Cistanche Deserticola Polysaccharide haben eine neuroprotektive Wirkung

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Yue Liuet al

Abstrakt:

Der ischämische Schlaganfall ist eine Erkrankung mit hoher Morbidität und Mortalität.CistancheDeserticolaPolysaccharide(CDP) besitzen ein breites Spektrum an vorteilhaften Wirkungen, einschließlich Leberschutz und Immunhomöostase. Soweit wir wissen, ist die Schutzwirkung von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)an Neuronen, die durch Sauerstoff-Glucose-Entzug/Reperfusion (OGD/RP) geschädigt wurden, wurde nicht untersucht. In dieser Studie verletzte OGD/RP ein PC12-Zellmodell. Kurz CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)({{0}},05, 0,5 und 5 ug/ml) wurde vor der Reperfusion verabreicht. Die Schutzwirkung von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)wurde dann auf der Grundlage von Zelllebensfähigkeit, Laktatdehydrogenase (LDH)-Leckage, [Ca2 plus ] I, mitochondrialem Membranpotential (MMP) und Zellapoptose bewertet, und der Redoxstatus nach Reperfusion wurde bewertet, indem reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Katalase ( CAT), Glutathionperoxidase (GSH-Px) und die gesamte antioxidative Kapazität. Basierend auf der Tatsache, dass das mit der Parkinson-Krankheit assoziierte Protein DJ-1 an der endogenen Antioxidation beteiligt ist und wirktneuroprotektivWirkungen nach Ischämieschlag untersuchten wir die Wechselwirkung zwischen CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)und DJ{{0}}. DJ-1-Expression wurde durch ELISA und Western-Blot-Analyse nachgewiesen, und die Translokation von DJ-1 wurde durch Immunfluoreszenz bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass CDP (0.05, 0,5 und 5 ug/ml) den PC12-Zelltod abschwächte, MMP und Kalziumhomöostase bewahrte; gehemmter oxidativer Stress und verringerte Zellapoptose. Darüber hinaus stimulierte CDP (5 ug/ml) deutlich die DJ-1-Sekretion und -Expression. Insgesamt deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)übt einneuroprotektivWirkung gegen OGD/RP-induzierte Verletzungen durch Hemmung von oxidativem Stress und Regulierung des DJ-1-Signalwegs

Schlüsselwörter:Cistanche deserticola, Polysaccharide, neuroprotektiv, Sauerstoff-Glukose-Entzug/Reperfusion, oxidativer StressDJ-1

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1. Einleitung

Der ischämische Schlaganfall ist weltweit die zweithäufigste Todesursache und die Hauptursache für langfristige Behinderungen [1]. Es wird erwartet, dass die Zahl der Todesfälle durch Schlaganfall bis 2030 auf 7,8 Millionen steigen wird [2]. In China sterben jedes Jahr 58 bis 142 von 100 Menschen000 an einem Schlaganfall. Daher müssen wirksame Strategien entwickelt werden, die eine Ischämie-Reperfusions-Schädigung umkehren. Umfangreiche Beweise belegen, dass oxidativer Stress ein Hauptfaktor ist, der die Entwicklung und das Fortschreiten eines Hirninfarkts während der Reperfusion fördert[3,4]. Daher Entdeckung effektivneuroprotektivWirkstoffe, die in der Lage sind, ROS zu reduzieren und oxidativen Stress zu unterdrücken, haben in der Forschung beträchtliches Interesse geweckt. Das mit der Parkinson-Krankheit assoziierte Protein DJ-1 vermittelt Neuroprotektion, indem es die anti-apoptotische und antioxidative Genexpression stimuliert [4,5]. DJ-1 kann durch oxidativen Stress und Mitogenstimulation in die Mitochondrien transloziert und unter pathologischen Bedingungen wie Brustkrebs, Melanom und OGD/RP-Verletzung in die extrazelluläre Matrix sezerniert werden [6]. Darüber hinaus ist DJ-1 aufgrund seiner kritischen Rolle bei der Antioxidation nützlich beim therapeutischen Targeting bei ischämischer Neurodegeneration [4,7]. In den letzten 10 Jahren haben mehrere Gruppen bestätigt, dass DJ-1 dies getan hatneuroprotektivAuswirkungen auf in-vivo-Modelle für fokale zerebrale Ischämie und in-vitro-OGD/RP-Modelle [6–9]. In der Zwischenzeit heben einige Medikamente, einschließlich Cyclosporin A und Natriumphenylbutyrat, den neuronalen Zelltod durch DJ-1-Hochregulierung bei Ischämie-Schlaganfall auf [9,10 ].

CistancheDeserticola, die integrale getrocknete Pflanze vonCistancheDeserticolaYCMa und Cistanche tubulosa Wight, wird hauptsächlich in den Wüstengebieten Nord- und Nordwestchinas produziert [11]. C. deserticola ist essbar und wurde als „Ginseng der Wüsten“ verehrt. In Akupunkturpunktverordnung wird es zur Behandlung von chronischer Nierenerkrankung, sexueller Impotenz, weiblicher Unfruchtbarkeit, Fluor, Metrorrhagie und seniler Verstopfung verwendet [12].C. Deserticola-Polysaccharide, ein Hauptwirkstoff, der aus isoliert wirdCistanche Deserticola. CDP, modulieren die Immunfunktion und das Lipidgleichgewicht und bieten Schutz vor Alterung, Oxidation und Leberschäden. Darüber hinaus ist CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)verhindert Ischämie-Reperfusionsschäden im Herzen und in der Leber [13,14]. Jüngste Studien berichteten, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)sind ungiftig[12,15,16], und andere Phytochemikalien, die aus C. Deserticola extrahiert werden, einschließlich Echinacosid, Isoacteosid, Acteosid und Salidrosid, weisen aufneuroprotektivEffekte [11,12]. Jedoch wurde bisher nicht über die potentielle Verwendung von CDP zur Linderung von ischämischen Schlaganfallschäden berichtet.

In der vorliegenden Studie nehmen wir an, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)hemmt oxidativen Stress für die Neuroprotektion. Die potenziellen Schutzwirkungen von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Inischämie-Schlaganfall-Schäden wurden unter Verwendung von OGD/RP-geschädigten PC12-Zellen untersucht. Anschließend wurden zugrunde liegende Interaktionen im Zusammenhang mit DJ-1 untersucht.

2. Methoden

2.1. Zellkultur und OGD/RP-Modell

PC12-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10 Prozent FBS bei 37 Grad in einem normoxischen Inkubator mit 5 Prozent CO2 kultiviert. Das Medium wurde alle 48 h ausgetauscht. OGD/RP-Modell wurde erstellt. Die PC12-Zellen wurden gewaschen und Earle's ausgewogener Salzlösung ausgesetzt. Dann wurden die Zellen in eine anaerobe Kammer mit 5 Prozent CO2 und 95 Prozent N2 bei 37 Grad für 4 Stunden überführt und dann einer Reoxygenierung unterzogen. Während dieses Schritts wurde das gleiche Volumen an Kulturmedium zu den Zellen gegeben. Nach der Reoxygenierung wurden die Zellen für 24 h in einen normoxischen Inkubator gegeben.

2.2. Medikamentengabe

CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)wurde von Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, China (C23J7Y18405, > 98 Prozent Reinheit) bezogen. Nimodipin, ein präventives Medikament der ersten Wahl bei Ischämie-Schlaganfall, wurde als positive Kontrollverbindung verwendet [17–19]. Die Nimodipin-Injektion stammte von der Bayer Company. Die Zellen wurden zufällig in sechs Gruppen eingeteilt, nämlich die Kontrolle, Vehikel (OGD/RP), Nimo (5 ug/ml), CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)(0,05 ug/ml), CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)(0,5 ug/ml) und CDP (5 ug/ml). Nimodipin und CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)wurden vor der Reperfusion zugegeben. Die Kontrollgruppe wurde in einem normalen Medium kultiviert und unter normoxischen Bedingungen inkubiert.

2.3. Zelllebensfähigkeit: MTT- und NRU-Assays

PC12-Zellen (6 × 103 pro Well) wurden in eine 96--Well-Kulturplatte ausgesät. Die Zellen wurden gemäß den Anforderungen jeder Gruppe behandelt. Den Zellen wurde MTT (Solarbio, China) in einer Konzentration von 5 mg/ml zugesetzt und 4 h bei 37 Grad inkubiert. Formazan ist das Reduktionsprodukt der Succinat-Dehydrogenase in lebenden Zellen [20]. Zur Auflösung des gebildeten blauen Formazan wurde DMSO zugegeben. Die Absorption bei einer Wellenlänge von 490 nm wurde mit einem Microplate Reader (Thermo, USA) nachgewiesen, nachdem die Zellen 10 Minuten lang bei 25 Grad geschüttelt wurden. Die Ergebnisse der Zelllebensfähigkeit wurden als Prozentsatz der Kontrollgruppe manifestiert [21].

Der Neutralrot-Aufnahmetest (NRU) wurde gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll durchgeführt [22]. Als die Reperfusionsperioden abgeschlossen waren, wurde den Zellen Neutralrot (Solarbio, China) in einer Konzentration von 5 0 ug/ml zugesetzt. Die Mischung wurde für 3 h inkubiert. Dann wurden die Zellen schnell mit einer Lösung abgewaschen, die 0,5 % Formaldehyd und 1 % Calciumchlorid enthielt. Die Zellen wurden anschließend zu einer Mischung gegeben, die 1 Prozent Ethylsäure und 50 Prozent wasserfreies Ethanol enthielt. Die Platten wurden bei einer Extinktion von 540 nm abgelesen, nachdem die Zellen 20 Minuten lang bei 37 Grad geschüttelt worden waren. Die Ergebnisse der Zelllebensfähigkeit zeigten sich als Prozentsatz der Kontrollgruppe.

Cistanche deserticola-Polysaccharidehaben eineNeuroprotektive Wirkung

2.4. Beurteilung der Zytotoxizität

LDH ist ein zytoplasmatisches Enzym, das die Oxidation von Lactat-Topyruvat katalysiert. LDH wird schnell in die extrazelluläre Flüssigkeit freigesetzt, wenn die Zellmembran beschädigt ist. Daher wird der LDH-Nachweis normalerweise zur Bewertung der Zytotoxizität durchgeführt. [23]. Das experimentelle Verfahren folgte den kommerziellen Kit-Anweisungen, die vom LDH-Assay-Kit (Jiancheng, China) geliefert wurden. Die Extinktion jeder Probe wurde bei 440 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät nachgewiesen. Der Prozentsatz des Zelltods wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Lebensfähigkeit (Prozent)=(OD-Behandlung – OD-Behandlungsleerwert)/(OD Max. LDH-Aktivität – OD Max. LDH-Aktivitätsleerwert) × 100 Prozent.

2.5. Nachweis der intrazellulären Ca2 plus Konzentration

Die intrazelluläre Konzentration von Ca2 plus wurde mit Fluo-3/AM gemessen [15]. Die PC12-Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann mit 2 μM Fluo-3/AM (Beyotime, China) für 30 min bei 37 Grad im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden dann zum Entfernen von extrazellulärem Farbstoff dreimal mit PBS gewaschen. Die Fluoreszenzintensität des Fluo-3/AM wurde auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Olympus, Japan) bestimmt. Für die Berechnung der Grauwerte wurde das Softwarepaket Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer und ImageJ verwendet

2.6. Messung von MMP

JC-1 (5,5′,6,6′-Tetrachlor-1,1′,3,3′-Tetraethyl-imidacarbocyanin; Beyotime, China) ist eine bequeme spannungsempfindliche Sonde, die allgemein zum Färben verwendet wird Zellen und Auswertung von MMP [24]. Die PC12-Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und dann mit einer Mischung enthaltend 50 Prozent Medium und 50 Prozent Arbeitsflüssigkeit für 15 Minuten bei 37 Grad im Dunkeln inkubiert. Dann wurde die Mischung verworfen und durch frisches Medium ersetzt. Rote und grüne Fluoreszenzbilder wurden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie aufgenommen. Für die MMP-Messung wurde der relative Anteil roter und grüner Fluoreszenzsignale verwendet [25]. Für die Berechnung der Grauwerte wurde das Softwarepaket Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer und ImageJ verwendet.

2.7. Apoptose-Nachweisassay, Hoechest33342, und Durchflusszytometrie-Analyse

Hoechst33342, ein DNA-bindender Farbstoff, wurde zur Untersuchung der Zellapoptose verwendet [26]. Nach der Reperfusion wurden die PC12-Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit Hoechst33342 (Beyotime, China) in einer Konzentration von 5 ug/ml für 15 min bei 37 Grad im Dunkeln inkubiert. Dann wurden die Zellen unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop beobachtet. Die apoptotischen Zellen zeigten intensive blaue Fluoreszenz und Zellkernkondensation. Für jedes Färbeexperiment wurden drei zufällige Felder erfasst und quantifiziert. Für die Berechnung der Grauwerte wurden Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer und ImageJ verwendet. Die Prozentsätze der apoptotischen Zellen wurden durch die folgende Formel berechnet: apoptotische Menge/Gesamtmenge × 100 Prozent [27].

2.8. Messung der ROS-Erzeugung

Die fluoreszierende Sonde 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA; Jiangcheng, China) kann Zellmembranen durchdringen und zu nicht fluoreszierendem DCFH hydrolysiert werden. DCFH wird durch intrazelluläres ROS zu fluoreszierendem DCF oxidiert [29]. Nach der Reperfusion wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und dann mit DCFH-DA bei einer Endkonzentration von 10 &mgr;M für 45 min bei 37 Grad im Dunkeln inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenzspektrophotometer mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm beobachtet.

Cistanche deserticola-Polysaccharidehaben eineNeuroprotektive Wirkung

2.9. Bestimmung von oxidativen Stressindikatoren: CAT-, GSH-Px- und T-AOC-Spiegel

Die Zellen wurden abgekratzt und in PBS resuspendiert. Die erhaltenen Zellsuspensionen wurden 45 Mal auf Eis beschallt und bei 1000 U/min für 10 min bei 4 Grad zentrifugiert. Die Überstände wurden zurückbehalten und zum Nachweis verwendet [24]. Der Gesamtproteingehalt des Zellüberstands wurde mit einem BCA-Proteinassay-Reagenzienkit (KeyGEN, China) gemessen. Die Aktivitäten der CAT-, GSH-Px- und T-AOC-Spiegel wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Jiancheng, China) gemessen. Die Extinktion jeder Probe wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät nachgewiesen.

2.10. Messung der extrazellulären DJ-1-Konzentration

PC12-Zellen (6 × 103 pro Well) wurden in 96--Well-Kulturplatten ausgesät. Nach der Reperfusion wurde der Zellüberstand gesammelt und mit dem DJ-1/PARK-7 ELISA Kit (Raybio, USA) analysiert ) nach Herstellerangaben [9]. Die Extinktion jeder Probe wurde mit einem Microplate Reader bei einer dualen Wellenlänge von 450 nm oder 540 nm nachgewiesen.

2.11. Western-Blot-Analyse

Zelluläre Proteine ​​wurden mit eiskaltem Lysepuffer nach Herstellerangaben (KeyGEN, China) extrahiert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Proteinassay-Reagenzienkit bestimmt. Gleiche Mengen an Proteinlysaten (20 ug) von jeder Gruppe wurden in einer 12-prozentigen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde mit PBS, das 5 % Magermilch enthielt, für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit Anti-PARK7/DJ-1-Antikörpern (ab76008, Abcam; Verdünnung 1:1000) über Nacht bei 4 Grad sondiert. Dann wurde die Membran dreimal mit PBST gewaschen und mit sekundärem Antikörper-Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (SA00001-2, Proteintech Group; Verdünnung 1:5000) bei Raumtemperatur für 2 h inkubiert. Als Kontrolle diente der Antikörper Anti- -Tubulin(10759-1-AP, Proteintech Group; Verdünnung 1:1000). Proteinbanden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz(ECL)-Reaktionsreagenzien sichtbar gemacht. Die Bandendichten wurden mit der QuantityOne Analysis Software v.4.6.9 gemessen.

2.12. Immunzytochemische Analyse

Die PC12-Zellen wurden nach der Reperfusionsbehandlung in 4-prozentigem Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur fixiert [9]. Nachdem überschüssiges Paraformaldehyd entfernt worden war, wurden die Zellen in PBS, das 0,3 Prozent Triton X-100 enthielt, für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, bevor sie mit 5 Prozent normalem Ziegenserum für 1 h inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann mit Kaninchen-Maus-monoklonaler Anti-ATP-Synthase-Kette (MABS1304, EMD Millipore, Verdünnung 1:200) zur Färbung von Mitochondrien inkubiert und anschließend mit Anti-PARK7/DJ-1-Antikörper (Verdünnung 1: 100) für die Sondierung des Proteins DJ-1. Die Zellen wurden gewaschen und mit Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Alexa 488 (grün; A11034, Invitrogen; Verdünnung 1:1000) und Ziege-anti-Maus-IgG-Alexa 594 (rot; A11032; Invitrogen; Verdünnung 1:1000) für 90 inkubiert Mindest. Schließlich wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit einem DAPI enthaltenden Eindeckmedium auf Glasobjektträger aufgebracht. Immunfluoreszenzbilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops sichtbar gemacht.

Cistanche deserticola-Polysaccharidehaben eineNeuroprotektive Wirkung

2.13. Daten/statistische Analyse

Alle Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung gezeigt. Die Signifikanz wurde durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. p < 0,05="" wurde="" als="" statistische="" signifikanz="" betrachtet.="" die="" experimentellen="" daten="" wurden="" unter="" verwendung="" der="" statistischen="" software="" spss="" 17.0="">

3. Ergebnisse

3.1. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)hemmte OGD/RP-induzierten Zellschaden

Die OGD/RP ausgesetzten PC12-Zellen zeigten eine signifikante Abnahme der Anzahl. Die Zellform wurde verändert und die Zellmembran wurde gebrochen. Im MTT-Assay sind die Zelllebensfähigkeiten im CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Gruppen ({{0}},05, 0,5 und 5 ug/ml) waren 58,91 Prozent ± 5,40 Prozent, 61,13 Prozent ± 3,81 Prozent bzw. 68,57 Prozent ± 3,24 Prozent, p < 0,05="" (abb.="" 1a)="" ,="" und="" das="" mit="" fahrzeug="" hatte="" 51,68="" prozent="" ±="" 3,89="" prozent="" .="" diese="" werte="" zeigten="" an,="" dass="">(CistancheDeserticolaPolysaccharide)schützte die Zellen vor OGD/RP-Schädigung und vermindertem Zelltod. Darüber hinaus betrug die Lebensfähigkeit der Zellen in der Nimo-Gruppe 77,02 Prozent ± 5,22 Prozent, was fast gleich der in der 5 ug/ml CDP ist(CistancheDeserticolaPolysaccharide)behandelte Gruppe.

Im NRU-Assay sind die Zelllebensfähigkeiten im CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Gruppen ({{0}},05, 0,5 und 5 ug/ml) betrugen 52,03 Prozent ± 4,72 Prozent, 58,49 Prozent ± 2,50 Prozent bzw. 69,17 Prozent ± 3,91 Prozent (Abb. 1B) und so weiter mit Fahrzeug hatte 47,14 Prozent ± 2,88 Prozent. Die Werte zeigten die konzentrationsabhängige Schutzwirkung von CDP.

Im Gegensatz zu einem Vehikel (44,73 Prozent ± 3,30 Prozent) war die LDH-Freisetzung im CDP signifikant reduziert(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Gruppen. Im CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Gruppen ({{0}},05, 0,5 und 5 ug/ml) betrugen die LDH-Leckraten 32,41 Prozent ± 3,70 Prozent, 27,13 ± 2,79 Prozent bzw. 23,13 Prozent ± 4,59 Prozent, p < 0,01="" (abb="" 1c).="" darüber="" hinaus="" betrugen="" die="" ldh-austrittsraten="" in="" der="" nimo-gruppe="" 21,99="" prozent="" ±="" 4,02="" prozent,="" was="" fast="" gleich="" der="" in="" der="" mit="" 5="" ug/ml="" cdp="" behandelten="" gruppe="">

3.2. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)abgeschwächter OGD/RP-induzierter Anstieg von [Ca2 plus ]i

Die intrazellulären Ca2+-Spiegel in den PC12-Zellen waren im Gegensatz zur Kontrollgruppe (373,62 ± 75,69) nach der OGD/RP-Verletzung auf 4146,60 ± 195,97 erhöht. Die CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Gruppen ({{0}},05, 0,5 und 5 ug/ml) konnten den intrazellulären Ca2+-Spiegel dosisabhängig auf 2921,25 ± 222,19, 2015,85 ± 230,53 bzw. 1768,43 ± 426,12 senken (Abb. 2A und C ). Darüber hinaus sank der Ca2+-Spiegel in der mit 5 ug/ml CDP behandelten Gruppe auf einen Spiegel, der mit dem in der Nimo-Gruppe vergleichbar war (1591,19 ± 213,21).

3.3. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)abgeschwächte OGD/RP-induzierte Dissipation von MMP

Verglichen mit der Kontrollgruppe (1,67 ± 0,89) zeigte die Vehikelgruppe (0,48 ± 0,10) mehr grüne FL-Fluoreszenz als rote FL Fluoreszenz (Fig. 2B und D). Die Verhältnisse zwischen roter und grüner FL-Fluoreszenz wurden auf 1,11 ± 0,26 und 1,18 ± 0,16 bei 0,5 und 5 ug/ml CDP verringert(CistancheDeserticolaPolysaccharide)behandelten Gruppen, p < 0,01.="" die="" grüne="" fl-fluoreszenz="" war="" signifikant="">

3.4. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)verhinderte OGD/RP-induzierte Zellapoptose

Zellen mit kondensierten Chromatinen oder fragmentierten Zellkernen wurden als apoptotische Zellen bewertet [30]. Die Ergebnisse des Hoechst33342-Assays zeigten das Auftreten kondensierter Kerne nach OGD/RP (Abb. 3A und C). In den Zellkernen der Vehikelgruppe wurde eine hohe FL-Fluoreszenzintensität beobachtet. Die FL-Fluoreszenzintensität der Zellkerne war in 5 ug/ml CDP abgeschwächt(CistancheDeserticolaPolysaccharide)behandelte Gruppe. Wir analysierten die Apoptoserate in den PC12-Zellen durch Fellow-Zytometrie unter Verwendung von FITC-Annexin V/PI-Doppelfärbung (Abb. 3B und D). Die Kontrollgruppe hatte eine Zellapoptoserate von 4,16 Prozent ± 0,24 Prozent, während die Vehikelgruppe 22,98 Prozent ± 0,66 Prozent aufwies. In der mit 5 ug/ml CDP behandelten Gruppe betrug die Zellapoptoserate 7,86 Prozent ± 1,16 Prozent.

3.5. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)abgeschwächte OGD/RP-induzierte intrazelluläre ROS-Akkumulation und erhaltener Redoxstatus

Die Auswirkungen von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)auf oxidativen Stress wurden anhand der ROS-Erzeugung, GSH-Px, CAT-Aktivitäten und T-AOC-Spiegel nachgewiesen. Die ROS-Spiegel in den OGD/RP-geschädigten PC12-Zellen stiegen an und wurden signifikant höher als in der Kontrollgruppe (p < 0,01).="" inzwischen="" sind="" die="" ros-ebenen="" im="">(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Gruppen ({{0}},05, 0,5 und 5 ug/ml) nahmen dosisabhängig ab (p < 0,01;="" fig.="" 4a).="" darüber="" hinaus="" erhöhte="" cdp="" auch="" signifikant="" die="" t-aoc-="" (p="">< 0,05;="" 4b="" ),="" cat-="" (p="">< 0,05="" ;="" 4c="" )="" und="" gsh-px="" (p="">< 0,05="" ;="" 4d="" )-spiegel="" im="" vergleich="" zum="" vehikel="" gruppe.="" die="" aktivitäten="" von="" endogenen="" antioxidantien="" bei="">(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Gruppen zugenommen.

3.6. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)stimulierte die Sekretion von DJ-1 und verstärkte den Ausdruck von DJ-1

Konzentrationsänderungen von DJ-1 im Zellüberstand wurden nachgewiesen und deckten die mögliche Beziehung zwischen DJ-1 und CDP auf(CistancheDeserticolaPolysaccharide). Die DJ-1-Freisetzung wurde von den OGD/RP-geschädigten PC12-Zellen beobachtet (Fig. 5). DJ-1 wurde im 5 ug/ml CDP erheblich hochreguliert(CistancheDeserticolaPolysaccharide)-behandelten Gruppe (38,66 ± 8,44 pg/ml) und wurde signifikant höher als in der Vehikelgruppe (18,33 ± 3,80 pg/ml, p < 0,01) und der Kontrollgruppe (9,67 ± 3,96 pg/ml, p < 0,01) .

Um die Auswirkungen von CDP zu untersuchen(CistancheDeserticolaPolysaccharide)zur intrazellulären Expression von DJ-1 haben wir die DJ-1-Proteinspiegel durch Western-Blotting gemessen. Die DJ-1-Proteinexpressionsspiegel waren 24 h nach der Reperfusion signifikant erhöht. Im Gegensatz dazu verstärkte die Nachbehandlung mit 5 ug/ml CDP signifikant die Überexpression von DJ-1 im Vergleich zur Vehikelgruppe (p < 0,01,="" fig.="">

3.7. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)verbesserte DJ-1-Translokation in die Mitochondrien

Die PC12-Zellen wurden mit Anti-PARK7/DJ-1- und Anti-ATP-Synthase-Ketten-Antikörpern gefärbt (Fig. 7 und 8). Der Anti-ATP-Synthase-Ketten-Antikörper verbindet sich mit dem mitochondrialen Komplex I, und das bindende Antigen wurde in der inneren Membran der Mitochondrien lokalisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass DJ-1 nach dem OGD/RP-Insult in die mitochondriale Innenmembran transloziert wurde (Abb. 8). Unterdessen zeigten die DJ-1- und Mitochondrien-Doppelfärbungsergebnisse, dass das CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)erleichtert DJ- 1 mitochondriale Translokation und Co-Lokalisierung (Abb. 8). Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Interaktion zwischen DJ-1 undneuroprotektivWirkung von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)(Abb. 9).

4. Diskussion

In dieser Studie berichteten wir aus erster Hand, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Reduziert effektiv OGD/RP-induzierte PC12-Zellschäden über die Hochregulierung des DJ-1-Proteins. CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)verbesserte Zelllebensfähigkeit, reduzierte Zellmembranschäden, Aufrechterhaltung der intrazellulären Ca2-Plus-Homöostase, verhinderter MMP-Verlust, verringerte Zellapoptose, unterdrückter oxidativer Stress, geförderte Expression von DJ-1 und verbesserte DJ-1-Translokation in die Mitochondrien. DJ-1 wurde kürzlich in die Regulierung von verwickeltneuroprotektivWirkung und mitochondriale Integrität. Diese Ergebnisse lieferten überzeugende Beweise für dieneuroprotektivAuswirkungen von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)gegen Ischämie. Außerdem spielt die Interaktion zwischen CDP und DJ-1 eine RolleneuroprotektivRolle bei OGD/RP-induziertem PC12-Zellschaden. Die obigen Ergebnisse können unser Verständnis der vorteilhaften Wirkung von CDP erweitern und nützliche Informationen für die Therapie des Schlaganfalls in der Zukunft liefern.

Ischämie-Schlaganfall wurde einer komplexen Reihe von biochemischen und molekularen Mechanismen zugeschrieben, darunter Exzitotoxizität, Kalziumüberladung und oxidativer Stress [31]. OGD/RP wird häufig als In-vitro-Modell der Ischämie-Reperfusion verwendet und dient der Erforschung neurologischer und biochemischer Veränderungen. Die PC12-Zelllinie ist empfindlich gegenüber OGD/RP-Verletzungen [2]. Es weist eine Reihe von Eigenschaften und Merkmalen sympathischer Neuronen auf [32] und somit weit verbreitete neuronale Zelllinien für die Forschung im Zusammenhang mit den Mechanismen neurologischer Schäden durch Schlaganfall [33,34]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass oxidativer Stress eine wichtige Rolle bei Schlaganfällen und Hirnischämieschäden spielt [35–37]. Das mit der Parkinson-Krankheit assoziierte Protein DJ-1 kann die ischämische Neurodegeneration und Verhaltensstörungen hemmen, indem es die ROS-vermittelte neuronale Schädigung reduziert [7]. Daher haben wir das OGD/RP-Verletzungs-PC12-Zellmodell verwendet, um dies zu untersuchenneuroprotektivWirkung von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide).

Das Ausmaß der durch OGD/RP induzierten Schädigung in PC12-Zellen wurde durch MTT-, NRU- und LDH-Freisetzungsassays bewertet. Verwaltung von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)({{0}}.05, 0,5 und 5 ug/ml) verbesserte das Zellüberleben und verringerte die LDH-Freisetzung. Zu den vorteilhaften Wirkungen der CDP-Behandlung gehörten auch eine Verringerung der intrazellulären Kalziumüberladung und die Erhaltung von MMP. Anomalien der intrazellulären Ca2+-Konzentration, insbesondere eine mitochondriale Calciumüberladung, wurden mit neuronaler Apoptose und Tod durch Ischämie-Schlaganfall in Verbindung gebracht [38]. MMP kann die Effizienz der Elektronentransportkette widerspiegeln und wurde als pathologischer Störungsindex dieses Systems angegeben [39]. Sowohl Erhöhungen der intrazellulären Ca2 plus-Konzentration als auch MMP-Verlust können zu einer Destabilisierung der Neuronenstruktur und schließlich zu Zellschädigung oder Zelltod führen [21,40]. In dieser Studie zeigten die Ergebnisse, dass CDP die intrazelluläre Ca2-Plus-Überladung signifikant hemmte und die MMP-Spiegel in PC12-Zellen mit OGD/RP-Verletzung erhöhte. Apoptose spielt eine wichtige Rolle in der komplexen Pathophysiologie der zerebralen Ischämie-Reperfusionsverletzung. Zunehmende Daten deuteten darauf hin, dass Apoptose an mitochondrialer Dysfunktion beteiligt war; die Dissipation von MMP ist ein frühes Ereignis, das zu Zellapoptose führt [8,39]. Apoptose ist ein Prozess des energieabhängigen, programmierten Zelltods zur Beseitigung überflüssiger Zellen. Viele Neuronen im ischämischen Schlaganfall werden Apoptose durchlaufen [41]. In dieser Studie führten wir eine Hoechst33342- und Annexin-V-FITC/PI-Färbung durch, um die Wirkung von CDP auf die Apoptose zu untersuchen [23,28]. Die Ergebnisse zeigten, dass CDP die Integrität des Zellkerns aufrechterhält und die Zellapoptoserate verringert. Alle diese Ergebnisse zeigten, dass die anti-apoptotische Aktivität von CDP zu der vorteilhaften Wirkung bei neuronaler Schädigung in PC12-Zellen beitrug.

Zellen, die durch übermäßige ROS-Akkumulation Ischämieschäden erleiden, was zu Lipidperoxidation, Zellmembranschäden, Kalziumüberladung und mitochondrialer Dysfunktion führen kann, was letztendlich zu Zellapoptose und Zelltod führt [42]. Auch die Aufnahme körpereigener Antioxidantien wie SOD, CAT und GSH-Px deutete auf das Auftreten hin Abb. 9. Mögliche Mechanismen der protektiven Wirkung von CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)gegen OGD/RP-induzierte PC12-Zellschädigung. Die Behandlung von CDP unterdrückt oxidativen Stress, stabilisiert die Ca2-Plus-Konzentration und MMP, verbessert die DJ-1-Expression und -Lokalisierung in den Mitochondrien. Y. Liu et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 678von oxidativem Stress während Ischämie-Reperfusion. In dieser Studie zeigte die OGD/RP-Gruppe einen signifikanten Anstieg von ROS und eine Abnahme von CAT, GSH-Px und T-AOC im Vergleich zu der mit 5 ug/ml CDP behandelten Gruppe. Wir beobachteten jedoch einen erheblichen Rückgang der Raten der ROS-Bildung und des Verbrauchs von endogenen Antioxidantien (CAT, GSH-Px und T-AOC) in den CDP-Gruppen. Die vorteilhaften Wirkungen in der 5-ug/ml-CDP-Gruppe waren denen in der Nimo-Gruppe ähnlich. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CDP die Bildung von ROS hemmt und die enzymatische antioxidative Abwehr wiederherstellt.

DJ-1 ist ein wichtiger Redox-ReaktiverneuroprotektivProtein, das an der Regulation von oxidativem Stress beim Schlaganfall beteiligt ist. Zu den vorteilhaften Wirkungen der DJ-1-Überexpression gehören das Zellüberleben nach Ischämie-Reperfusion und die Erhaltung der mitochondrialen Funktion und Morphologie, wie z. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Schutzwirkung von DJ-1 in Zellen, die OGD/RP ausgesetzt sind, mit seinen antioxidativen Eigenschaften und der Mitochondrientranslokation zusammenhängt [43–45]. DJ-1 führt eine effiziente endogene Neuroprotektion durch, indem es mitochondriale Defekte durch Translokation mildert [46]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die DJ-1-Translokation einen Einfluss auf die Mitochondrienbewegung haben, die Zell-Zell-Interaktion verbessern und andere überlebensfördernde Prozesse der Zelle fördern kann.

DJ-1 beeinflusst mehrere Prozesse, wie z. B. Zellmigration und -adhäsion, Chemotaxis, Proliferation und Apoptose, sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Modellen [6,9,47,48]. Unter Verwendung des Schlaganfallmodells mit OGD/RP-verletzten PC12-Zellen untersuchten wir eine mögliche Beziehung zwischen CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)und DJ-1. DJ- 1-Überexpression wurde durch ELISA und Western-Blotting identifiziert. Zusammen mit dieser Funktion zeigte ein wichtiger Befund in den Experimenten, dass die signifikante Überexpression von DJ-1 auftrat, wenn CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)(5 ug/ml) wurde vor der Reperfusion verabreicht. Dies deutete auf eine möglicheneuroprotektivWirkung in der Beziehung von CDP und DJ-1. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass DJ-1, das sich in den Mitochondrien unter Bedingungen von OGD/RP und reichlicher Expression von DJ-1 befindet, die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber ROS verringert und oxidativen Stress hemmt [45]. Die Ergebnisse implizierten, dass CDP DJ-1 reguliert und verstärkt, das als molekulares Bindeglied zwischen Mitochondrien-Dysfunktion und oxidativem Stress fungiert und für ein Fortschreiten des sekundären Zelltods sorgt, der dem Schlaganfall innewohnt [5,47,49–51]. Zusammen mit der Stabilisierung von DJ-1 in den Mitochondrien, CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)Die Behandlung erhöhte das Zellüberleben, stabilisierte Ca2 plus Homöostase, verbesserte die MMP-Dissipation und verhindert mitochondrienbedingte Apoptose [43]. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass CDP einen Roman ausübtneuroprotektivMechanismus in der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls.

5. Schlussfolgerung

Unsere Ergebnisse zeigten, dass CDP(CistancheDeserticolaPolysaccharide)schützt PC12-Zellen vor OGD/RP-induzierter Schädigung durch seine antioxidativen Wirkungen, die teilweise dem DJ-1-vermittelten Signalweg zugeschrieben werden. Diese Wirkungen umfassen eine Verringerung der Zellmembranschädigung, Erhaltung der [Ca2 plus ] I-Homöostase, Verbesserung der MMP-Dissipation, Hemmung der Zellapoptose, Abschwächung der intrazellulären ROS und Modulation der DJ-1-Spiegel. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die Wechselwirkungen zwischen CDP und DJ-1 die Neuroprotektion verstärken und die mitochondriale Integrität aufrechterhalten. Daher können anfällige Neuronen durch CDP geschützt werden(CistancheDeserticolaPolysaccharide)über die Verstärkung der DJ-1-Expression während eines Ischämie-Schlaganfalls.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant 81360649), dem National Science and Technology Key Program (Grant 2015BAK45B01) und dem Science and Technology Support Program der Autonomen Region Ningxia Hui (Grant 2016BZ07) unterstützt.

Cistanche deserticola-Polysaccharidehaben eine Neuroprotektive Wirkung

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