Phenylethanoidglykoside aus Cistanche Tubulosa induzieren Apoptose in Eca-109-Zellen über den Mitochondrien-abhängigen Weg

Einführung

Speiseröhrenkrebs ist eine der häufigsten Krebsarten mit der elfthöchsten Morbiditätsrate und der sechsthöchsten Sterblichkeitsrate weltweit und verursachte im Jahr 2015 etwa 439 Todesfälle. Die Inzidenz von Speiseröhrenkrebs variiert deutlich zwischen den verschiedenen Regionen, insbesondere im Osten Asien sowie das östliche und südliche Afrika wiesen 2012 die höchsten Inzidenzraten und Westafrika die niedrigsten Raten auf. In China betrugen die geschätzten Fälle und Todesfälle durch Speiseröhrenkrebs 477,000 bzw. 375,000 , im Jahr 2015. Obwohl die Morbiditätsrate von Speiseröhrenkrebs in Ländern mit mittlerem und hohem soziodemografischem Index zwischen 2005 und 2015 zurückgegangen ist, bleibt die Sterblichkeitsrate aufgrund der schlechten Prognose hoch. Die Kombination einer chirurgischen Resektion mit Chemotherapie oder Strahlentherapie wurde zur Behandlung von Speiseröhrenkrebs eingesetzt, es wurde jedoch berichtet, dass zwischen 2003 und 2014 die Überlebensrate von 5-Jahren gleich blieb<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyhat das bewiesenCistanche tubulosa Phenylethanoidglykoside(CTPG) könnte das Wachstum von Melanom-B16-F10-Zellen in vitro und in vivo unterdrücken (24). Allerdings schränkt die schlechte Wasserlöslichkeit des bisher verwendeten CTPG die Arzneimittelentwicklung ein. Daher wurde wasserlösliches CTPG (CTPG-W) verwendet und die Antitumorwirkung auf Speiseröhrenkrebszellen (Eca-109) untersucht. Es wurde festgestellt, dass CTPG-W die Lebensfähigkeit von Eca-109-Zellen durch die Induktion von Apoptose über einen mitochondrienabhängigen Weg dosisabhängig hemmen kann.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER SEXUELLEN FUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Materialen und Methoden

Tiere.

Weibliche C57BL/6-Mäuse (6-8 Wochen, ~25 g) wurden vom Beijing Laboratory Animal Research Center (Peking, China) gekauft und in temperaturkontrollierten (25 °C), lichtzyklischen (12/ 12) Tierfarm der Xinjiang-Universität (Urumqi, China). Alle Tiere erhielten erregerfreies Wasser und Futter.

Zelllinie und Kultur.

Die menschliche Speiseröhrenkrebs-Zelllinie (Eca-109) wurde vom Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, China) konserviert und in RPMI{{1} kultiviert. } Medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, China), 1 % L -Glutamin (100 mM), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).

CTPG-W (Kat.-Nr. SGJG20170410) wurde von Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Die Hauptbestandteile von CTPG wurden gemäß unserer vorherigen Studie (24) durch HPLC qualifiziert und quantifiziert. Kurz gesagt, HPLC wurde auf einer ZORBAX SB-C18-Säule (250 x 4,6 mm; 5 µm) bei 30 °C durchgeführt und mit 0,2 % Ameisensäurelösung und einem Methanolgradienten beginnend bei 23 % eluiert, wobei jede Minute 1 ml zugegeben wurde 45 Minuten lang, bis 31 % erreicht sind. Insgesamt wurden 10 µl Probe injiziert und bei 330 nm detektiert. Der Echinacosid-Standard wurde von Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) und der Acteoside-Standard von Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) bezogen. Die Standards wurden zur Analyse der Komponenten von CTPG-W verwendet.

MTT-Assay.

Die Zellproliferation wurde mit einem MTT-Assay gemessen. Eca{{0}}-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 5x103 Zellen in 100 µl RPMI{{5 inokuliert }} Medium/Vertiefung und 24 Stunden lang bei 37 °C kultiviert, dann 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen (0, 200, 400, 600 und 800 µg/ml) CTPG-W oder 0,4 % Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelt. 48 und 72 Stunden. Als Lösungsmittelkontrolle wurde DMSO verwendet (800 µg/ml CTPG-W mit 0,4 % DMSO). Als Positivkontrolle wurde Cisplatin (20 µg/ml) verwendet. Anschließend wurde der Überstand nach 5-minütiger Zentrifugation bei 225 xg bei Raumtemperatur verworfen und 100 µl MTT-Lösung (0,5 mg/ml in RPMI-1640-Medium ohne FBS) in jede Vertiefung gegeben und 3 Minuten bei 37 °C inkubiert H. Die gebildeten Formazankristalle wurden in 200 µl DMSO gelöst. Die Werte der optischen Dichte (OD) wurden bei einer Wellenlänge von 490 nm mit einem 96-Well-Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) gemessen. Die relative Zelllebensfähigkeit wurde nach der Formel berechnet: Zelllebensfähigkeit (%)=(ODbehandelt/ODunbehandelt)x100 %. Die Morphologie von Eca-109-Zellen wurde mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (200-fache Vergrößerung) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokio, Japan) beobachtet.

Zur Proliferation von Splenozyten wurden C57BL/6-Mäuse durch Zervixluxation eingeschläfert und die Milz isoliert. Die Einzelzellsuspension wurde hergestellt und Splenozyten wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1x105 Zellen/Well in 100 µl RPMI-1640-Medium ausgesät und dann mit unterschiedlichen Konzentrationen behandelt (0, 200, 400, 600 und 800 µg/ml) CTPG-W für 24, 48 und 72 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO2. Die Proliferation von Splenozyten wurde mittels MTT-Assay gemäß dem oben genannten Protokoll gemessen. Stimulatorischer Index=ODbehandelt/ODunbehandelt.

Messung der Apoptose und des Zellzyklus. Eca{{0}}-Zellen wurden in 60 mm-Schalen mit einer Dichte von 2,5 x 105 Zellen/Schale 24 Stunden lang kultiviert und mit unterschiedlichen Konzentrationen behandelt ({{31} }, 200, 400, 600 und 800 µg/ml) CTPG-W oder 0,4 % DMSO für 24 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO2. Die Zellen wurden gesammelt und mit einem Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat (FITC)/Propidiumiodid (PI) Apoptose-Nachweiskit (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) gemäß den Protokollen des Herstellers gefärbt. Die Proben wurden mittels Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) gesammelt und mit FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) analysiert. Um die Wirkung von CTPG-W auf den Zellzyklus zu analysieren, wurden 2,5x105 Eca-109-Zellen in 60-mm-Kulturschalen ausgesät und mit CTPG-W (0, 100, 200 und 400 µg/ml) oder 0,4 behandelt % DMSO für 24 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO2. Alle Zellen wurden geerntet und zweimal mit eiskaltem PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) gewaschen und dann 30 Minuten lang in 70 % eiskaltem Ethanol bei 4 °C fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit eiskaltem PBS wurden die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 300 µl PI/RNase-Färbepuffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) resuspendiert. Die Zellzyklusverteilung wurde mit der Software ModFit LT 3.0 mittels Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur) analysiert.

NATÜRLICHE CISTANCHE TUBULOSAAnti-MüdigkeitSchützen Sie die Leber PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Analyse des mitochondrialen Membranpotentials (Δψm) und reaktiver Sauerstoffspezies (ROS).Zur Analyse des Δψm wurden Eca{{0}}-Zellen mit CTPG-W (0, 400, 600 und 800 µg/ml) oder 0,4 % DMSO behandelt 24 Stunden bei 37˚C mit 5 % CO2 und gefärbt mit dem Mitochondrial Membran Potential Assay Kit mit JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China), gemäß dem Protokoll des Herstellers, für 20 Minuten bei 37˚ C. Nach zweimaligem Waschen mit JC-1-Waschpuffer (Beyotime Institute of Biotechnology) wurden die Proben mit 300 µl JC-1-Waschpuffer resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur) analysiert. Die Fluoreszenz des JC-1-Farbstoffs in Eca-109-Zellen wurde auch mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (200-fache Vergrößerung; Nikon Eclipse Ti-E) beobachtet. Zur Analyse von ROS wurden Eca-109-Zellen 2, 4, 6, 12 und 24 Stunden lang mit CTPG-W (0, 400, 600 und 800 µg/ml) behandelt und mit dem Reactive Oxygen Species Assay gefärbt Kit (Beyotime Institute of Biotechnology) gemäß dem Protokoll des Herstellers für 20 Minuten bei 37 °C. Nach dreimaligem Waschen mit eiskaltem PBS wurden die Proben mittels Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur) gesammelt und mit der Software FlowJo 7.6 analysiert.

Abbildung 1. Die qualifizierte Steuerung von CTPG-W. Die Komponenten von CTPG-W wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie qualitativ und quantitativ analysiert und mit den Standards Echinacosid und Acteosid verglichen. CTPG-W, wasserlösliche Phenylethanoidglykoside vonC. tubulosa.

Radikalfängeraktivität von 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Die Radikalfängeraktivität von CTPG-W wurde mit einem DPPH-Radikaltest gemäß dem veröffentlichten Protokoll mit einer geringfügigen Modifikation bestimmt, da Methanol durch Ethanol ersetzt wurde, um DPPH aufzulösen (25,26). Für Steady-State-Messungen wurden 150 µl DPPH (100 mmol/l) in Ethanol mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 und 600 µg/ml) in 50 µl PBS verdünnt und 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption bei 517 nm wurde in Gegenwart und Abwesenheit von CTPG-W nachgewiesen. Als Positivkontrolle wurden insgesamt 50 µl Vitamin C verwendet. Die DPPH-Radikalfängeraktivität wurde mit der Formel berechnet: Scavenging (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, wobei Ablank die Absorption der Kontrolle (ohne DPPH), Asample, ist ist die Absorption der Probe und A0 ist die Absorption von PBS mit DPPH.

Western-Blot-Analyse. Eca{{0}}-Zellen wurden mit CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) oder 0,4 % DMSO für 24 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO2 behandelt. Anschließend werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen 

Abbildung 2. Die Wirkung von CTPG-W auf das Wachstum von Eca-109-Zellen und Splenozyten. (A) Eca-109-Zellen wurden 24, 48 und 72 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt, und dann wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit einem MTT-Assay nachgewiesen. (B) Die morphologischen Veränderungen von Eca-109-Zellen nach CTPG-W-Behandlung nach 24 Stunden. (C) Splenozyten von C57BL/6-Mäusen wurden 24, 48 und 72 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt und anschließend wurde die Proliferation mit einem MTT-Assay analysiert.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

wurden in Radioimmunpräzipitationsassay-Lysepuffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, China) 20 Minuten lang auf Eis lysiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 10,000 xg und 4 °C wurden die Überstände gesammelt und die Proteinkonzentrationen mit einem Bicinchoninsäure-Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) gemäß den Protokollen des Herstellers nachgewiesen. Die Western-Blot-Analyse wurde gemäß unserer vorherigen Beschreibung durchgeführt (24). Die Antikörper gegen Caspase-7 (Kat.-Nr. D120077), Caspase-8 (Kat.-Nr. D155240), Caspase-9 (Kat.-Nr. D220078), B-Zell-Lymphom{ {13}} (Bcl-2)-assoziiertes ) (Kat.-Nr. D111050) und Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Kat.-Nr. D110058) wurden von BBI Life Sciences (Shanghai, China) erworben. Die Antikörper gegen Caspase-3 (Kat.-Nr. E-AB-10050) und aktive Caspase-3 (Kat.-Nr. E-AB-22115) wurden von Elabscience gekauft ( Wuhan, China). Andere Antikörper gegen Caspase-7 (Kat.-Nr. 9492), Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) (Kat.-Nr. 9542), Cytochrom c (Kat.-Nr. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminale Kinase (JNK) (Kat.-Nr. 9252S) und -Actin (Kat.-Nr. 58169) wurden von Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) erhalten. Alle primären und sekundären Antikörper wurden im Verhältnis 1:1 verdünnt,000. Die primären Antikörper wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert und die sekundären Antikörper wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert.

Abbildung 3. Die durch CTPG-W induzierte Apoptose von Eca-109-Zellen. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt. (A) Die apoptotischen und nekrotischen Eca-109-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das obere Feld zeigt die einzelnen Punktdiagramme und das untere Feld zeigt die zusammenfassenden Daten. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Die Zielproteine ​​wurden mithilfe eines verstärkten Chemilumineszenz-Assay-Kits (Beyotime Institute of Biotechnology) gemäß dem Protokoll des Herstellers nachgewiesen.

Statistische Analyse. Die statistische Signifikanz wurde durch einseitige Varianzanalyse mit Tukeys Post-hoc-Test berechnet und die Ergebnisse wurden mit der Software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) in den Behandlungs- und Kontrollgruppen analysiert. Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

CISTANCHE TUBULOSA-EXTRAKT ZUR VERBESSERUNG DER NIERENFUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Ergebnisse

CTPG-W unterdrückt das Wachstum von Eca-109-Zellen.

Die Komponenten von CTPG-W wurden durch HPLC qualifiziert und quantifiziert (Abb. 1) und mit den Standards von Echinacosid und Acteosid verglichen. Gemäß den Peak-Retentionszeiten und Peak-Flächen enthielt CTPG-W 39,16 % Echinacosid und 2,44 % Acteosid. Zunächst wurde die Wirkung von CTPG-W auf die Lebensfähigkeit von Eca-109-Zellen mit einem MTT-Assay bestimmt. CTPG-W wurde in DMSO zu 200 mg/ml gelöst und mit RPMI-1640-Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes FBS enthielt, auf die angegebenen Konzentrationen verdünnt. Eca-109-Zellen wurden mit CTPG-W behandelt und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit einem MTT-Assay zu den angegebenen Zeitpunkten analysiert. Die CTPG-W-Behandlung reduzierte die Lebensfähigkeit von Eca-109-Zellen dosis- und zeitabhängig signifikant (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Abbildung 4. Die Wirkung von CTPG-W auf die Zellzyklusverteilung in Eca-109-Zellen. Verschiedene Konzentrationen von CTPG-W wurden zur 24-stündigen Behandlung von Eca-109-Zellen verwendet und die Zellzyklusverteilung wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W induziert Apoptose in Eca-109-Zellen. Um zu untersuchen, ob CTPG-W das Wachstum von Eca-109-Zellen durch die Induktion von Apoptose oder Nekrose unterdrückt, wurden Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt. Nach 24 Stunden wurden Apoptose und Nekrose von Eca-109-Zellen mit Annexin V/PI-Färbung nachgewiesen. Wie in Abb. 3A dargestellt, wurden Annexin V-/PI+-Zellen als nekrotische Zellen und Annexin V+/PI+- und Annexin V+/PI--Zellen als apoptotische Zellen aktiviert. CTPG-W induzierte in erster Linie dosisabhängig die Apoptose von Eca-109-Zellen, obwohl die nekrotischen Eca-109-Zellen auch unter der Behandlung von 600 und 800 µg/ml CTPG-W signifikant anstiegen (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W induziert einen Zellzyklusstopp in der S-Phase in Eca-109-Zellen. Eine Störung des Krebszellzyklus unterdrückt das Zellwachstum und fördert die Apoptose (27). Die Verteilung des Zellzyklus in Eca-109-Zellen wurde mit PI-Färbung nach 24-stündiger CTPG-W-Behandlung nachgewiesen. Es wurde beobachtet, dass die Zellen in der S-Phase zunahmen und die Zellen in den G0/G1-Phasen einen insgesamt signifikanten Rückgang bei der CTPG-W-Behandlung zeigten (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W verringert Δψm und induziert die Freisetzung von Cytochrom c. Apoptose kann über einen mitochondrienabhängigen Weg induziert werden (28,29). Die pro- und anti-apoptotischen Mitglieder der BCL-2-Proteinfamilie spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Integrität der Mitochondrienmembran (30,31). Nach 24-stündiger CTPG-W-Behandlung wurde Δψm mittels JC-1-Färbung bestimmt. Das JC-1-Aggregat (rote Fluoreszenz in FL-2 nachgewiesen) zerfällt in Monomer (grüne Fluoreszenz in FL-1 nachgewiesen), wenn Δψm abnimmt (32). Wie in Abb. 5A dargestellt, stiegen die Häufigkeiten von FL-1+ FL-2-/+-Zellen dosisabhängig signifikant an, was darauf hinweist, dass Δψm von Eca-109-Zellen abnahm. Die Fluoreszenzänderungen in Eca-109-Zellen wurden auch mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop beobachtet (Abb. 5B). Mit steigenden CTPG-W-Konzentrationen nahm die rote Fluoreszenz ab und die grüne Fluoreszenz zu, was mit den Daten der Durchflusszytometrie übereinstimmt. Es wurde auch beobachtet, dass der Cytochrom-c-Spiegel im Cytosol deutlich erhöht war (Abb. 5C), was auf eine Verringerung von Δψm zurückzuführen ist. Dies untermauert die aus der erhöhten Anzahl von FL-1+ FL-2-/+-Zellen gezogene Schlussfolgerung, dass Δψm als Ergebnis der CTPG-W-Behandlung abnahm. Es wurde berichtet, dass JNK die Aktivierung der BCL-2-Proteinfamilie regulieren kann, was die Freisetzung von Cytochrom c (33-35) verursacht. Es wurde auch festgestellt, dass der JNK-Spiegel nach der CTPG-W-Behandlung deutlich erhöht war (Abb. 5C). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CTPG-W die Apoptose von Eca-109-Zellen über einen mitochondrienabhängigen Weg induzieren kann.

Abbildung 5. Die Reduzierung von Δψm und die Hochregulierung von Cytochrom c und JNK. Eca-109-Zellen wurden 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt. (A) Δψm wurde durch JC-1-Färbung nachgewiesen und die Proben wurden durch Durchflusszytometrie analysiert. Die einzelnen Punktdiagramme zeigen die Veränderungen der JC-1-Fluoreszenz. Die Häufigkeiten der FL-1+ FL-2-/+-Zellen sind im unteren Bereich dargestellt. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Abbildung 6. Die ROS-Spiegel in Eca-109-Zellen nach CTPG-W-Behandlung und die antioxidative Aktivität von CTPG-W. (A) Eca-109-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt und die ROS-Spiegel wurden zu angegebenen Zeitpunkten mittels Durchflusszytometrie analysiert. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Die Wirkung von CTPG-W auf die intrazelluläre ROS-Erzeugung.ROS könnten Δψm reduzieren, um Apoptose auszulösen (36). Um zu untersuchen, ob CTPG-W die ROS-Produktion steigern kann, wurden Eca-109-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von CTPG-W behandelt. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt und mit DCFH-DA angefärbt. Die Produktion intrazellulärer ROS in Eca-109-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Wie in Abb. 6A dargestellt, steigerten 800 µg/ml CTPG-W die ROS-Produktion ab 2-6 h signifikant und sanken ab 12-24 h. Darüber hinaus steigerten 400 µg/ml CTPG-W die ROS-Produktion ab 12-24 h deutlich. Darüber hinaus veränderten 200 µg/ml CTPG-W die ROS-Produktion nicht wesentlich. Die dynamischen Veränderungen in der ROS-Produktion können mit der Apoptose von Eca-109-Zellen zusammenhängen. Es wurde auch festgestellt, dass CTPG-W eine Aktivität zum Abfangen freier Radikale aufweist (Abb. 6B), was möglicherweise mit der verringerten ROS-Produktion in Eca-109-Zellen, die nach 12 Stunden mit 800 µg/ml CTPG-W behandelt wurden, zusammenhängt.

Abbildung 7. Die Spiegel an gespaltenen Caspasen und gespaltenem PARP nach der CTPG-W-Behandlung. Proteine ​​wurden aus Eca-109-Zellen isoliert, die 24 Stunden lang mit CTPG-W behandelt wurden, und die Mengen an gespaltenen Caspasen und gespaltenem PARP wurden mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen. DMSO, Dimethylsulfoxid; CTPG-W, wasserlösliche Phenylethanoidglykoside vonC. tubulosa; PARP, Poly(ADP-Ribose)-Polymerase.

CTPG-W reguliert die Aktivität von Caspase-3, Caspase-7, Caspase-9 und PARP hoch. Die Freisetzung von Cytochrom c aufgrund der Δψm-Reduktion könnte die Caspase-Proteasen aktivieren, um Apoptose auszulösen (29,30,37). Nach 24-stündiger CTPG-W-Behandlung wurde die Aktivierung von Caspase -3, 7, 8, 9 und PARP durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Im Vergleich zur Kontrolle sind die Spiegel von gespaltener Caspase-9, gespaltener Caspase-7, gespaltener Caspase-3 und gespaltenem PARP, nicht jedoch die Spiegel von gespaltener Caspase{{20 }}, wurden durch CTPG-Behandlung dosisabhängig hochreguliert (Abb. 7). Diese Ergebnisse zeigten, dass CTPG-W Δψm reduzierte und die Freisetzung von Cytochrom c förderte, um Caspasen zu aktivieren, die die Apoptose von Eca-109-Zellen induzieren.

Diskussion

Herkömmliches CHM kann die Apoptose von Speiseröhrenkrebszellen über verschiedene Wege induzieren, darunter den extrinsischen Todesrezeptor und intrinsische mitochondriale und endoplasmatische Retikulum-Stresswege (29). Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass CTPG als Hauptbestandteil von C. tubulosa das Wachstum von Melanomzellen B16-F10 durch die Induktion der Apoptose über einen mitochondrienabhängigen Weg hemmt (24). In der vorliegenden Studie wurde die Antitumorwirkung von CTPG-W auf Eca-109-Zellen untersucht und festgestellt, dass CTPG-W das Wachstum von Eca-109-Zellen unterdrückte, Apoptose und Zellzyklusarrest induzierte, Δψm reduzierte, die Freisetzung von Cytochrom c erhöhte und Caspasen aktivierte. CTPG und CTPG-W können in Krebszellen Apoptose und Zellzyklusarrest induzieren. Die genauen Mechanismen sind jedoch aufgrund der unterschiedlichen Komponenten von CTPG (26,64 % Echinacosid, 10,19 % Acteoside und 1,71 % Isoacteoside) und CTPG-W (39,16 % Echinacosid und 2,44 % Acteoside) unterschiedlich. CTPG stoppte B16-F10-Zellen in den Phasen G0/G1, aber CTPG-W stoppte Eca-109-Zellen in der S-Phase (24). Die ROS-Produktion wurde durch CTPG dosisabhängig erhöht, aber eine hohe Dosis CTPG-W zeigte eine zeitabhängige Veränderung, die zu Beginn der CTPG-W-Behandlung (2-6 h) signifikant anstieg und nach 12 h im Vergleich zur Kontrolle signifikant abnahm. Ein möglicher Grund dafür ist, dass Echinacosid der Hauptbestandteil von CTPG-W ist. Mehrere Studien berichteten, dass Echinacosid die ROS-Produktion und die durch ROS induzierte Apoptose hemmen und so seine neuroprotektiven und Anti-Aging-Wirkungen entfalten kann (38-40). In der vorliegenden Studie wurde eine ähnliche Radikalfängeraktivität beobachtet. Daher wurde spekuliert, dass einige Komponenten, darunter Verbascosid, Iso-Verbascosid und Salidrosid in einer hohen Dosis CTPG-W, sofort die ROS-Erzeugung auslösen könnten, um die Apoptose von Eca-109-Zellen zu verursachen (41,42), und dann ROS durch Echi abgefangen werden.Nakosid. Ein weiterer möglicher Grund für die Unterschiede in der ROS-Produktion von CTPG und CTPG-W besteht darin, dass in dieser Studie und der vorherigen Studie unterschiedliche Zelllinien verwendet wurden (24). Dong et al. (43) berichteten, dass Echinacosid die Apoptose menschlicher SW480-Darmkrebszellen durch die Erzeugung oxidativer DNA-Schäden ohne erhöhte ROS-Werte induzieren könnte.

Die CTPG-W-Behandlung reduzierte Δψm und verursachte die Freisetzung von Cytochrom c, das die Spaltung von Caspase-9 fördert (28). Konsequenterweise wurden die Spiegel der gespaltenen Caspase-9 durch die CTPG-W-Behandlung hochreguliert. Anschließend kann die aktive Caspase-9 Caspase-3 aktivieren, um Apoptose auszulösen (44). Die Spiegel der gespaltenen Caspase -3 wurden durch die CTPG-W-Behandlung ebenfalls hochreguliert. Allerdings wurde Caspase-8 durch CTPG-W nicht aktiviert, was darauf hindeutet, dass der extrinsische Todesrezeptorweg nicht an der durch CTPG-W induzierten Apoptose beteiligt war. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass CTPG-W die Apoptose von Eca-109-Zellen durch die Aktivierung eines mitochondrienabhängigen Signalwegs induziert.

PARP spielt eine wichtige Rolle bei der genomischen Stabilität und kann durch die aktiven Caspasen, insbesondere Caspase -3 und -7, gespalten werden (45). Es wurde festgestellt, dass die CTPG-W-Behandlung Caspase -3 und -7 aktiviert, die PARP spalten können, um die DNA-Reparatur zu hemmen und Apoptose zu verursachen.

CTPG-W unterdrückt außerdem dosis- und zeitabhängig das Wachstum menschlicher hepatozellulärer Karzinom-BEL-7404-Zellen (unveröffentlichte Daten). Obwohl CTPG-W das Wachstum von Eca-109- und BEL-7404-Zellen hemmt, fördert es die Proliferation von Splenozyten, was möglicherweise auf den Gehalt an Polysacchariden (~50 %) in CTPG-W zurückzuführen ist (46). ). In ähnlicher Weise wurde in mehreren Studien berichtet, dass Polysaccharide die Proliferation von Splenozyten fördern können (46-49). Im Mausmodell wurde festgestellt, dass CTPG-W den Milzindex im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöhte, jedoch keinen Einfluss auf das Körpergewicht und die anderen Organindizes einschließlich Herz, Leber, Niere und Lunge hatte (unveröffentlichte Daten). Dies weist darauf hin, dass CTPG-W keine zytotoxische Wirkung auf normale Zellen hat.

Zusammengefasst deuten die Daten darauf hin, dass CTPG-W das Wachstum von Eca-109-Zellen durch die Induktion von Apoptose über einen mitochondrienabhängigen Weg hemmt

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER SEXUELLEN FUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %