Cistanche verbessert die Niereninfektion aufgrund von systemischem Lupus erythematodes

Kernantigen-reaktives CD4^PlusZellen dehnen sich bei aktivem systemischem Lupus erythematodes aus, produzieren Effektorzytokine und infizieren die Nieren

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Dimas Abdirama, Sebastian Tesch usw

SystemischLupusErythematodesist eine systemische und chronische Autoimmunerkrankung, die durch einen Toleranzverlust gegenüber nukleären Antigenen mit autoreaktivem CD4 gekennzeichnet ist^PlusT-Zellen, die an der Pathogenese von Krankheiten beteiligt sind. Seit dem Nachweis von humanem Autoantigen-spezifischem CD4 ist jedoch sehr wenig über ihre Rezeptorspezifität bekannt^PlusT-Zellen war eine große Herausforderung. Hier präsentieren wir eine Analyse von CD4^Plus T-Zellen, die auf Kernantigene reagieren, unter Verwendung von zwei komplementären Methoden: T-Zell-Bibliotheken und Antigen-reaktive T-Zell-Anreicherung. Die Frequenzen von nukleärem Antigen-spezifischem CD4^Plus T-Zellen korrelierten mit der Schwere der Erkrankung. Diese autoreaktiven T-Zellen produzieren Effektorzytokine wie Interferon-g, Interleukin-17 und Interleukin-10. Im Vergleich zu Blut waren diese Zellen im Urin von Patienten mit aktiver Lupusnephritis angereichert, was auf eine Infiltration der Infizierten hindeutetNieren. Somit unterstützen diese zuvor nicht erkannten Eigenschaften eine Rolle für nukleäres Antigen-spezifisches A CD4^PlusT-Zellen hineinsystemischLupusErythematodes.

Copyright ª 2020, Internationale Gesellschaft für Nephrologie. Veröffentlicht von Elsevier Inc. Dies ist ein Open-Access-Artikel unter der Lizenz CC BY-NC-ND

SCHLÜSSELWÖRTER: LupusErythematodes, Niere,

SystemischLupusErythematodesist eine systemische und chronische Autoimmunerkrankung, die durch einen Toleranzverlust gegenüber nuklearen Antigenen gekennzeichnet ist, der auf eine fehlerhafte Entsorgung von biologischen Abfällen wie apoptotischem Material, das Ribonukleoproteine ​​und Nukleosomen enthält, zurückzuführen ist.1 Gegen nukleare Antigene gerichtete Autoantikörper sind charakteristisch fürsystemischLupusErythematodesund tritt normalerweise vor der manifesten Krankheit auf. Außerdem autoreaktives CD4^PlusT-Zellen sind an der Pathogenese von beteiligtsystemischLupusErythematodesdurch die Förderung der Autoantikörperproduktion durch B-Zellen und die direkte Ausbreitung von Organschäden in infizierten Zielorganen. Obwohl bereits früher über den Nachweis nukleärer Antigen-reaktiver T-Zellen berichtet wurde, liegen die Beweise für ihre Existenz bis jetzt weit verbreitet vor, und es ist derzeit unklar, wie sie in der Pathogenese zusammenwirken. Das Verständnis, wie diese Zellen an der Autoimmunität beteiligt sind, wird für die Entwicklung einer wirksamen Behandlung entscheidend sein.

Der Nachweis von Autoantigen-spezifischen T-Zellen wird durch ihre außerordentlich geringen Häufigkeiten im zirkulierenden Blut erschwert. Frühere Studien zu menschlichem naivem CD4^PlusT-Zell-Repertoires haben Tetramer-basierte Technologie verwendet, um präzise Informationen über T-Zell-Antworten auf spezifische Antigen-Epitope bereitzustellen; Dieses Verfahren erfordert jedoch vorherige Kenntnis der menschlichen Leukozyten-Antigentypen des Spenders. Alternative Techniken zum gleichzeitigen Nachweis und zur Zählung seltener T-Zellpopulationen mit Reaktivität auf verschiedene Antigene ohne vorherige Kenntnis der menschlichen Leukozyten-Antigentypen wurden unter Verwendung von Bibliotheken amplifizierter polyklonaler T-Zellen und durch Anreicherung von CD154--exprimierenden T-Zellen nach der Stimulation entwickelt mit einem Antigen namens ARTE (Antigen-reaktive T-Zell-Anreicherung).

SystemischLupusErythematodesist schädlich fürNieren, aber Cistanche kann sich verbessernNiereFunktionen.

CD4^Plus T-Zellen üben ihre Funktion hauptsächlich durch die Sekretion von Zytokinen nach antigener Aktivierung aus16 und durch die Ausbreitung von Gewebeentzündungen wie zLupusNephritisdie eine der schwerwiegendsten Komplikationen von darstelltsystemischLupusErythematodes. Analyse des vorhandenen T-Zell-Repertoires inNiereBiopsien von Patienten mitLupusNephritisoffenbarte Oligoklonalität vonNiere-infiltriert CD4^Plus T-Zellen, was auf eine Akkumulation antigenspezifischer T-Zellen in infizierten Zellen hinweistNieren. Unsere vorherige Studie zeigte Urin-T-Zellen bei Patienten mit aktiverLupus Nephritisals präziser Biomarker, der dem Phänotyp intrarenaler Zellen ähnelt. Obwohl diese Zellen mit CXC-Chemokinrezeptor 3 und CC-Chemokinrezeptor 5 angereichert sind, exprimieren T-Zellen, die auf eine T-Helferzellen-1-(Th1)-Zellpopulation hinweisen, und enthalten CD154^PlusT-Zellen, die auf eine kürzliche Antigen-Begegnung hindeuten, ihre Antigenspezifität gegenüber Kernantigenen bleibt unklar.

In dieser Studie präsentieren wir eine Analyse von CD4^Plus T-Zellen, die auf Kernantigene reagieren, bei insgesamt 17 gesunden Personen, 12 Personen mit inaktivensystemischLupusErythematodes, und 20 Themen mit aktivsystemischLupusErythematodesdurch Verwendung von T-Zell-Bibliotheken und ARTE-Techniken zur Analyse der Frequenzen von autoreaktivem CD4^Plus T-Zellen im peripheren Blut und Urin von Patienten mitLupusNephritissowie die Zytokinproduktion.

ERGEBNISSE

Kernantigen-reaktives CD4^PlusT-Zellen sind expandierter inaktiver systemischer Lupus erythematodes, wie unter Verwendung der T-Zell-Bibliothek und ARTE bestimmt

mit aktivsystemischLupusErythematodes. Diese Zellen waren auch bei 5 von 6 Patienten mit Inaktivität nachweisbarsystemischLupusErythematodes, während nur 3 von 6 gesunden Kontrollen im Umlauf warenautoreaktivT Zellen. Interessanterweise Patienten mit aktivsystemischLupusErythematodeszeigten auch eine breitere Vielfalt an autoreaktiven T-Zell-Antworten, wobei jeder Patient reaktive T-Zellen gegen mindestens 3 Kernantigene aufwies. Im Vergleich dazu war das Zielportfolio bei inaktiven Patienten weniger variabelsystemischLupusErythematodesund gesunde Kontrollen. Zusammengenommen sind zirkulierende nukleare Antigen-reaktive T-Zellen nicht ausschließlich fürsystemischLupusErythematodes, aber inaktivsystemischLupusErythematodes, ihre Anzahl ist größer und ihre Zielstrukturen variabler.

Da autoreaktive T-Zellen eine Rolle bei der Ausbreitung von Autoimmunreaktionen spielen, verglichen wir die Anzahl der autoreaktiven T-Zellen mit dem Schweregrad der Erkrankung, bewertet durch diesystemischLupusErythematodesKrankheitsaktivitätsindex (systemischLupusErythematodesDAI) Punktzahl. Nur die Frequenzen von CD4^PlusT-Zellen, die auf RNP70 reagieren, korrelieren positiv mit Ro und LasystemischLupusErythematodesDAI (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ 0.4865; Ro: P ¼ 0.005 , r=0,6299, La: P=0,01, r=0,5651) (Abbildung 1d). Im Gegensatz dazu wurde die Häufigkeit von auf Transthyretin reaktiven T-Zellen in allen 3 Gruppen auf einem ziemlich ähnlichen Niveau gefunden (Abbildung 1e), wodurch eine mögliche experimentelle Verzerrung aufgrund einer allgemeinen nicht-antigenspezifischen T-Zell-Inaktivität verworfen wirdsystemischLupusErythematodes.

T-Zell-Bibliotheken bieten eine Reihe von Vorteilen, darunter eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis sehr seltener Zellen innerhalb einer geringen Anzahl von Eingabezellen. Diese Technik beruht jedoch auf der Expansion von Zellen, die die Zellzusammensetzung verändern kann, und bietet nur eine begrenzte Möglichkeit, die reaktiven Zellen phänotypisch zu charakterisieren. Daher haben wir unsere Beobachtungen mit der ARTE-Methode validiert. Das ARTE-Protokoll erfordert größere Mengen an Eingabezellen, was besonders bei Patienten mitsystemischLupusErythematodesdie sich oft mit Lymphopenie und Anämie präsentieren. Aufgrund dieser Einschränkung und auch um das erwartete Auslesen reaktiver Zellen zu erhöhen, haben wir alle 5 kanonischen Kernantigene gepoolt und diesen Pool verwendet, um periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) vor der Anreicherung von CD154--exprimierenden Zellen (n ¼ 15 Patienten mitsystemischLupusErythematodes; n ¼ 6 gesunde Kontrollen). Unter Verwendung einer Kombination der Oberflächenmarker CD154 und CD69 reagieren T-ZellensystemischLupusErythematodes-assoziierte Kernantigene konnten innerhalb einer Hintergrundpopulation identifiziert werden (Abbildung 1f). Obwohl die Hintergrundexpression von CD154 und CD69 bei allen Individuen reichlich beobachtet wurde, wurden Patienten mit aktiversystemischLupusErythematodeshatten signifikant erhöhte Frequenzen von CD154 plus CD69 plus T-Zellen, wenn sie mit nuklearen Antigenen stimuliert wurden, verglichen mit der Hintergrundstimulation (P ¼ 0.008), wohingegen gesunde Personen und Patienten mit inaktivensystemischLupusErythematodeshatten ähnliche Häufigkeiten zwischen Antigen-stimulierten und nicht stimulierten Zellen (gesunde Personen: P ¼ 0.44; Patienten mit inaktivensystemischLupusErythematodes: P ¼ {{0}}.56) (Abbildung 1g). Außerdem waren durch Subtraktion der Hintergrundhäufigkeiten die Häufigkeiten nukleärer Antigen-reaktiver T-Zellen bei Patienten mit aktiver Erkrankung höher als bei gesunden Personen und Patienten mit inaktiver Erkrankung (P ¼ 0.02 und P ¼ 0.11) (Abbildung 1h). Die Häufigkeit von Hintergrund-subtrahierten nuklearen Antigen-reaktiven T-Zellen korrelierte daher positiv mit der Krankheitsaktivität (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), was auf ihre potenzielle Rolle hindeutetsystemischLupusErythematodes.

T-Zell-Bibliotheken bieten eine Reihe von Vorteilen, darunter eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis sehr seltener Zellen innerhalb einer geringen Anzahl von Eingabezellen. Diese Technik beruht jedoch auf der Expansion von Zellen, die die Zellzusammensetzung verändern kann, und bietet nur eine begrenzte Möglichkeit, die reaktiven Zellen phänotypisch zu charakterisieren. Daher haben wir unsere Beobachtungen mit der ARTE-Methode validiert. Das ARTE-Protokoll erfordert größere Mengen an Input-Zellen, was besonders bei Patienten mit systemischerLupusErythematodesdie sich oft mit Lymphopenie und Anämie präsentieren. Aufgrund dieser Einschränkung und auch um das erwartete Auslesen reaktiver Zellen zu erhöhen, haben wir alle 5 kanonischen Kernantigene gepoolt und diesen Pool verwendet, um periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) vor der Anreicherung von CD154--exprimierenden Zellen (n ¼ 15 Patienten mitsystemischLupusErythematodes; n ¼ 6 gesunde Kontrollen). Unter Verwendung einer Kombination der Oberflächenmarker CD154 und CD69 reagieren T-ZellensystemischLupusErythematodes-assoziierte Kernantigene konnten innerhalb einer Hintergrundpopulation identifiziert werden (Abbildung 1f). Obwohl die Hintergrundexpression von CD154 und CD69 bei allen Individuen reichlich beobachtet wurde, wurden Patienten mit aktiversystemischLupusErythematodeshatten signifikant erhöhte Frequenzen von CD154^PlusCD69^PlusT-Zellen bei Stimulation mit Kernantigenen im Vergleich zur Hintergrundstimulation (P ¼ 0.008), während gesunde Personen und Patienten mit inaktivensystemischLupusErythematodeshatten ähnliche Häufigkeiten zwischen Antigen-stimulierten und nicht stimulierten Zellen (gesunde Personen: P ¼ 0.44; Patienten mit inaktivensystemischLupusErythematodes: P ¼ {{0}}.56) (Abbildung 1g). Außerdem waren durch Subtraktion der Hintergrundhäufigkeiten die Häufigkeiten nukleärer Antigen-reaktiver T-Zellen bei Patienten mit aktiver Erkrankung höher als bei gesunden Personen und Patienten mit inaktiver Erkrankung (P ¼ 0.02 und P ¼ 0.11) (Abbildung 1h). Die Häufigkeit von Hintergrund-subtrahierten nuklearen Antigen-reaktiven T-Zellen korrelierte daher positiv mit der Krankheitsaktivität (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), was auf ihre potenzielle Rolle hindeutetsystemischLupusErythematodesPathogenese (Abbildung 1i). Außerdem CD4^PlusT-Zellen, die auf ein Recall-Antigen Candida albicans MP65 reagieren, zeigten ähnliche Häufigkeiten bei den Spendern (Abbildung 1j), wobei die Möglichkeit einer allgemeinen Neigung zu höheren Häufigkeiten von Antigen-reaktiven T-Zellen bei Patienten mit aktiv ausgeschlossen wirdsystemischLupusErythematodes.

Insgesamt zeigen unsere mit der T-Zell-Bibliothek und den ARTE-Methoden generierten Daten eine Expansion des Autoantigen-spezifischen CD4^PlusT-Zellen bei Patienten mit aktiversystemischLupusErythematodes. Beide Techniken sind jedoch vergleichbar, was durch ähnliche mediane Stimulationsindexwerte zwischen Antigen-stimulierten und nicht stimulierten T-Zell-Antworten angezeigt wird (medianer Stimulationsindex-T-Zell-Bibliothek: 1,857; ARTE: 1,614; P ¼ 0,33). die ARTE-Technik zeigte höhere Frequenzen von nukleärem Antigen-reaktivem CD4^Plus T-Zellen als die T-Zellbibliothek-Technik (Abbildung 1k).

Cistanchekann die Infektion der verbessernNiere.

Kernantigen-reaktive T-Zellen bei gesunden Personen sind echte autoreaktive CD4-Zellen^PlusT-Zellen

Sowohl T-Zell-Bibliothek als auch ARTE-Techniken demonstrierten den Nachweis vonautoreaktivT Zellenbei Gesunden, die einen möglichen Ursprung für die Entstehung menschlicher Autoimmunität darstellen. Ihre Anzahl unterschied sich jedoch nicht signifikant von den Hintergrundfrequenzen, sodass ungewiss blieb, ob gesunde Probanden tatsächlich nukleäres Antigen-reaktives CD4 zirkulieren müssen^PlusT-Zellen. Um die Antigen-Spezifität von autoreaktiven T-Zellen bei gesunden Probanden aufzuklären, haben wir einzelne T-Zell-Klone von CD154 erzeugt^PlusCD69^PlusCD4^PlusAus gesunden Personen isolierte T-Zell-Vorläufer nach Stimulation von PBMCs mit individuellen Kernantigenen und einem aus Aspergillus fumigatus-Lysat gewonnenen Kontrollantigen. Eine beträchtliche Anzahl vonsystemischLupusErythematodes-assoziierte Autoantigen-spezifische T-Zell-Klone reagierten auf ihre entsprechenden Antigene nach Antigen-Restimulation, wie durch die Koexpression von IFN-g mit CD154 hervorgehoben wurde (Anzahl spezifischer Klone – Aspergillus fumigatus: 5 von 5; SmD1: 4 von 8; RNP70: 3 von 11; Histon: 5 von 5; Ro: 4 von 9; La: 5 von 7) (ergänzende Abbildung S2A und B). Darüber hinaus war die Antigenantwort (repräsentativ für SmD1 gezeigt) dosisabhängig, was betont, dass nukleare Antigen-reaktive T-Zellen bei gesunden Personen echte autoreaktive CD4-Zellen sind^PlusT-Zellen (ergänzende Abbildung S2C). Somit bestätigten wir die Existenz nukleärer Antigen-reaktiver T-Zellen bei gesunden Probanden innerhalb des Hintergrundsignals der angewandten Nachweismethoden.

Zytokinproduktion von nukleären Antigen-reaktiven CD4 plus T-Zellen

Als nächstes untersuchten wir die Zytokinproduktion von nukleärem Antigen-reaktivem CD4^PlusT-Zellen. CD154--exprimierende Zellen wurden intrazellulär auf Effektorzytokine wie IFN-g, Interleukin (IL)-17, IL-4 und IL-10 gefärbt, nachdem sie mit einem Pool von stimuliert wurdensystemischLupusErythematodes-assoziierte Kernantigene (Abbildung 2a). Frequenzen von IFN-g–, IL-17– und IL-10–produzierendem CD154^PlusCD4^PlusT-Zellen waren bei Patienten mit aktiver signifikant erhöhtsystemischLupusErythematodes(alle Zytokine: P ¼ {{0}}.004), während die Häufigkeit von IL-4-produzierenden autoreaktiven T-Zellen nicht von der Hintergrundfrequenz (P ¼ 0,125) unterscheidbar blieb (Abbildung 2b). Darüber hinaus waren die absoluten Zahlen von IFN-g– und IL-10–produzierenden autoreaktiven T-Zellen bei Patienten mit aktiver T-Zelle höhersystemischLupusErythematodesals bei gesunden Personen und Patienten mit inaktivensystemischLupusErythematodes(Abbildung 2b). Durch Subtraktion der Hintergrundfrequenzen werden Patienten mit aktivsystemischLupus Erythematodeshatten signifikant höhere Frequenzen von IFN-g– und IL-10–produzierenden autoreaktiven T-Zellen als gesunde Personen (IFN-g: P ¼ 0.003; IL{{5} }: P ¼ 0,004) sowie von IFN-g–, IL-17– und IL-10–produzierenden autoreaktiven T-Zellen als Patienten mit inaktivensystemischLupusErythematodes(IFN-g: P ¼ 0.002; IL-17: P ¼ 0.00 2; IL-10: P ¼ 0.005) (Abbildung 2c). Darüber hinaus korrelierte die Häufigkeit von IFN-g– und IL-10–, aber nicht von IL-17– und IL-4–produzierenden Kernantigen–reaktiven T-Zellen mit der Krankheitsaktivität. Allerdings zeigte nur die Häufigkeit von IL-4-produzierenden Zellen eine geringere Korrelation mit der Krankheitsaktivität (IFN-g: P < 0.0001,="" r="" ¼="" 0,7574;="" il{{20}="" }:="" p="0,005," r="0,5889;" il-4:="" p="0,14," r="0,3717;" il-="" 10:="" p="0,0004," r="0,6977)" (abbildung="" 2d).="" gemessen="" an="" der="" häufigkeit="" von="" ifn-g-produzenten,="" antigen-reaktives="">^PlusT-Zellen waren hauptsächlich von der Th1-Linie. Im Gegensatz dazu wurden sowohl IL-17- als auch IL-10-Produzenten nur in geringerer Häufigkeit nachgewiesen.26 Im Vergleich zu den Autoantikörperspiegeln sind die Häufigkeiten von Zytokin-produzierendem CD4^PlusT-Zellen korrelierten nicht mit der Konzentration von anti-doppelsträngiger DNA und mit dem Serumtiter von antinukleären Antikörpern (ergänzende Abbildung S3A und B). Keine andere Korrelation zwischen Kernantigen-reaktivem CD4^PlusMit Ausnahme von La-reaktivem CD4 wurden T-Zellen und Autoantikörper beobachtet^PlusT-Zellen gegen La-Autoantikörper (ergänzende Abbildung S3C).

Nachweis nukleärer Antigen-reaktiver CD4 plus T-Zellen im Urin von Patienten mit aktivem systemischem Lupus erythematodes und Lupusnephritis

Es wird vermutet, dass die Population nukleärer Antigen-reaktiver Th1-Zellen in die eindringtNiereGewebe, wo sie auf ihr fast allgegenwärtiges verwandtes Antigen treffen könnten. Durch die Untersuchung des T-Zell-Rezeptor (TCR)-b-Repertoires von CD4^PlusAus peripherem Blut isolierte T-Zellen verglichen mit solchen, die aus dem Urin von 5 Patienten isoliert wurdensystemischLupusErythematodesund aktivLupusNephritisbeobachteten wir ein oligoklonal verzerrtes TCR-Repertoire von aus Urin stammenden Zellen (Abbildung 3a). Die kumulative Häufigkeit der 20 am häufigsten vorkommenden T-Zellklone war im Urin signifikant höher, was einem niedrigeren Diversitätsindex entspricht (ergänzende Abbildung S4A). Um zu testen, ob diese Zellen auch Reaktivität gegenüber einer Reihe von zeigensystemischLupusErythematodes-assoziierten Kernantigenen haben wir Bibliotheken erstellt, die aus Urin-CD4 bestehen^PlusT-Zellen von 3 Patienten mit isoliertsystemischLupusErythematodesund aktivLupusNephritis(Ergänzende Abbildung S4B). Urin-CD4^Plus T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 wurden für die Zählung von CD4 im Urin eingeschlossen^PlusT-Zellen, die für das einzelne Kernantigen spezifisch sind. Parallel zu Urin-CD4^PlusT-Zellen, die Häufigkeit von nukleärem Antigen-reaktivem CD4^PlusT-Zellen im peripheren Blut wurden bestimmt, was einen direkten Vergleich der jeweiligen Häufigkeiten innerhalb derselben Personen ermöglichte (Abbildung 3b). Wir fanden das inaktivLupusNephritis, die Frequenzen von nukleärem Antigen-reaktivem CD4 im Urin^PlusT-Zellen waren höher als die des peripheren Blutes. Um diese Beobachtung zu bestätigen, markierten wir Urinzellen, die aus 4 aktiv isoliert wurdenLupusNephritisSpender mit Carboxyfluorescein-Succinimidylester und mischte die markierten Zellen mit Spender-abgestimmten PBMCs, um einen direkten Vergleich antigenreaktiver Zellen in einem Assay unter Verwendung der ARTE-Technik zu ermöglichen. Die Frequenz von CD154^PlusCD69^PlusT-Zellen in stimulierten und nicht stimulierten Proben von Spender-abgestimmten Urin- und peripheren Blutzellen wurden verwendet, um zu beurteilen, ob nukleare Antigen-reaktive T-Zellen im Urin als Proxy für die angereichert sindNieredurch Berechnung des Stimulationsindex (Abbildung 3c). Obwohl sich die Urin-T-Zellbibliothek und die ARTE-Methoden in ihrem mittleren Stimulationsindex für die Kernantigene unterschieden (Stimulationsindex – Urin-T-Zellbibliothek: 17; ARTE: 2,79; P ¼ 0,4) (Abbildung 3d) , Analyse der Autoreaktivität in peripherem und urinärem CD4^Plus T-Zellen aus beiden Methoden (insgesamt n ¼ 7) zeigten einen erhöhten nukleären Antigen-spezifischen Stimulationsindex im Urin (P ¼ 0.0156) (Abbildung 3e). Diese Beobachtungen legen nahe, dass nukleäres Antigen-reaktives CD4^PlusT-Zellen dringen ein und sammeln sich darin aninfiziertNieren. So kommt es zu lokalen GewebeentzündungensystemischLupusErythematodeskönnte ein Antigen-spezifisches Phänomen sein und direkt durch das Infiltrieren moduliert werdenautoreaktivT Zellen.

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