische Variationsanalyse vonCistanche DeserticolaundCistanche tubulosa.
2.3 Genetische Distanz- und Clusteranalyse unter Cistanche deserticola-Populationen
Der genetische Abstand der beiden Populationen vonCistanche Deserticolaist {{0}}.080 0, und die genetische Identität ist 0.9231. Die genetische Distanz der vier Populationen von Cistanche war 0.012 0-0.031 5, und die genetische Identität war 0.9690-0.988 1 (Tabelle 4) . Die Häufung von Cistanche deserticola- und Cistanche tubulosa-Individuen zeigt, dass die Cistanche deserticola je nach Population in zwei verschiedene Gruppen geclustert werden können, während die verschiedenen Cistanche tubulosa-Individuen nicht nach Population geclustert werden können, was auch auf die genetische Differenzierung zwischen Cistanche deserticola hinweist Populationen ist relativ hoch. Groß, aber die genetische Differenzierung zwischen Populationen von Cistanche tubulosa ist gering.
Tabelle 4 Genetische Identität (unten links) und genetische Distanz (oben rechts) voncistanche tubulosa.
3. Diskussion
3.1 Genetische Vielfalt von Cistanche
Das Level vongenetische Vielfaltvon Pflanzen ist untrennbar mit ihren biologischen Eigenschaften, Lebensräumen, Herkunft und Evolution verbunden. Unter ihnen haben das Zuchtsystem, das Verbreitungsgebiet, die Lebensform sowie die Pollen- und Samenverbreitungsmethoden den größten Einfluss [6]. Nach den statistischen Ergebnissen von Allozymdaten von 499 Pflanzenarten in 165 Gattungen von Ge Song et al. [7] sollte der Polymorphismus von Cistanche auf Artenebene etwa 5 0 Prozent betragen, und der Polymorphismus auf Populationsebene sollte etwa 40 Prozent betragen. Etwa 0,17. Die in diesem Experiment erhaltenen Polymorphismusniveaus sind alle niedriger als diese Durchschnittswerte. Gleichzeitig verglichen mit den durch RAPD-Methoden erhaltenen Mengen an polymorphen Loci für mehrere verbreitete gefährdete Pflanzen, wie 32 Prozent der gefährdeten Art Weißtanne[18], 22,5 Prozent der Zwergpfingstrose und 27,6 Prozent der Purpurpfingstrose [9] ] Es ist ersichtlich, dass die genetische Vielfalt vonCistanche Deserticola etwas unter dem Durchschnitt liegt, während die genetische Vielfalt von Cistanche tubulosa bereits extrem gering ist.
3.2 Gründe für die geringe genetische Vielfalt von Cistanche
Cistanche ist eine spezifische parasitäre Pflanze, die gleichzeitig in engen Wüstengebieten verbreitet ist. Daher kann der einzigartige Lebensstil und der relativ enge Wohnbereich der inhärente Grund dafür seingenetische Vielfaltvon Cistanche ist im Allgemeinen niedriger als die gewöhnlicher Pflanzen.
Der Unterschied beigenetische Vielfaltzwischen Cistanche deserticola und Cistanche tubulosa kann mit dem Unterschied im Verbreitungsgebiet der beiden zusammenhängen und ob sie mit der Wirtsverteilung synchronisiert sind. Das Verbreitungsgebiet von Cistanche tubulosa ist deutlich kleiner als das von Cistanche deserticola, und seine Verbreitung ist extrem unsynchron mit der Wirtspflanze. Studien haben gezeigt, dass es unter Tamarix-Arten eine große Vielfalt gibt. Zhang Juan et al. berichteten, dass die genetische Vielfalt von Tamarix sibiricus bis zu 98,7 Prozent betrug [10], während die genetische Vielfalt von Cistanche extrem gering ist, was auf die langfristige Entwicklung hinweist. Cistanche tubulosa hat in der Geschichte möglicherweise ernsthafte Engpässe erlebt, die zum Verlust einer großen Menge von führtengenetische Vielfalt.
Gleichzeitig wurde laut Untersuchungen festgestellt, dass keiner derCistanche Deserticolainnerhalb von 20 km um die menschlichen Siedlungen konnten ausgegraben werden und normal blühen. Die großen und kleinen Gruben der Cistanche wurden ausgegraben, insbesondere in den Hauptproduktionsgebieten der Cistanche-Röhrenblüte. Daher wurde es durch eine große Menge an Ausgrabungen verursacht. Der Mangel an Herkunft und die Zerstörung des Lebensraums können die wichtigsten menschengemachten Gründe für den Rückgang seingenetische Vielfaltvon Cistanche.
3.3 Genetische Differenzierung von Cistanche
Aufgrund der geografischen Entfernung zwischen Xinjiang und der Inneren Mongolei verursachte die geografische Isolation die Differenzierung und Isolation zwischen denCistanche DeserticolaPopulationen, und die beiden Populationen bildeten aufgrund ihrer Anpassung an die lokalen Lebensraumbedingungen unterschiedliche genetisch unterschiedliche Ökotypen. Aufgrund seines engen Verbreitungsgebiets und des häufigen Genaustauschs zwischen Populationen ist die genetische Differenzierung zwischen Populationen geringer als bei Cistanche deserticola.
3.4 Empfehlungen zum Schutz von Cistanche
Genetische Vielfaltist die Voraussetzung für das langfristige Überleben von Arten, um das Aussterben zu vermeiden. Die Reduzierung vongenetische Vielfaltwird die Fähigkeit der Bevölkerung verringern, sich sowohl kurz- als auch langfristig an Umweltveränderungen anzupassen [11]. Daher ist der Schutz der genetischen Vielfalt von Cistanche sehr wichtig für den Schutz dieser seltenen und wertvollen chinesischen Medizin. Da es sich bei Cistanche um eine Art mit einem besonderen ökologischen Typ handelt, sollte sie hauptsächlich in situ geschützt werden, und die natürliche Schutzbasis der Cistanche sollte entsprechend ihrer genetischen Vielfalt eingerichtet werden. Zum Beispiel fürCistanche tubulosaDa die genetische Vielfalt hauptsächlich aus der Bevölkerung stammt, werden Populationen mit großer genetischer Vielfalt die vorrangigen Schutzobjekte sein [12], wie Minfengs Angier und Yutians Daheyan können als natürliche Schutzbasis für Cistanche aufgeführt werden. Wie für dieCistanche Deserticolahaben die Bevölkerungsgruppen der Inneren Mongolei und Xinjiang erhebliche Veränderungen erfahren, daher sollte die experimentelle Forschung weiter verstärkt werden, um die vorrangig zu schützenden Bevölkerungsgruppen zu bestimmen. Führen Sie gleichzeitig Grundlagenforschung zur Reproduktionsbiologie und Bestäubungsökologie von Cistanche durch, um Informationen für seinen weiteren Schutz bereitzustellen.
Verweise
[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. Identifizierung vonCistancheund Untersuchung kommerzieller medizinischer Materialien. Chinesische medizinische Materialien, 1997, 20(3):117.
[2] Liu Minting. Umfassende Forschung und allgemeine Anwendung von Tamarix-Pflanzen. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.
[3] Fu Guoli. Rotes Buch der chinesischen Pflanzen. Peking: Science Press, 1992.
[4] Das Management Office of the Import and Export of Endangered Species of the People's Republic of China, the Scientific Committee of Endangered Species of the People's Republic of China. Übereinkommen über den internationalen Handel mit gefährdeten Arten freilebender Tiere und Pflanzen (CITES), Anhang II. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. Extraktion und Identifizierung der Gesamt-DNA mehrerer gefährdeter Pflanzen und ihrer Verwandten. Acta Botanik, 1994, 36:528.
[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Pflanzenzüchtungssystem, genetische Struktur und Schutz vongenetische Vielfalt. Biodiversität, 1996, 4(2): 92.
[7] Chen Jiakuan, Yang-Ji. Evolutionsbiologie der Pflanzen. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.
[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. RAPD-Analyse der genetischen Vielfalt der Weißtanne. Chinesische Wissenschaft (C), 1997, 40(2): 145.
[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. Ein vorläufiger Bericht über die RAPD-Analyse von Zwergpfingstrose und Purpurpfingstrose. Chinesisches Journal für Pflanzentaxonomie, 1995, 33(4): 350.
[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Eine Vorstudie zuGenetische Vielfaltder natürlichen Populationen von Tamarix lanceolate. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.
[11] Ellstrand NC, Elam DR. Populationsgenetische Folgen einer kleinen Populationsgröße: Implikationen für die Pflanzenerhaltung. Annual Review Ecology and Systematics, 1993, 34:217.
[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Das Prinzip der Populationsgenetik und seine Anwendung zum Schutz seltener und gefährdeter Pflanzen. Biodiversität, 1999, 7(4): 340.
Aus: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29, Ausgabe 8. August 2004
