Cistanche Deserticola-Polysaccharide lindern den kognitiven Rückgang bei alternden Modellmäusen, indem sie die Darmmikrobiota-Gehirn-Achse wiederherstellen

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao 1,*, Bing Li 1,*, Hong Liu 1, Yajuan Tian 2, Chao Gu 1, Xiaoli Du 1, Ren Bu 1, Jie Gao 1, Yang Liu 1, Gang Li 1

ABSTRAKT

Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Veränderungen in der Darmmikrobiota-Gehirn-Achse die kognitive Beeinträchtigung mit dem Alter vorantreiben können. In der vorliegenden Studie beobachteten wir, dass eine verlängerte Verabreichung von D-Galactose an Mäuse einen kognitiven Rückgang, mikrobiologische Dysbiose im Darm, periphere Entzündungen und oxidativen Stress auslöste. In diesem Modell des altersbedingten kognitiven VerfallsCistanche deserticola-Polysaccharide(CDPS) verbesserte die kognitive Funktion bei mit D-Galactose behandelten Mäusen durch Wiederherstellung der mikrobiellen Homöostase im Darm, wodurch oxidativer Stress und periphere Entzündungen reduziert wurden. Die vorteilhaften Wirkungen von CDPS bei diesen alternden Modellmäusen wurden durch Ablation der Darmmikrobiota mit Antibiotika oder Immunsuppression mit Cyclophosphamid aufgehoben. Serum-Metabolom-Profile zeigten, dass die Spiegel von Kreatinin, Valin, L-Methionin, o-Toluidin, N-Ethylanilin, Harnsäure und Prolin bei den alternden Modellmäusen alle verändert waren, aber durch CDPS wiederhergestellt wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass CDPS die kognitive Funktion in einem D-Galactose-induzierten Alterungsmodell bei Mäusen verbessert, indem es die Homöostase der Darmmikrobiota-Hirn-Achse wiederherstellt, was ein Aminosäureungleichgewicht, periphere Entzündungen und oxidativen Stress lindert. CDPS zeigt somit therapeutisches Potenzial für Patienten mit Gedächtnis- und Lernstörungen, insbesondere solchen, die mit Darmmikrobendysbiose in Verbindung stehen.

Cistanche DeserticolaPolysaccharide

EINLEITUNG

Die verlängerte Verabreichung von D-Galactose (D-Gal) und Berylliumsalzen induziert Alterung in experimentellen Tiermodellen und in-vitro-Primärzellkulturen und wird verwendet, um Mechanismen zu identifizieren, die dem natürlichen Alterungsprozess zugrunde liegen [1–4]. Frühere Studien zeigen, dass der kognitive Rückgang bei D-Galactose-induzierten alternden Modellmäusen mit reduzierten Proteinspiegeln des Nervenwachstumsfaktors (NGF) und erhöhten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im Gehirn zusammenhängt, die beide eine Degeneration der hippocampalen Neuronen verursachen und reduzieren Neurogenese [3, 4]. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass sich die Zusammensetzung und Anzahl der menschlichen Darmmikrobiota während des Alterungsprozesses signifikant verändert [5].

Cistanche Deserticolaist ein Kraut, das hauptsächlich in der nordwestlichen Wüstenregion Chinas wächst und in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet wird. Es ist allgemein als „Ginseng der Wüste“ bekannt. Cistanche deserticola-Extrakte enthalten mehrere pharmakologisch aktive Verbindungen, einschließlich Phenylethanoidglykoside, Iridoide, Lignose, Oligosaccharide, Polysaccharide und Aminosäuren; diese Verbindungen werden mit entzündungshemmenden, antioxidativen, antiseneszenten, neuroprotektiven und immunmodulatorischen Eigenschaften in Verbindung gebracht [6, 7]. Beispielsweise wurden aus Cistanche deserticola extrahierte Polysaccharide in der traditionellen chinesischen Medizin zur Behandlung von Darmkrebs eingesetzt [8]. Eine breite Palette schwach toxischer Polysaccharide mit nützlichen Bioaktivitäten wurde aus mehreren Organismen isoliert, wie z. B. Chuanqiong-Polysaccharid, Ganoderma lucidum-Polysaccharid und Lycium barbarum-Polysaccharid [9–11]. CDA-

0.05 ist ein aus Cistanche deserticola isoliertes Galactoglucan, das das Wachstum mehrerer nützlicher Darmbakterien fördert, darunter mehrere Arten von Bacteroides und Lactobacillus [12].

Die zugrunde liegenden Mechanismen des normalen Alterungsprozesses sind auch an mehreren menschlichen Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen, koronarer Atherosklerose, Typ-2-Diabetes (T2DM) und Bluthochdruck beteiligt [13, 14]. Neuere Studien haben gezeigt, dass Veränderungen der Darmflora eine bedeutende Rolle beim Altern des Menschen spielen [15]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass eine verlängerte Verabreichung von D-Galactose an experimentelle Mäuse und Ratten den normalen Alterungsprozess nachahmt und ein nützliches Modell zur Untersuchung altersbedingter Phänotypen wie z. Darüber hinaus zeigen D-Galactose-induzierte alternde Modellmäuse Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota [17]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota zu einem kognitiven Rückgang bei den D-Galactose-induzierten alternden Modellmäusen führen können, und untersuchten, ob Cistanche-Deserticola-Polysaccharide (CDPS) den kognitiven Rückgang lindern können, indem sie die Dysbiose der Darmmikrobiota wiederherstellen.

Cistanche Deserticola

ERGEBNISSE

D-Galactose-induzierte alternde Modellmäuse zeigen kognitiven Verfall und mikrobiologische Dysbiose im Darm

Wir analysierten die Verhaltensleistung von Wildtyp (WT)-Mäusen und solchen, die 2 Monate lang mit 150 mg D-gal pro kg Körpergewicht (Modell oder Mod) behandelt wurden, unter Verwendung von neuartigen Objekterkennungs- und Morris-Wasserlabyrinth (MWM)-Tests. Die bevorzugten Indexwerte im neuartigen Objekterkennungstest waren bei den Mäusen der Mod-Gruppe im Vergleich zu den Mäusen der WT-Gruppe signifikant reduziert (Abbildung 1A, 1B). Die MWM-Testergebnisse zeigten, dass die Fluchtlatenzzeit nach dem sechsten Tag in der Mod-Gruppe im Vergleich zur WT-Gruppe signifikant verlängert war (Abbildung 1C, 1D). Darüber hinaus wurden Zielplattformüberquerungen und Schwimmzeiten innerhalb des Zielquadranten in der Mod-Gruppe im Vergleich zur WT-Gruppe signifikant reduziert (Abbildung 1E, 1F). Diese Ergebnisse zeigten eine signifikante Abnahme der Lern- und Gedächtnisfähigkeiten der D-Gal-induzierten Alterungsmodellmäuse.

Anschließend analysierten wir die Unterschiede in der Häufigkeit und Zusammensetzung der mikrobiellen Phyla, Gattungen und Arten des Darms in den Kotproben der Mod- und WT-Mäusegruppen unter Verwendung von 16S-ribosomaler RNA (rRNA)-Sequenzierungsdaten aus Kotproben. Die vorherrschende Darmflora in den Mäusen der WT- und Mod-Gruppen waren Firmicutes und Bacteroides. Allerdings war die Häufigkeit von Bacteroides in der Mod-Gruppe im Vergleich zur WT-Gruppe signifikant reduziert und die Häufigkeit von Firmicutes signifikant erhöht (Abbildung 2A). Als nächstes führten wir eine lineare Diskriminanzanalyse (LDA) durch, um die LDA-Effektgröße (LEfSe) zu bestimmen, gefolgt von Kruskal-Wallis- und Wilcoxon-Tests, um die relative Häufigkeit verschiedener Taxa in den Mäusen der WT- und Mod-Gruppe zu bewerten. Die LDA-Ergebnisse sind in Abbildung 2Bdargestellt. Darüber hinaus haben wir Cladogramme konstruiert, die die unterschiedliche Anreicherung verschiedener Gattungen und Arten zeigen, die zu den Bacteriodes- und Firmicutes-Phyla in den WT- und Modellgruppen gehören (Abbildung 2C). Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse eine Beeinträchtigung der kognitiven Fähigkeiten und eine mikrobielle Darmdysbiose bei den D-Galactose-induzierten alternden Modellmäusen.

Die CDPS-Behandlung verbessert die kognitiven Fähigkeiten in den D-Gal-induzierten Alterungsmodellmäusen

Wir analysierten, ob die CDPS-Behandlung den kognitiven Rückgang bei D-Gal-induzierten alternden Modellmäusen lindert. Während der

2 Monate nach Verabreichung wurde das Körpergewicht jeden zweiten Tag gemessen. Die Körpergewichte der Modell- und CDPS-Gruppen von Mäusen waren ähnlich (Abbildung 3A). Verhaltensexperimente nach der letzten Dosis durchführen. Die Ergebnisse der neuartigen Objekterkennung und des Morris-Wasserlabyrinth-Tests zeigten, dass das Kurzzeitgedächtnis in den CDPS-Mäusegruppen im Vergleich zur Modellgruppe der Mäuse signifikant höher war; Das Langzeitgedächtnis in der CDPS-Gruppe von Mäusen war höher, aber statistisch unbedeutend im Vergleich zu der Modellgruppe von Mäusen (Abbildung 3B, 3C). Dies legte nahe, dass die CDPS-Behandlung den Verlust des Kurzzeit-Objekterkennungsgedächtnisses bei mit D-Gal behandelten Mäusen aufhob.

Das räumliche Lernen und Gedächtnis dieser Mäuse wurden durch den Morris-Wasserlabyrinth-Test bewertet, und die Ergebnisse zeigten, dass die Fluchtlatenzzeiten der CDPS-Mäusegruppe vergleichbar mit der WT-Mäusegruppe und signifikant kürzer als die der Mäuse der Mod-Gruppe waren (Abbildung 3D ). Darüber hinaus waren die Fluchtlatenzzeiten am sechsten Tag nach der CDPS-Verabreichung im Vergleich zur Modellgruppe signifikant niedriger (Abbildung 3E). Die Schwimmzeit innerhalb des Zielquadranten war in der CH- und CM-Gruppe im Vergleich zur Modellgruppe signifikant höher. Die CL-Gruppe ist höher als die Modellgruppe, aber keine statistische Signifikanz (Abbildung 3F). Darüber hinaus war die Anzahl der Bahnsteigübergänge in der CM- und CL-Gruppe im Vergleich zur Modellgruppe signifikant höher. Allerdings ist die CH-Gruppe höher als die Modellgruppe und keine statistische Signifikanz (Abbildung 3G). Diese Ergebnisse zeigten, dass die CDPS-Behandlung das räumliche Lernen und Gedächtnis bei den D-Gal-induzierten alternden Modellmäusen verbesserte.

Die Behandlung mit CDPS stellt die Homöostase der Zusammensetzung der Darmmikrobiota in den D-Galactose-alternden Modellmäusen wieder her

Monosaccharide und Polysaccharide sind die essentiellen Nährstoffe, die für das Wachstum von Bakterien erforderlich sind [18–21]. Es wird auch berichtet, dass CDPS die Zusammensetzung der Darmmikrobiota reguliert [22]. Daher analysierten wir, ob CDPS-Behandlungen die mikrobielle Darmdysbiose bei den Mäusen der Modellgruppe linderten, indem wir die 16S-rRNA-Sequenzierungsdaten von Kotproben aus den WT-, Modell- und CDPS-Mäusegruppen auswerteten.

Zunächst haben wir Alpha-Diversitätsindizes berechnet, um den gesamten Reichtum an fäkalen Mikrobiota und die strukturellen Unterschiede zwischen diesen Gruppen zu bewerten. Wir analysierten Alpha-Diversitäts-Indizes (-Diversity) wie beobachtete Arten, Shannon-, Chao 1-, ACE- und Simpson-Indexwerte, um Veränderungen in der Zusammensetzung verschiedener Bakterienarten in den Kotproben verschiedener Mäusegruppen zu bestimmen. Die Indizes für -Diversität (beobachtete Arten, Shannon-, Chao-1-, ACE- und Simpson-Indizes) waren in den WT- und CDPS-Mäusegruppen höher als in der Modellgruppe, aber statistische Signifikanz wurde nur für die Chao-1-Indexwerte zwischen den CM beobachtet Gruppe und Mod-Gruppe. Es zeigte sich, dass die Verabreichung mit CDPS den Mikrobiomreichtum erhöht (Abbildung 4A–4E). Als nächstes analysierten wir -Diversity-Indizes, um Unterschiede in den mikrobiellen Arten des Darms zwischen den WT-, Modell- und CDPS-Mäusegruppen zu identifizieren, wobei wir die nicht-metrische mehrdimensionale Skalierung (NMDS), die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) und die Hauptkomponentenanalyse ( PCA). PCA zeigte Variationen in der mikrobiellen Zusammensetzung des Darms der Mäuse der Modellgruppe während des Alterungsprozesses, einschließlich Dimensionsreduktion und Beibehaltung von Mustern und Trends (Abbildung 4F). Die Unterschiede in der fäkalen Mikrobiota zwischen den WT-, Modell- und CDPS-Gruppen wurden basierend auf PCoA der ungewichteten UniFrac-Abstände für die 16S-rRNA-Gene identifiziert (Abbildung 4G). Die Clustering-Analyse zeigte signifikante Unterschiede in NMDS zwischen der Modellgruppe und den WT- und CDPS-Gruppen (Abbildung 4H).

Wir haben die Top-10-Phyla der Darmmikrobiota ausgewertet und festgestellt, dass die Häufigkeit der Bacteroides-Phyla in der CH-, CM- und CL-Gruppe im Vergleich zur Modellgruppe signifikant höher war (Abbildung 4I). Dies legte nahe, dass CDPS die Homöostase der Darmmikrobiota in mit D-Gal behandelten Mäusen wiederherstellte. Die Cladogramme zeigten eine unterschiedliche Anreicherung verschiedener Gattungen und Arten, die zu den Stämmen Bacteriodes und Firmicutes in den WT-, Modell- und CDPS-Gruppen gehören (Abbildung 4J). Wie in den Heatmaps gezeigt, reduzierten CDPS-Behandlungen die relative Häufigkeit von Thermoplasmata, Bacilli, nicht identifizierten Actinobacteria, Fusobacteriia und nicht identifizierten Elusimikrobien und erhöhten die relative Häufigkeit von Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, nicht identifizierten_ Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae , Erysipelotrichia und nicht identifizierte_Cyanobakterien im Vergleich zur Modellgruppe (Abbildung 4K). Diese Ergebnisse zeigten, dass die CDPS-Behandlung die Homöostase der Darmmikrobiota in den D-Gal-induzierten alternden Modellmäusen signifikant wiederherstellte.

Die CDPS-Behandlung lindert die Neurodegeneration in den D-Gal-induzierten alternden Modellmäusen durch Verringerung des oxidativen Stresses

Als nächstes analysierten wir die Auswirkungen von CDPS auf Entzündungen, indem wir die Serumspiegel von entzündungsfördernden Zytokinen (IL-2 und TNF-) und entzündungshemmenden Zytokinen (IL-4 und IL-10) analysierten. ) in verschiedenen Gruppen von Mäusen. Die Serumspiegel von IL-2 und TNF- waren signifikant niedriger und die Serumspiegel von IL-4 und IL-10 waren signifikant höher in der CH-, CM- und CL-Gruppe im Vergleich zum Modell Gruppe. Es wird gezeigt, dass CDPS entzündungshemmende Wirkungen hat (Abbildung 5A–5D).

Oxidativer Stress wird durch die erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verursacht und ist einer der Hauptfaktoren, die das Altern fördern [23]. Daher analysierten wir die Auswirkungen von CDPS auf oxidativen Stress im D-Gal-induzierten Alterungs-Mausmodell, indem wir die Serumspiegel des antioxidativen Enzyms SOD und des Lipidperoxidationsprodukts Malondialdehyd (MDA) bewerteten. Die Serumspiegel von MDA waren signifikant höher und die Serumspiegel von SOD waren in der Mod-Gruppe im Vergleich zur WT-Gruppe signifikant reduziert, aber die CDPS-Behandlung kehrte diese Wirkungen um ( 5E , 5F ). Diese Ergebnisse zeigten, dass der oxidative Stress bei den D-Gal-induzierten Alterungsmodellmäusen erhöht war, aber durch die CDPS-Behandlung reduziert wurde.

Darüber hinaus bewerteten wir die oxidativen Stressniveaus im Gehirngewebe, indem wir die Niveaus des fortgeschrittenen oxidierten Proteinprodukts (AOPP), der direkten Lipidperoxidation (LPO) und MDA sowie die Aktivitäten antioxidativer Enzyme wie Glutathionperoxidase (GSH-Px ) und Superoxiddismutase (SOD) in den Hirngewebehomogenaten. Die Gehirne der Mäuse der Mod-Gruppe zeigten im Vergleich zur WT-Gruppe signifikant reduzierte Aktivitäten von SOD und GSH-PX und signifikant erhöhte Werte von AOPP, LPO und MDA, aber diese Effekte waren in der CH-, CM- und CL-Gruppe umgekehrt (Abbildung 6A– 6E).

Darüber hinaus führten wir eine histologische Färbung des Gehirnschnitts mit H&E- und Nissl-Färbungen durch, um die Schutzwirkung von CDPS auf die Gehirne von D-Gal-induzierten alternden Modellmäusen zu beurteilen. Die Mäuse der Mod-Gruppe zeigten im Vergleich zur WT-Gruppe eine signifikante Verringerung der Anzahl und des Volumens der Neuronen, eine vergrößerte Lücke zwischen den Neuronen, eine unregelmäßige Anordnung der Neuronen und eine Kernpyknose in der Hippocampus-CA1-Region, aber diese pathologischen Veränderungen wurden durch CDPS-Behandlungen signifikant reduziert ( Abbildung 6F). Diese Ergebnisse zeigten, dass CDPS-Behandlungen den oxidativen Stress und die Hirnpathologie bei den D-Gal-induzierten Alterungsmodellmäusen signifikant reduzierten.

Die CDPS-Behandlung reduziert periphere Entzündungen und oxidativen Stress, indem sie die mikrobielle Homöostase im Darm in D-Gal-induzierten Modellmäusen aufrechterhält

Als nächstes analysierten wir, ob die Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota mit einer erhöhten peripheren Entzündung und oxidativem Stress während des Alterns einhergingen. Zu diesem Zweck verwendeten wir einen Dreifach-Antibiotika-Cocktail (ABX-Gruppe) oder Cyclophosphamid (Cy-Gruppe; siehe auch Materialien und Methoden), um die Darmmikrobiota abzutragen oder eine Immunsuppression bei den mit CDPS behandelten alternden Modellmäusen zu induzieren. Die antibiotische Behandlung hob die vorteilhaften Wirkungen der CDPS-Behandlung bei den alternden Modellmäusen auf. Wir beobachteten Lern- und Gedächtnisstörungen (Abbildung 7A) und Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota (Abbildung 7B, 7C) bei den Mäusen der ABX-Gruppe im Vergleich zur mit CDPS behandelten Gruppe. Die obigen Ergebnisse weisen darauf hin, dass selbst die Gabe von CDPS die Lern- und Gedächtnisfähigkeit von Mäusen nach Veränderung der Darmflora nicht steigern kann. Darüber hinaus beobachteten wir erhöhte Spiegel entzündungsfördernder Zytokine im Gehirn und im Serum von Mäusen der ABX-Gruppe im Vergleich zur CDPS-Gruppe (Abbildung 7D–7N). Die Ergebnisse der ABX-Gruppe und der CY-Gruppe zeigten, dass nach der Zerstörung der Darmflora und der Immunfunktion selbst die Verabreichung von CDPS die Lern- und Gedächtnisfähigkeit von Mäusen nicht verbessern konnte. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die CDPS-Behandlung periphere Entzündungen, oxidativen Stress und kognitiven Rückgang bei den D-Gal-induzierten alternden Modellmäusen verringerte, indem Darmdysbiose verhindert wurde.

Wir verwendeten dann das immunsuppressive Medikament Cyclophosphamid [24], um die Rolle der Entzündung bei den positiven Wirkungen von CDPS zu bestimmen. Mit Cyclophosphamid behandelte CDPS-Mäuse (Cy-Gruppe) zeigten im Vergleich zu Wildtyp- und CDPS-Gruppen-Mäusen eine beeinträchtigte Lern- und Gedächtnisfähigkeit, Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und abweichende Spiegel von pro- und entzündungshemmenden Zytokinen im Gehirn und Serum. Ein Vergleich mit Modell und ABX-Gruppe ist jedoch nicht aussagekräftig. (Abbildung 7A–7N). Diese Daten zeigen, dass Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota die periphere Entzündung in den D-Gal-induzierten alternden Modellmäusen verstärken.

CDPS beugt D-gal-induzierter Alterung vor, indem es den Aminosäurestoffwechsel reguliert

Das Immunsystem des Wirts wird durch Metaboliten beeinflusst, die von der Darmmikrobiota erzeugt werden [25]. Die fäkalen Metaboliten stellen eine funktionelle Anzeige des Darmmikrobenstoffwechsels und der Darmmikrobenzusammensetzung dar [26]. Darüber hinaus gelangen Metaboliten der Darmmikrobiota in den Blutkreislauf und beeinflussen den Stoffwechsel und die Gesundheit des Wirts [26, 27]. Insgesamt 1058 Metaboliten wurden in Serumproben von fWT-, Mod- und CDPS-Mäusen identifiziert. Dann analysierten wir diese Metaboliten mit BioCyc, der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) und der Human Metabolome Database (HMDB) und stellten fest, dass 65 Metaboliten in der Mod-Gruppe im Vergleich zur WT-Gruppe unterschiedlich exprimiert wurden. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass sich die Spiegel von 8 Metaboliten (Kreatinin, Valin, L-(-)-Methionin, o-Toluidin, N-Ethylanilin, Harnsäure, Prolin und Phenylalanin) zwischen den WT-, Mod- und CDPS-Gruppen signifikant unterschieden . Pathway-Enrichment-Analyse dieser 8 Metaboliten mit MetaboAnalyst [28, 29] zeigte, dass diese Metaboliten mit dem Arginin-, Histidin-, Arginin-, Prolin- und Purinstoffwechsel verwandt waren (Abbildung 8A, 8B). 7 verschiedene Metaboliten der MOD-Gruppe und der CDPS-Gruppe in der WT-Gruppe.

Anschließend analysierten wir, ob Veränderungen im Aminosäurestoffwechsel mit Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota zusammenhängen. Wir beobachteten, dass 7 verschiedene Metaboliten der WT-, Mod- und CDPS-Gruppen (Kreatinin, Valin, L-(-)-Methionin, o-Toluidin, N-Ethylanilin, Harnsäure und Prolin) im ABX-, Cy-, und Mod-Gruppen im Vergleich zu den WT- und CDPS-Gruppen. Darüber hinaus gibt es keine Signifikanz zwischen ABX- und Cy-Gruppen (Abbildung 8C). Um schließlich zu untersuchen, gibt es eine Korrelation zwischen unterschiedlichem Stoffwechsel und anderen altersbedingten Krankheiten. Wir analysierten die Korrelation zwischen diesen sieben unterschiedlich exprimierten Metaboliten und menschlichen Krankheiten unter Verwendung der MetaboAnalyst-Datenbank und stellten fest, dass diese Metaboliten mit der Alzheimer-Krankheit assoziiert waren (p=0.00173; Abbildung 8D, 8E). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass CDPS vor D-gal-induzierter Alterung schützt, indem es den Aminosäurestoffwechsel reguliert.

DISKUSSION

Ein fortschreitender Rückgang der kognitiven Funktion ist ein charakteristisches Merkmal des Alterns. Frühere Studien zeigten, dass die CDPS-Behandlung das Lernen und Gedächtnis bei den alternden Modellmäusen signifikant verbesserte [30–33]. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die CDPS-Behandlung die kognitive Funktion verbessert, indem sie periphere Entzündungen und oxidativen Stress durch die Wiederherstellung der mikrobiellen Homöostase im Darm in den D-Gal-induzierten Alterungsmodellmäusen hemmt (Abbildung 9). Sprague-Dawley-Ratten, die mit Cistanche-Polysacchariden gefüttert wurden, zeigten ein erhöhtes Wachstum nützlicher Darmbakterien und eine verbesserte mikrobielle Diversität im Darm [34]. CDA-0.05, ein neutrales Cistanche-Polysaccharid, verbesserte das Wachstum von probiotischen Laktobazillen [22]. Diese Daten legten nahe, dass Cistanche-Polysaccharide die Homöostase von Darmbakterien verbesserten.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass CDPS entzündungshemmende Wirkungen hat und die kognitiven Fähigkeiten der alternden Modellmäuse verbessert, indem es die Häufigkeit von Darmbakteriengattungen wie Bacteroidetes, Firmicutes und Proteobacteria moduliert. Daher können CDPs für altersbedingte Krankheiten therapeutisch vorteilhaft sein, indem sie die Zusammensetzung der Darmmikrobiota verändern [35, 36]. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass die Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen im Serum und Dickdarm mit der relativen Häufigkeit von Bakteriengattungen wie Bacteroidetes, Firmicutes und Proteobacteria assoziiert sind [37, 38]. Darüber hinaus reguliert die Zusammensetzung der Darmmikroben die Gehirnfunktion, indem sie die zirkulierenden Spiegel mehrerer Zytokine moduliert [39–43]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die CDPS-Behandlung die relative Häufigkeit von Thermoplasmata, Bazillen, nicht identifizierten Actinobacteria, Fusobacteriia und nicht identifizierten Elusimikrobien verringerte und die relative Häufigkeit von Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, nicht identifizierten _ Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae, Erysipelotrichia und nicht identifizierte_Cyanobakterien.

Darmmikrobielle Metaboliten werden in den Blutkreislauf freigesetzt und regulieren die Gesundheit und den Stoffwechsel des Wirts [26, 27]. Die Darmmikroben-Metaboliten können abgeschätzt werden, indem die Zusammensetzung der fäkalen Metaboliten bewertet wird, die sich mit Änderungen in der Zusammensetzung der Darmmikroben ändert [44]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Plasmaspiegel von Citrullin, Prolin, Arginin, Asparagin, Phenylalanin und Threonin mit neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, assoziiert sind [45, 46]. Unsere Studie zeigte, dass die Serumspiegel von Kreatinin, Valin, L-Methionin, o-Toluidin, N-Ethylanilin, Harnsäure und Prolin mit D-gal-induzierter Alterung bei Mäusen assoziiert waren.

Die angeborenen und adaptiven Arme des Immunsystems spielen eine bedeutende Rolle bei der Aufrechterhaltung der wirtsmikrobiellen Homöostase in der luminalen Darmoberfläche [47]. Die Darmmikrobiota spielt auch eine bedeutende Rolle bei der Regulierung des Zentralnervensystems (ZNS) und der Immunität, indem sie Zytokine und Metaboliten in den Blutkreislauf freisetzt [48, 49]. Die entzündungsfördernden Zytokine spielen eine Schlüsselrolle bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen [50–52]. Beispielsweise sind altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Glaukom mit einer extrazellulären Akkumulation von Amyloid (A) und einer intrazellulären Ablagerung von hyperphosphoryliertem Tau (p-Tau) und Eisen in den retinalen Ganglienzellen (RGC) verbunden [44]. Darüber hinaus spielt die Entzündung eine bedeutende Rolle in der Pathogenese des Glaukoms [53]. Sehbehinderung ist ein frühes Symptom der Alzheimer-Krankheit (AD) und manifestiert sich vor dem Einsetzen des kognitiven Verfalls [54]. Unsere Studie zeigte, dass CDPS vor kognitivem Verfall und peripheren Entzündungen schützt, indem es die Homöostase der Darmmikrobiota aufrechterhält.

Es gibt mehrere Einschränkungen für diese Studie. Erstens ist die Beziehung zwischen dem Aminosäurestoffwechsel und der Zusammensetzung der Darmmikrobiota nicht gut bekannt. Zweitens ist die Zusammensetzung und Molekularstruktur von CDPS nicht bekannt. Daher sind zukünftige Studien erforderlich, um die regulatorische Rolle von CDPS bei der Linderung von AD durch die Signalachse Darmmikrobiota-Gehirn weiter zu untersuchen.

Zusammenfassend zeigte unsere Studie, dass CDPS die kognitiven Fähigkeiten von D-Gal-induzierten alternden Modellmäusen verbesserte, indem es die Homöostase der Darmmikrobiota wiederherstellte, wodurch ein Aminosäureungleichgewicht, periphere Entzündungen und oxidativer Stress wiederhergestellt wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CDPS ein potenzielles Therapeutikum für Patienten mit Lern- und Gedächtnisstörungen ist, insbesondere für solche, die mit Darmdysbiose einhergehen.

MATERIALEN UND METHODEN

Herstellung von CDPS

Ungefähr 1,0 kg gereinigter Cistanche deserticola wurde im Ofen bei 40 °C luftgetrocknet und zu Rohpulver pulverisiert. Das Pulver wurde 3 h in heißem Ethanol extrahiert. Der Rückstand wurde durch Gaze filtriert, um das Filtrat zu entfernen, und dann mit Wasser (8x) verdünnt und nacheinander 2 h, 1,5 h und 1 h bei 90°C unter Rückfluss erhitzt. Zu jedem Zeitpunkt wurde die Lösung zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen und mit dem braunroten Filtrat vereinigt. Dann wurde das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt, auf Raumtemperatur abgekühlt, langsam zu 95 % Ethanol (3×) gegeben und 24 h bei 4°C stehengelassen. Dann wurde die Lösung bei 6000 U/min für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Der Niederschlag wurde nach dreimaliger Wiederholung der Wasserextraktion und Alkoholfällung gesammelt. Der Niederschlag wurde in Wasser rekonstituiert, von Proteinen befreit, dialysiert und gefriergetrocknet, um rohes Cistanche-Deserticola-Polysaccharid (CDPs) zu erhalten. Der Polysaccharidgehalt betrug mehr als 90 Prozent, wie durch UV-Spektrophotometrie bestimmt wurde.

Tiergruppierung und Behandlungen

Acht Wochen alte männliche Kunming-Mäuse (SCXK-Lizenz-Nr. 2019-0010) wurden von SPF Biotechnology Co. Ltd (Peking, China) gekauft, in einem licht- und temperaturkontrollierten Raum untergebracht und mit Futter und Wasser gefüttert. Alle Tierversuche wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Inner Mongolia Medical University genehmigt wurden. Die Experimente wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt.

Nach 1 Woche Anpassung an die neue Umgebung wurden 120 Mäuse in die folgenden 7 Gruppen eingeteilt: (1) Wildtyp-Kontrolle (WT); Modellgruppe (150 mg/kg/Tag D-gal; Mod); (3) CH: D-gal plus 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal plus 25 mg/kg CDPS; (6) ABX-Gruppe: Antibiotika plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (7) Cy-Gruppe: Cyclophosphamid plus D-Gal plus 50 mg/kg CDPS.

Die Mäuse aus den Modell-, ABX-, Cy- und CDPS-Gruppen erhielten subkutane Injektionen mit gelöster Kochsalzlösung

150 mg/kg D-gal täglich für 2 Monate. Der WT-Gruppe wurde 2 Monate lang ein gleiches Volumen Kochsalzlösung subkutan injiziert. Den Mäusen der CDPS-Gruppe wurden auch täglich intragastrische Injektionen mit 1{{10}}0 mg/kg, 50 mg/kg oder 25 mg/kg CDPS für 2 Monate verabreicht . Die Mäuse der ABX-Gruppe erhielten 2 Monate lang Trinkwasser mit 0,1 mg/ml Ampicillin und 0,5 mg/ml Streptomycin zusätzlich zu D-Gal- und CDPS-Injektionen. Vor der Verabreichung von D-Gal erhielten die Mäuse in der ABX-Gruppe 7 Tage lang Injektionen mit 0,1 mg/ml Ampicillin, 0,5 mg/ml Streptomycin und 0,1 mg/ml Colistin. Die Mäuse der Cy-Gruppe erhielten 2 Monate lang jeden zweiten Tag (qod) intraperitoneale Injektionen von 20 mg/kg Cyclophosphamid zusätzlich zu den täglichen Injektionen von D-Gal und CDPS.

Neuartiger Objekterkennungstest

Verhaltensexperimente nach der letzten Dosis durchführen. Der Objekterkennungstest umfasste Einarbeitungs-, Schulungs- und Testphasen. Während der Gewöhnungsphase wurden die Mäuse zwei Tage lang für 10 Minuten an eine leere Testkammer gewöhnt. Am dritten Tag (Trainingstag) wurden dann zwei Objekte gleicher Größe, Form und Farbe (A1 und A2) an gegenüberliegenden Enden der Kammer platziert. Jeder Maus wurden dann 10 Minuten gegeben, um die zwei ähnlichen Objekte zu erkunden. Nach 1- Stunden (am dritten Tag) und 24- Stunden (am vierten Tag) Trainings-zu-Test-Intervallen wurde eines der ähnlichen Objekte (A1 oder A2) durch ein B oder C ersetzt Gegenstand, der sich am Prüfungstag in Größe, Farbe und Form unterscheidet. Während der Testphase wurde jede Maus 5 Minuten lang getestet und der Präferenzindex wurde berechnet, um die Erinnerung an die Erkennung neuartiger Objekte (B oder C) mithilfe der folgenden Formel zu bestimmen: Präferenzindex=Zeit auf Objekt B oder C/( Zeit für Objekt B oder C plus Zeit für Objekt A) × 100 Prozent .

Morris-Wasserlabyrinth-Test

Der Morris-Wasserlabyrinth-Test wurde in einem runden Becken mit einer Tiefe von 45 cm und einem Durchmesser von 90 cm durchgeführt. Das von Ruediger S, et al. (2011) [55] und Wood RA, et al. (2018) [56] wurde hier eingesetzt. Die Wassertiefe im Becken betrug 30 cm und die Wassertemperatur 20 ± 1 Grad C. Die Plattform hatte einen Durchmesser von 6 cm und stand 1 cm unter Wasser. Die Trainings- und Testzeit betrug jeweils 60 s. Für das Training führten wir an fünf aufeinanderfolgenden Tagen jeden Tag vier Versuche von jeweils 60 Sekunden mit einer versteckten Plattform durch. Wenn die Plattform nicht innerhalb von 60 s von den Mäusen entdeckt wurde, wurden sie zur Plattform geführt und für 5 s auf die Plattform gesetzt. Während der Testphase wurden die Latenzzeit zum Erreichen der versteckten Plattform in Trainings- und Probeversuchssitzungen, die Anzahl der Überquerungen des entfernten Plattformstandorts und die im Ziel-(Plattform-)Quadranten verbrachte Zeit aufgezeichnet und analysiert

ELISA-Assays

Die Serumspiegel entzündungsfördernder Zytokine wie IL-2(), IL-4, IL-10 und TNF- wurden für jede Gruppe von Mäusen unter Verwendung von ELISA-Kits analysiert, die von Shanghai Yi bezogen wurden Li Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Aktivität eines antioxidativen Enzyms, Superoxiddismutase (SOD), und die Konzentrationen des Lipidperoxidationsprodukts Malondialdehyd (MDA) im Serum jeder Gruppe von Mäusen wurden mit Assay-Kits analysiert, die vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) erworben wurden. . Die Gehalte an fortgeschrittenen Oxidationsproteinprodukten (AOPP) in den murinen Hippocampus-Proben wurden unter Verwendung des ELISA-Kits von Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers abgeschätzt.

Schätzung von oxidativem Stress im Gehirn von Mäusen

Wir homogenisierten 100 mg Hippocampus-Gewebe mit 0,9 ml eisgekühlter Kochsalzlösung und das Homogenat wurde bei 12000 U/min für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Proteingehalt im Überstand wurde mit dem BCA Protein Assay Kit ( Beyotime Biotechnology, Schanghai, China). Die Werte der Lipidperoxidation (LPO) und Malondialdehyd (MDA) und die Aktivitäten von GSH-Px und SOD in den Hippocampus-Proben wurden durch Kolorimetrie unter Verwendung von Kits des Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

Zusammensetzung der Darmmikrobiota

Kotproben wurden von allen Mäusen gesammelt und sofort bei -80 Grad C gelagert. Die V3-plus-V4-Region des 16S-rRNA-Gens wurde mit Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Peking, China) sequenziert und mit analysiert Offene QIIME-Plattform zur Bestimmung der Darmmikrobiota-Profile.

LC/MS-Analyse von Serummetaboliten

Serumproben wurden für 10 Minuten mit vorgekühltem Methanol im Verhältnis 1:3 inkubiert, um die Proteine ​​auszufällen. Die Proben wurden bei 12000 U/min für 15 Minuten bei 4 Grad C zentrifugiert. Die Überstände wurden mit Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography und QExactive Massenspektrum analysiert. Die chromatographischen Bedingungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Analyten wurden in einer XBridge BEH-Amid-Chromatographiesäule (2,1 × 100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA) unter Verwendung von 0,1 Prozent Ameisensäure und Acetonitril als mobile Phasen A und B getrennt, beziehungsweise. Die Flussrate wurde auf 0,4 ml/min eingestellt, das Injektionsvolumen betrug 5 &mgr;l und die Säulentemperatur wurde auf 25°C eingestellt (Tabelle 1). Die Massenspektrumsignale wurden unter Verwendung der positiven und negativen Ionenabtastmodi erhalten. Die Ionensprühspannung und andere spezifische MS-Parameter sind in Tabelle 2 aufgeführt.

statistische Analyse

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 und p< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">

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