Cistanche Deserticola-Polysaccharid dämpft Osteoklastogenese und Knochenresorption durch Hemmung der RANKL-Signalübertragung und der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies

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Dezhi-Song et al

Osteoporose ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Osteopenie und eine Verschlechterung der Knochenmikrostruktur gekennzeichnet ist. Osteoklasten sind die primären Effektorzellen, die die Knochenmatrix abbauen, und ihre abnormale Funktion führt zur Entwicklung von Osteoporose. Die Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) während des Zellstoffwechsels fördert die Proliferation und Differenzierung von Osteoklasten und spielt daher eine wichtige Rolle bei Osteoporose.CistancheDeserticolaPolysaccharid(CDP) besitzt Antitumor-, entzündungshemmende und antioxidative Aktivität. Die Wirkung von CDP auf Osteoklasten ist jedoch unklar. In dieser Studie wurden Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung, Immunfluoreszenz, reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion und Western-Blot-Analyse verwendet, um diese CDP nachzuweisen(CistancheDeserticolaPolysaccharid)gehemmte Osteoklastogenese und Hydroxylapatit-Resorption. Außerdem CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hemmte auch die Expression von Osteoklasten-Markergenen, einschließlich Ctsk, Mmp9 und Acp5, und hatte keine Wirkung auf die Expression des Rezeptoraktivators des Kernfaktors κB (RANK). Mechanistische Analysen ergaben, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)erhöht die Expression antioxidativer Enzyme, um die RANKL‐vermittelte ROS‐Produktion in Osteoklasten abzuschwächen, und hemmt den Nuklearfaktor aktivierter T‐Zellen und die Aktivierung der mitogenaktivierten Proteinkinase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CDP ein mögliches Medikament für die Behandlung von Osteoporose darstellt, die durch übermäßige Osteoklastenaktivität verursacht wird.

SCHLÜSSELWÖRTERKnochenresorption,CistancheDeserticolaPolysaccharid, MAPK, Osteoklasten, reaktive Sauerstoffspezies

Cistanche-Bodybuilding

1|EINLEITUNG

Das Gleichgewicht zwischen Knochenbildung, vermittelt durch Osteoblasten, und Knochenresorption, vermittelt durch Osteoklasten, spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Knochenstoffwechsels (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Wenn die Knochenresorption die Knochenbildung übersteigt, tritt Osteoporose auf, die durch eine verringerte Knochenmasse und eine Schädigung der Knochenmikrostruktur gekennzeichnet ist (Ikeda, 2008). Osteoporose ist eine häufige Erkrankung bei älteren Menschen und postmenopausalen Frauen, und ihre Pathogenese ist noch nicht vollständig aufgeklärt (Cooper & Melton, 1992). Östrogenmangel ist eine Hauptursache für Osteoporose (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Darüber hinaus können reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch den Rezeptoraktivator des Nuklearfaktor-κB-Liganden (RANKL) induziert und mit der Osteoklastenbildung assoziiert werden (Yip et al., 2005) und somit zur Entstehung von Osteoporose beitragen (Manolagas, 2010). Einige Studien haben herausgefunden, dass ein Mangel an Nrf2-Antioxidantien die ROS-Spiegel erhöht und die RANKL-induzierte Differenzierung von Osteoklasten fördert (Hyeon, Lee, Yang & Jeong, 2013). Daher sollte die Reduzierung der ROS-Produktion während der Osteoklastendifferenzierung als therapeutische Strategie zur Behandlung von Osteoporose evaluiert werden.

Osteoklasten stammen von der hämatopoetischen Linie der Monozyten oder Makrophagen ab und sind die einzigen mehrkernigen Zellen, die eine Knochenresorption durchführen (Teitelbaum, 2000). Daher ist die Erforschung der Osteoklastenbildung von großer Bedeutung für die Entwicklung wirksamer Therapien für Erkrankungen des Knochenstoffwechsels (Lorenzo, 2017). Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) und RANKL, produziert von Osteoblasten und aktivierten T-Zellen, sind wichtige Zytokine, die die Osteoklastogenese regulieren (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL induziert die Expression des Kernfaktors aktivierter T-Zellen (NFATc1), der ein entscheidender Transkriptionsfaktor ist, der während der Osteoklastenbildung aktiv ist (Ishida et al., 2002). Aktiviertes NFATc1 fördert die Expression von Osteoklasten-Markergenen wie tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAcP) und Cathepsin K (CTSK), die die Osteoklastogenese und Osteoklastenfunktion regulieren (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

CistancheDeserticolaPolysaccharid(CDP) wird aus den fleischigen Stängeln von isoliertCistancheund besitzt Immunregulierung, Antitumor, Anti-Aging und andere pharmakologische Wirkungen (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo & Du, 2012). CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hatten eine hemmende Wirkung auf die Lipopolysaccharid-induzierte Stickoxid (NO)-Produktion in Maus-Mikrogliazellen (BV-2-Zellen; Nan et al., 2013). Außerdem ist ein phenylethanoidreicher Extrakt (ECD) vonCistancheverbesserten die Schwimmfähigkeit von Mäusen, indem sie Muskelschäden verringerten, die Ansammlung von Milchsäure verzögerten und die Energiespeicherung verbesserten (Cai et al., 2010). Die Wirkungen von CDP auf Osteoklastenfunktion und -aktivität bleiben jedoch unbekannt.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hemmt die RANKL‐induzierte Osteoklastendifferenzierung und Knochenresorption. Der zugrunde liegende Mechanismus war dieser CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)verstärkt die Expression antioxidativer Enzyme, um die ROS-Produktion abzuschwächen, und unterdrückt dann RANKL-aktivierte NFAT- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Signalkaskaden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)könnte zur Behandlung von Osteoporose verwendet werden, die durch übermäßige osteoklastische Knochenresorption verursacht wird.

Maca-Ginseng-Cistanche

2|MATERIALEN UND METHODEN

2.1|Materialien

CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)(Reinheit > 98 Prozent) wurde von Solarbio (Peking, China) gekauft und mit einer Vorratskonzentration von 1 mM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt. Antikörper sind spezifisch für c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, phosphoryliertes (p)-ERK, p-p38, p-JNK und ‐Actin wurden von Santa erhalten Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Antikörper gegen V‐ATPase d2 wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (H. Feng et al., 2009). Das Testsystem für 3‐(4,5‐Dimethylthiazol‐2‐yl)‐5‐(3‐carboxymethoxyphenyl)‐2‐(4‐sulfophenyl)‐2H‐tetrazolium (MTS) und Luciferase wurde von Promega (Sydney, Australien) bezogen. . Rekombinantes M-CSF wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) gekauft. Rekombinantes GST-rRANKL-Protein wurde wie zuvor beschrieben exprimiert und gereinigt (Xu et al., 2000).

2.2|Zellkultur

RAW264.7-Zellen (Maus-Makrophagenzellen) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) erhalten und in modifiziertem essentiellem Minimalmedium (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australien), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM, kultiviert L‐Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Vollmedium). Aus dem Knochenmark stammende Monozyten (BMMs) wurden aus 6 Wochen alten C57BL/6J-Mäusen isoliert, die gemäß den vom Animal Ethics Committee der University of Western Australia (RA/3/100/1244) genehmigten Verfahren eingeschläfert wurden. Die Röhrenknochen wurden frei von Weichteilen präpariert und das Knochenmark wurde von Femur und Tibia gespült, die dann in einem Vollmedium in Gegenwart von M-CSF (50 ng/ml) kultiviert wurden.

2.3|Osteoklastogenese-Assay

BMMs wurden in 96-Well-Kulturplatten mit einer Dichte von 6 × 103 Zellen pro Well ausplattiert und mit einem vollständigen Medium, das M-CSF (50 ng/ml) und GST-rRANKL (100 ng/ml) enthielt, in Gegenwart von oder behandelt Fehlen unterschiedlicher CDP-Konzentrationen(CistancheDeserticolaPolysaccharid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>drei Kerne) wurden als Osteoklasten identifiziert.

2.4|Zytotoxizitätstests

BMMs wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit 6 × 103 Zellen pro Vertiefung ausgesät und über Nacht zum Anhaften belassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit unterschiedlichen CDP-Konzentrationen inkubiert(CistancheDeserticolaPolysaccharid). Nach weiteren 48 h wurde die MTS-Lösung (20 &mgr;l/Vertiefung) zugegeben und 2 h mit Zellen inkubiert. Die Extinktion bei 490 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Immunfluoreszenzfärbung

BMMs wurden in einer Dichte von 6 × 103 Zellen pro Vertiefung in Gegenwart von M-CSF (50 ng/ml) über Nacht ausgesät. Die Zellen wurden dann mit M-CSF und GST-rRANKL (100 ng/ml) stimuliert, bis sich reife Osteoklasten bildeten. Die Osteoklasten wurden dann mit unterschiedlichen CDP-Konzentrationen behandelt(CistancheDeserticolaPolysaccharid)für 48 h vor Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd, Permeabilisierung mit 0,1 % Triton X-100-PBS und Blockierung mit 3 % Rinderserumalbumin in PBS. Vorbereitete Zellen wurden mit Rhodamin‐konjugiertem Phalloidin für 45 min im Dunkeln inkubiert, um F‐Actin zu färben. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, die Zellkerne mit 4′,6‐Diamidino‐2‐phenylindol (DAPI) gegengefärbt und mit Deckgläsern für die konfokale Mikroskopie fixiert.

Cistanche-Erfahrung

2.6|Hydroxylapatit-Resorptionsassay

Zur Messung der Osteoklastenaktivität wurden BMMs (1 × 105 Zellen pro Vertiefung), die auf kollagenbeschichteten Platten mit sechs Vertiefungen (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) kultiviert wurden, mit GST-rRANKL (100 ng/ml) und M-CSF (50 ng/ml) stimuliert. ml), bis reife Osteoklasten erzeugt wurden (Zhou et al., 2016). Die Zellen wurden dann unter Verwendung einer Zelldissoziationslösung (Sigma-Aldrich) vorsichtig von der Platte abgelöst, und gleiche Anzahlen von reifen Osteoklasten wurden auf einzelne Vertiefungen in Hydroxylapatit-beschichteten 96-Well-Platten (Corning Osteoassay, Corning, NY) ausgesät. Reife Osteoklasten wurden in einem Medium inkubiert, das GST-rRANKL und M-CSF mit oder ohne CDP enthielt(CistancheDeserticolaPolysaccharid)in den angegebenen Konzentrationen. Nach 48 Stunden wurde die Hälfte der Vertiefungen immunhistochemisch auf TRAcP-Aktivität gefärbt, wie oben beschrieben, um die Anzahl mehrkerniger Zellen pro Vertiefung zu bestimmen. Die verbleibenden Vertiefungen wurden 10 min lang gebleicht, um Zellen zu entfernen und eine Messung der resorbierten Bereiche zu ermöglichen. Resorbierte Bereiche wurden unter Standard-Lichtmikroskopie fotografiert und die Image J-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) wurde verwendet, um die prozentuale Fläche der Hydroxylapatit-Oberfläche, die von den Osteoklasten resorbiert wurde, zu quantifizieren.

2.7|Luciferase-Reporter-Assays

Um die transkriptionelle Aktivierung von NFATc1 zu untersuchen, wurden RAW264.7-Zellen stabil mit einem NFATc1-responsiven Luciferase-Reporterkonstrukt transfiziert (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfizierte Zellen wurden in Platten mit 48 Vertiefungen mit einer Dichte von 1,5 × 105 Zellen pro Vertiefung kultiviert und mit verschiedenen Konzentrationen von CDP vorbehandelt(CistancheDeserticolaPolysaccharid)für 1 Std. Nach der Vorbehandlung wurden die Zellen mit GST-rRANKL (100 ng/ml) für 24 Stunden stimuliert, und die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Luciferase-Reporter-Assay-Systems gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega) gemessen.

2.8|Quantitative Analyse der reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR).

Gesamt-RNA wurde aus Zellen unter Verwendung von Trizol-Reagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers (Thermo Fisher Scientific) isoliert. Komplementäre DNA wurde unter Verwendung der reversen Transkriptase des Moloney‐Mäuseleukämievirus mit 1 μg RNA‐Matrize und Oligo‐dT‐Primern synthetisiert. Die Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikation spezifischer Sequenzen wurde unter Verwendung des folgenden Programms durchgeführt: 94 Grad für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 Grad für 40 s, 60 Grad für 40 s und 72 Grad für 40 s und einem abschließenden Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72 Grad. Die detaillierte Information spezifischer Primer ist in Tabelle 1 gezeigt. Relative Boten-RNA-Spiegel wurden durch Normalisierung auf die Expression des Haushaltsgens Hmbs berechnet.

2.9|Western-Blot-Analyse

BMMs wurden in Vollmedium mit M-CSF in Platten mit sechs Vertiefungen kultiviert und mit GST-rRANKL (100 ng/ml) für die angegebenen Zeiten stimuliert. Zellen wurden in Radioimmunpräzipitations-Lysepuffer lysiert und Proteine ​​wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Poly(vinylidenfluorid)-Membranen (GE Healthcare, Silverwater, Australien) übertragen. Die Membranen wurden in 5 % Magermilch für 1 Stunde blockiert und dann mit verschiedenen spezifischen Primärantikörpern unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 Grad sondiert . Die Membranen wurden gewaschen und anschließend mit Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert. Die Antikörperreaktivität wurde dann mit einem verstärkten Chemilumineszenzreagens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) nachgewiesen und mit einem Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare) sichtbar gemacht.

2.10|Intrazellulärer ROS-Nachweis

Intrazelluläre ROS-Spiegel wurden mit einem 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat-Assay-Kit für zellulären ROS-Nachweis (Abcam, Melbourne, Australien) nachgewiesen. BMMs (5 × 103 Zellen pro Vertiefung) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert und mit RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) und CDP für 72 Stunden behandelt. Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden mit 2′,7′‐Dichlorfluoresceindiacetat gemessen, das in Gegenwart von ROS zu fluoreszierendem DCF oxidiert. Die Zellen wurden in Hank-Puffer gewaschen und im Dunkeln für 30 min mit 10 µM DCFH-DA inkubiert. Bilder wurden unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie erhalten.

2.11|Statistische Analysen

Alle Daten sind repräsentativ für mindestens drei Experimente, die dreifach durchgeführt wurden, sofern nicht anders angegeben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Zur Bestimmung der Signifikanz der Unterschiede zwischen den Ergebnissen wurde eine Einweg-Varianzanalyse gefolgt von Post-hoc-Tests nach Student-Newman-Keuls verwendet, wobei p < 0,05="" als="" signifikant="" angesehen="">

3|ERGEBNISSE

3.1|CDP hemmt die RANKL‐induzierte Osteoklastogenese und Osteoklastenfusion

Um festzustellen, ob CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)RANKL-induzierte Osteoklastenbildung unterdrücken können, führten wir zuerst einen Osteoklastogenese-Assay mit Maus-BMMs durch (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMMs wurden mit RANKL und M-CSF für 5 Tage mit steigenden CDP-Konzentrationen behandelt. CDP verringerte die Zahl der TRAcP‐positiven vielkernigen Zellen bei der Konzentration von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)erreichte 5 µM oder höher (Abbildung 1a,b). CDP zu bewerten(CistancheDeserticolaPolysaccharid)Toxizität und bestätigen, dass diese Ergebnisse nicht den Zelltod oder die Zellzahl widerspiegeln, führten wir einen MTS-Assay durch. BMMs wurden mit RANKL und M-CSF für 48 Stunden mit unterschiedlichen Dosierungen von CDP behandelt(CistancheDeserticolaPolysaccharid). CDP hatte bei einer Konzentration von 15 µM oder weniger keine Wirkung auf die BMM-Proliferation (Abbildung 1c).

Um die Auswirkungen von CDP zu testen(CistancheDeserticolaPolysaccharid)bei der Osteoklastenfusion wurden Osteoklasten mit RANKL- und M-CSF-Behandlung mit oder ohne unterschiedliche CDP-Dosen induziert(CistancheDeserticolaPolysaccharid). Osteoklasten wurden mit Rhodamin‐Phalloidin und DAPI gefärbt, um die Anzahl der Kerne pro Osteoklasten zu bestimmen (Abbildung 2a). Sowohl die Anzahl der Osteoklasten als auch die durchschnittliche Anzahl von Kernen pro Osteoklasten nahmen nach CDP ab(CistancheDeserticolaPolysaccharid)Behandlung (5–10 µM; Abbildung 2b,c). Daher CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hatten dosisabhängig hemmende Wirkungen auf die RANKL‐induzierte Osteoklastogenese und Osteoklastenfusion.

3.2|CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)dämpft die RANKL‐induzierte osteoklastische Hydroxylapatitresorptionsaktivität

Ein Hydroxyapatit-Resorptionsassay wurde durchgeführt, um die Wirkung von CDP nachzuweisen(CistancheDeserticolaPolysaccharid)auf die Osteoklastenfunktion (Abbildung 3a). Nach einer 24-stündigen Inkubation änderte sich die Anzahl der Osteoklasten pro Vertiefung nicht, während die Hydroxylapatit-Resorptionsfläche durch die Behandlung mit 5 und 10 µM CDP im Vergleich zu den Kontrollgruppen signifikant verringert wurde (Abbildung 3b,c). Diese Ergebnisse zeigen, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hat starke hemmende Wirkungen sowohl auf die Osteoklastenbildung als auch auf die Osteoklastenresorptionsaktivität ohne zytotoxische Wirkungen.

3.3|CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hemmt die Genexpression des Osteoklastenmarkers

Um die hemmenden Wirkungen von CDP weiter zu untersuchen(CistancheDeserticolaPolysaccharid)zur Osteoklastogenese und osteoklastischen Knochenresorption wurden BMMs mit RANKL und M-CSF für 5 Tage mit unterschiedlichen CDP-Konzentrationen behandelt(CistancheDeserticolaPolysaccharid). Anschließend wurde eine RT‐PCR durchgeführt, um die Expression von Osteoklastenmarkergenen nachzuweisen. Die Expression von Nfatc1, einem entscheidenden Transkriptionsfaktor während der Osteoklastogenese, wurde durch CDP gehemmt(CistancheDeserticolaPolysaccharid)in dosisabhängiger Weise (Abbildung 4a). Außerdem CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)(5 und 10 µM) regulierten die Expression von Genen im Zusammenhang mit der Knochenresorption herunter, einschließlich Mmp9, Ctsk und Acp5 (Abbildung 4b–d).

3.4|CDP unterdrückt die NFATc1-Aktivität und die nachgeschaltete Proteinexpression

Um die Wirkung von CDP zu untersuchen(CistancheDeserticolaPolysaccharid)zur RANKL‐induzierten NFATc1‐Aktivität wurde ein Luciferase‐Reporterassay durchgeführt. Behandlung mit CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid), bei Konzentrationen von 5 µM und höher, hemmte die RANKL‐induzierte NFATc1‐Aktivität signifikant (Abbildung 5a). Darüber hinaus zeigte die Western-Blot-Analyse, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)signifikant unterdrückte die Proteinexpression von NFATc1 und c-Fos in BMMs, die 3 und 5 Tage lang mit RANKL und M-CSF behandelt wurden (Abbildung 5b). Darüber hinaus wurde die Expression von Proteinen, die mit der Osteoklastenfunktion in Verbindung stehen, wie V-ATPase-d2 und CTSK, in Gegenwart von CDP herunterreguliert(CistancheDeserticolaPolysaccharid)im Vergleich zu Kontrollgruppen. CDP hatte jedoch keine Auswirkung auf die RANK-Expression (Abbildung 5b).

3.5|CDP fördert die Expression von antioxidativen Enzymen, um die ROS-Produktion während der RANKL-induzierten Osteoklastogenese abzufangen

Um den zugrunde liegenden Mechanismus der CDP‐abhängigen Osteoklastogenesehemmung zu untersuchen, wurden BMMs mit RANKL (100 ng/ml) und M‐CSF (50 ng/ml) zusammen mit PBS oder CDP behandelt(CistancheDeserticolaPolysaccharid)für 72 Std. Wir untersuchten die Wirkung von CDP auf die durch RANKL stimulierte intrazelluläre ROS-Produktion. Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden durch die RANKL-Behandlung erhöht, die durch CDP abgeschwächt wurde (5 und 10 µM; Fig. 6a). Sowohl die Zahl der ROS‐positiven Zellen als auch die Intensität der ROS‐Färbung wurden durch die CDP‐Behandlung dosisabhängig verringert (Abbildung 6b,c). Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)förderten die Expression von Thioredoxin (TRX1) und Glutathionreduktase (GSR), während sie die Expression von induzierbarer Stickoxidsynthase (NOS2) in BMMs unterdrückten, die 3 Tage lang mit RANKL und M-CSF behandelt wurden (Abbildung 6d).

Um weiter zu untersuchen, ob CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)Osteoklastendifferenzierung durch Reduzierung der ROS-Produktion unterdrückt, behandelten wir dann BMMs mit Peroxid (10 µM), um den hohen ROS-Status in Zellen zu imitieren. BMMs wurden durch RANKL und M-CSF für 3 Tage induziert und die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse und RT-PCR zeigten, dass Peroxid die NFATc1- und c-Fos-Expression im Vergleich zu den Kontrollgruppen förderte. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen in Abbildung 5 wurde die Expression von NFATc1 und c‐Fos durch CDP unterdrückt(CistancheDeserticolaPolysaccharid)während Peroxid die hemmende Wirkung von CDP rettete (Abbildung 6e,f). Diese Daten zeigten, dass CDP die Expression von NFATc1 und c‐Fos durch Abfangen der ROS‐Produktion unterdrückte.

3.6|CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)unterdrückt MAPK-Signalwege während der RANKL-induzierten Osteoklastogenese

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)Behandlung der RANKL‐vermittelten TRAF6‐Expression und Aktivierung des MAPK‐Signalwegs. Nach einer zweistündigen Inkubation in serumfreiem Medium wurden die BMMs mit RANKL, mit oder ohne CDP, für 60 min stimuliert. Die Stimulation mit CDP (10 µM) hatte keine Auswirkung auf die TRAF6-Expression und schwächte die Phosphorylierung von JNK2 und ERK1/2 bei 10 und 20 min ab (Abbildung 7). Zusätzlich wurde die p38-Phosphorylierung durch CDP signifikant gehemmt(CistancheDeserticolaPolysaccharid)Behandlung von 60 min im Vergleich zu Kontrollgruppen (Abbildung 7). Diese Daten zeigen, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)unterdrückt RANKL‐induzierte MAPK‐Signalwege, was mit seiner hemmenden Wirkung auf die Bildung und Aktivität von Osteoklasten übereinstimmt.

4|DISKUSSION

Cistanche, bekannt als „Wüstenginseng“, hat in letzter Zeit viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen wegen seiner Fähigkeit, die Immunität zu modulieren und während Alterung und oxidativem Stress schützend zu wirken (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Es wurde gezeigt, dass Phenylpropanoid-substituierte Glykoside, die wichtigsten aktiven Komponenten von Cistanche, die NO-Aktivität in Makrophagen hemmen (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Außerdem einCistancheExtrakt reduzierte oxidativen Stress im reperfundierten Myokard nach Ischämie und spielte eine bedeutende Rolle bei der Hemmung apoptotischer Wege, die zu Kardioprotektion führten (Yu, Li, & Cao, 2016). Als wichtiger Bestandteil von Cistanche, CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hat eine Vielzahl von pharmakologischen Funktionen. Unsere aktuelle Studie ergab, dass CDP die Differenzierung und Aktivierung von RANKL-aktivierten Osteoklasten unterdrückte, indem es die ROS-Produktion sowie die NFAT- und MAPK-Aktivierung abschwächte.

Als saure Phosphatase existiert TRAcP in einer Vielzahl von Zellen und ist in Osteoklasten und Alveolarmakrophagen reichlich vorhanden (Snipes, Lam, Dodd, Gray & Cohen, 1986). TRAcP ist ein charakteristisches Enzym von Osteoklasten und seine Expression steht in engem Zusammenhang mit der Osteoklastenfunktion, die als Indikator für Osteoklastenaktivität und Knochenresorption angesehen wird (Minkin, 1982). In unserer Studie CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hemmte die Anzahl TRAcP‐positiver Zellen, was darauf hinweist, dass die RANKL‐induzierte Osteoklastogenese durch CDP blockiert wurde(CistancheDeserticolaPolysaccharid). Der Abbau der Knochenmatrix durch Osteoklasten hängt von Cathepsin K (CTSK) und MMPs ab (Gruber, 2015). Hier regulierte CDP die Expression von Osteoklasten-Funktionsgenen wie Mmp9, Ctsk und Acp5 signifikant herunter.

Osteoklastendifferenzierung und -funktion werden durch mehrere Signalwege reguliert (Boyle, Simonet & Lacey, 2003). Nach der Bindung an RANK rekrutiert RANKL das Adapterprotein TRAF6, um die Expression von NFATc1 zu aktivieren, das ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die Osteoklastenbildung ist und die osteoklastenspezifische Genexpression beeinflusst, einschließlich TRAcP und CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). In dieser Studie fanden wir heraus, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hatte keine Wirkung auf die RANK- und TRAF6-Expression in Osteoklasten. Allerdings CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)hemmte die RANKL‐induzierte NFATc1‐Aktivierung während der Osteoklastogenese von BMMs. Außerdem wurde gezeigt, dass ROS, das von Mitochondrien im Prozess der Abgabe von Elektronen produziert wird, die Proliferation und Differenzierung von Osteoklasten fördert und den Knochenmatrixabbau reguliert (Ha et al., 2004). Eine kürzlich durchgeführte Studie ergab, dass RANKL den Bach1-Kernimport induzierte und die Nrf2-vermittelte antioxidative Enzymproduktion abschwächte, wodurch die intrazelluläre ROS-Expression und Osteoklastogenese bei Mäusen verstärkt wurden (Kanzaki et al., 2017). Darüber hinaus verstärkte eine erhöhte intrazelluläre ROS-Erzeugung durch Homocystein die Bildung und Aktivität von Osteoklasten (Koh et al., 2006). Unsere Studie ergab, dass CDP die ROS-Ansammlung in Osteoklasten reduzierte, indem es die NOS2-Expression hemmte und die Expression antioxidativer Enzyme wie TRX1 und Glutathionreduktase förderte. Als wir BMMs mit Peroxid behandelten, um die intrazelluläre ROS-Akkumulation zu verstärken, zeigten die Ergebnisse, dass erhöhtes ROS die NFATc1-Expression verbessern könnte, dass ROS NFATc1 vorgeschaltet war. Wir fanden auch heraus, dass Peroxid die hemmende Wirkung von CDP auf die NFATc1-Expression rettete. Unsere Daten deuten also darauf hin, dass CDP die ROS-Akkumulation unterdrückt, um die NFATc1-Expression zu hemmen und dann die Osteoklastenbildung und -funktion zu unterdrücken.

ERK, JNK und p38 gehören zur MAPK-Familie, die auch an der Regulation der Osteoklasten-Differenzierung beteiligt ist (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktiviert den MAPK-Weg, indem es die Phosphorylierung von ERK, JNK und p38 erhöht (Mizukami et al., 2002). Wir haben dieses CDP demonstriert(CistancheDeserticolaPolysaccharid)unterdrückten die RANKL‐vermittelte Phosphorylierung von Schlüsselproteinen im MAPK‐Signalweg und trugen damit zur inhibitorischen Wirkung von CDP auf die Expression von Osteoklastenmarkergenen bei. Unseres Wissens nach ist dies die erste Studie, die die hemmende Wirkung von CDP zeigt(CistancheDeserticolaPolysaccharid)auf ROS-Produktion, NFAT- und MAPK-Aktivierung, die neuartige Wirkungsmechanismen von CDP in vitro darstellen.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)dämpft die Osteoklastogenese und Hydroxyapatit-Resorption sowie die Expression von Osteoklasten-Markergenen, einschließlich Ctsk, Mmp9 und Acp5. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)war in der Lage, die RANKL‐vermittelte ROS‐Produktion sowie die NFAT‐ und MAPK‐Aktivierung zu unterdrücken (Abbildung 8). Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)könnte ein Wirkstoffkandidat für die Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit Osteoklasten sein, die von einer ROS-Überproduktion begleitet werden.

ABBILDUNG 8 Schematisches Diagramm von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)Funktion bei der Differenzierung von Osteoklasten. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharid)unterdrückt die RANKL‐induzierte ROS‐Produktion sowie die NFATc1‐ und MAPK‐Aktivierung und hemmt somit die Osteoklastogenese. CDP,CistancheDeserticolaPolysaccharid; MAPK, mitogenaktivierte Proteinkinase; NFATc1, Kernfaktor aktivierter T-Zellen; RANKL, Rezeptoraktivator des Kernfaktor-κB-Liganden; ROS, reaktive Sauerstoffspezies [Abbildung in Farbe kann unter wileyonlinelibrary.com eingesehen werden]

DANKSAGUNGEN

Diese Studie wurde von der Nature Science Foundation of China (81572164), dem National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), der Natural Science Foundation of Guangxi Province (2016GXNSFAA380295) und dem University Science and Technology Research Project of Guangxi unterstützt Provinz (KY2015YB054). Es wird auch teilweise unterstützt durch Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013-15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards und the Australian Health and Medical Research Council (NHMRC, Nr. 1107828 und 1027932).

INTERESSENSKONFLIKTE

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Aus: 'CistancheDeserticolaPolysacchariddämpft Osteoklastogenese und Knochenresorption durch Hemmung der RANKL-Signalübertragung und der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies von Dezhi Song et al

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684