Cistanche Deserticola-Extrakt erhöht die Knochenbildung in Osteoblasten--Teil I
Mar 15, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Te-Mao Liaet a
Abstrakt
Ziele Wir untersuchten die Wirkung vonCistancheDeserticolaMa. (CD) anKnochenFormationdurch gezüchtete Osteoblasten. Methoden Der mineralisierte Knollenbildungstest wurde verwendet, um die In-vitro-Effekte von CD zu untersuchen(CistancheDeserticola)anKnochenFormation. Die mRNA-Expression von alkalischer Phosphatase (ALP), knochenmorphogenetischen Proteinen (BMP)-2 und Osteopontin (OPN) wurde durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion analysiert. Der Wirkungsmechanismus von CD(CistancheDeserticola)Extrakt wurde mittels Western Blotting untersucht. Die in-vivo anti-osteoporotische Wirkung von CD(CistancheDeserticola)Extrakt wurde in ovarektomierten Mäusen untersucht.
Wichtige Erkenntnisse
CD(CistancheDeserticola)Extrakt hatte keine Wirkung auf die Proliferation, Migration oder Wundheilung von kultivierten Osteoblasten, erhöhte jedoch die ALP-, BMP-2- und OPN-mRNA und die Knochenmineralisierung. Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) oder Nuklearfaktor (NF)-kB-Inhibitoren reduzierten CD(CistancheDeserticola)Extrakt-induziertKnochenbildungund ALP-, BMP-2- und OPN-Ausdruck. Allerdings CD(CistancheDeserticola)Der Extrakt beeinflusste die Osteoklastogenese nicht. Außerdem CD(CistancheDeserticola)Extrakt verhinderte den durch Ovariektomie in vivo induzierten Knochenverlust.
Schlussfolgerungen
CD(CistancheDeserticola)kann ein Roman seinKnochenbildungMittel zur Behandlung von Osteoporose.
SchlüsselwörterKnochenbildung; CistancheDeserticola; chinesisches Kraut; Osteoblasten
Cistanche Deserticolaist gut fürKnochenbildung
Einführung
Knochen ist ein komplexes Gewebe, das aus mehreren Zelltypen besteht, die einem kontinuierlichen Erneuerungs- und Reparaturprozess unterliegen, der als „Knochenumbau“ bezeichnet wird. Zwei Hauptzelltypen, die für den Knochenumbau verantwortlich sind, sind Osteoklasten, die Knochen resorbieren, und Osteoblasten, die neuen Knochen bilden. Der Knochenumbau wird durch mehrere systemische Hormone (z. B. Parathormon, 1, 25- Dihydroxyvitamin D3, Sexualhormone und Calcitonin) und lokale Faktoren (z. B. Stickoxid, Prostaglandine, Wachstumsfaktoren und Zytokine) reguliert.[1] Osteoporose entsteht, wenn Resorption und Bildung von Knochen unkoordiniert sind und ein übermäßiger Knochenabbau den Knochenaufbau übersteigt.[2] Aktuelle Behandlungen für Osteoporose umfassen Bisphosphonate, Calcitonin und Östrogen, die Knochenresorptionshemmer sind, die die Knochenmasse erhalten, indem sie die Osteoklastenaktivität hemmen.[3] Allerdings ist die Wirkung dieser Medikamente bei der Erhöhung oder Wiederherstellung der Knochenmasse relativ gering, sicherlich nicht mehr als 2 Prozent pro Jahr.[3] Es besteht daher ein Bedarf an knochenaufbauenden Wirkstoffen wie Teriparatid, die neue stimulierenKnochenFormationund die für etablierte Osteoporose charakteristische Veränderung der trabekulären Mikroarchitektur korrigieren.[4,5] Weil neuKnochenFormationprimär eine Funktion der Osteoblasten ist, können Wirkstoffe, die entweder die Proliferation von Zellen der osteoblastischen Abstammungslinie erhöhen oder die Differenzierung der Osteoblasten induzieren, die Knochenbildung verbessern.[5,6]
Obwohl die Mechanismen der Osteoporose unklar bleiben, hängen sie wahrscheinlich mit der verringerten Verfügbarkeit oder Wirkung von Knochenwachstumsfaktoren wie knochenmorphogenetischen Proteinen (BMPs) zusammen.[7] BMPs, die strukturell mit der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors b verwandt sind, wurden ursprünglich durch ihre Fähigkeit identifiziert, Eileiterbildung zu induzierenKnochen Formationbei Nagetieren.[8] BMPs spielen dabei eine wichtige RolleKnochenFormationund Knochenzelldifferenzierung durch Stimulierung der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) sowie der Synthese von Proteoglykan, Kollagen und Osteopontin (OPN).[9] Eine kürzlich durchgeführte Studie fand eine Verbindung zwischen Osteoporose und spezifischen Polymorphismen in den BMP-2-, ALP- und OPN-Genen, was darauf hindeutet, dass sie mit der Entwicklung von Osteoporose assoziiert sind.[10]
CistancheDeserticolaMa. (Orobanchaceae; abgekürzt als CD)(CistancheDeserticola)ist ein einheimisches Kraut in China und wird in der traditionellen Medizin aufgrund seiner beruhigenden, schmerzlindernden und immunstimulierenden Eigenschaften als therapeutisches Mittel verwendet.[11] Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass CD(CistancheDeserticola)Extrakte können die Immunität stimulieren,[12] freie Radikale abfangen[13] und die Aktivität der Superoxiddismutase erhöhen.[14] Entzündungshemmende und antioxidative Wirkstoffe haben das Potenzial, Osteoporose zu behandeln, indem sie ansteigenKnochen Formationund/oder Unterdrückung der Knochenresorption.[15,16] Die Wirkung von CD(CistancheDeserticola)auf die Knochenzellfunktion wurde noch nicht bestimmt. Hier berichten wir über diese CD(CistancheDeserticola)Extrakt beeinflusste nicht die Proliferation, Migration oder Wundheilungsaktivität von kultivierten Osteoblasten, erhöhte jedoch die ALP-, BMP-2- und OPN-Expression und die Knochenmineralisierung. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Signalwege der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) und des Nuklearfaktors (NF)-kB an der CD-vermittelten Erhöhung der Genexpression und Knochenmineralisierung beteiligt sein können. Im Gegensatz dazu die CD(CistancheDeserticola)Extrakt unterdrückte die Osteoklastogenese in vitro nicht. Insbesondere die Behandlung von Mäusen mit CD(CistancheDeserticola)Extrakt verhinderte den durch Ovarektomie induzierten Knochenverlust in vivo. Unsere Daten legen daher nahe, dass CD(CistancheDeserticola)kann zur Stimulierung verwendet werdenKnochenFormationzur Behandlung von Osteoporose.
Cistanche DeserticolaStärkung der Immunität
Materialen und Methoden
Cistanche Deserticola-Extrakt und -Materialien
CD(CistancheDeserticola)Der Extrakt wurde von Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan) gekauft. Extraktion und Isolierung von CD(CistancheDeserticola)wurden wie zuvor beschrieben verfolgt (auf der Basis von Spektraldaten haben sie die chemische Zusammensetzung einschließlich Beta-Sitosterol, Daucosterin, Bernsteinsäure, Triacontanol, Acteosid, Betain und Polysaccharid identifiziert).[17] Polyklonale Kaninchen-Antikörper, die für p-extrazelluläre Signal-regulierte Kinasen (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminale Kinasen (JNK), JNK, p-p65 und p65 spezifisch sind, wurden von Santa Cruz Biotechnology erworben ( Santa Cruz, USA). Das Osteocalcin-ELISA-Kit wurde von Biosource Technology (Nivelles, Belgien) bezogen. Die C-terminalen Telopeptide des Typ-I-Kollagen-ELISA-Kits wurden von Cross Laps (Herlev, Dänemark) bezogen. Die dominant-negative p38-Mutante wurde von Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA) bereitgestellt. Die dominant-negative JNK-Mutante wurde von Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA) bereitgestellt. Die dominant-negative ERK2-Mutante wurde von Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center) bereitgestellt. Alle anderen Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) bezogen.
Zellkultur
Die murine Osteoblastenzelllinie MC3T3-E1 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA) bezogen. Die Zellen wurden in 95 % Luft, 5 % CO2 mit a-MEM kultiviert, das mit 20 mm HEPES und 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mm Glutamin, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 mg) ergänzt war /ml).
Messung der mineralisierten Knollenbildung
Die mineralisierte Knollenbildung wurde wie beschrieben bewertet.[18] Kurz gesagt, Osteoblasten wurden zwei Wochen lang in einem Medium kultiviert, das Vitamin C (50 mg/ml) und b-Glycerophosphat (10 mm) enthielt, und das Medium wurde alle drei Tage gewechselt. Nach Inkubation mit CD(CistancheDeserticola)Extrakt für 12 Tage, die Zellen wurden zweimal mit 20 mm Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, die 0,15 m NaCl (pH 7,4) enthielt, in eiskaltem 75-prozentigem (v/v) Ethanol für 30 min fixiert und luft- getrocknet. Die Calciumablagerung wurde unter Verwendung von Alizarinrot-S-Färbung bestimmt. Kurz gesagt, Ethanol-fixierte Zellen und Matrix wurden für 1 h mit 40 mm Alizarinrot-S (pH 4,2) gefärbt und ausgiebig mit Wasser gespült. Der gebundene Farbstoff wurde mit 10 Prozent (w/v) Cetylpyridiniumchlorid eluiert und Alizarinrot-S in den Proben wurde durch Messung der Extinktion bei 550 nm quantifiziert und mit einer Standardkurve verglichen. Ein Mol Alizarinrot-S bindet selektiv etwa zwei Mol Calcium.
Cistanche Deserticolaist gut fürKnochenbildung
Quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit
Gesamt-RNA wurde aus Osteoblasten unter Verwendung eines TRIzol-Kits (MDBio Inc., Taipei, Taiwan) extrahiert. Reverse Transkription wurde unter Verwendung von 2 mg Gesamt-RNA und einem Oligo(dT)-Primer durchgeführt.[19,20] Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurde unter Verwendung von TaqMan® One-Step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Gesamt-cDNA wurde hinzugefügt (100 ng pro 25- ml Reaktion) mit sequenzspezifischen Primern und Taqman®-Sonden. Alle Zielgen-Primer und -Sonden wurden im Handel erworben, einschließlich b-Aktin als interne Kontrolle (Applied Biosystems). qPCR-Assays wurden dreifach auf einem StepOnePlus-Sequenznachweissystem (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren 10- min Polymerase-Aktivierung bei 95 Grad, gefolgt von 40 Zyklen von 95 Grad für 15 s und 60 Grad für 60 s. Der Schwellenwert wurde oberhalb des Kontrollhintergrunds ohne Matrize und innerhalb der linearen Phase der Zielgenamplifikation eingestellt, um die Zykluszahl zu berechnen, bei der das Transkript nachgewiesen wurde (als CT bezeichnet).
Western-Blot-Analyse
Zelllysate wurden wie zuvor beschrieben präpariert.[21,22] Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Immobilon-Polyvinyldifluoridmembranen (Millipore, Billerica, USA) übertragen. Die Blots wurden mit 4 % Rinderserumalbumin für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und dann mit Kaninchen-Anti-Mensch-Antikörpern gegen p-65 oder p-p65 (1: 1000) für 1 Stunde bei Raumtemperatur sondiert. Nach drei Waschgängen wurden die Blots mit Peroxidase-konjugiertem Esel-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:1000) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blots wurden durch verstärkte Chemilumineszenz unter Verwendung von X-OMAT LS-Film (Eastman Kodak, Rochester, USA) sichtbar gemacht.
Ovariektomie-induzierte Osteoporose
Weibliche ICR-Mäuse, vier Wochen alt, 22–28 g, wurden für diese Studie verwendet. Mäuse wurden bilateral unter Trichloracetaldehyd-Anästhesie (100 mg/kg) ovarektomiert und Kontrollmäuse wurden zum Vergleich scheinoperiert (Sham). Die Knochenmineraldichte und der Knochenmineralgehalt wurden nach oraler Verabreichung verschiedener CD-Konzentrationen gemessen(CistancheDeserticola)vier Wochen lang alle zwei Tage extrahieren. Die Gesamtkörper-Knochenmineraldichte und der Knochenmineralgehalt wurden mit einem Dualenergie-Röntgenabsorptiometer (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) unter Verwendung eines Modus für kleine Probanden, wie zuvor beschrieben, bestimmt.[18, 23] Alle Protokolle entsprachen den institutionellen Richtlinien und wurden vom Animal Care Committee der China Medical University genehmigt.
statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde mit der Software Prism 4.01 durchgeführt. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Die angegebenen Werte sind SEM-Mittelwerte. Die statistische Analyse zwischen zwei Proben wurde unter Verwendung des Student-t-Tests durchgeführt. Statistische Vergleiche von mehr als zwei Gruppen wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse mit dem Post-hoc-Test von Bonferroni durchgeführt. In allen Fällen wurde P < 0,05="" als="" signifikant="">
Cistanche Deserticolaist gut fürKnochenbildung
Ergebnisse
Cistanche DeserticolaExtrakt erhöht die Knochenmineralisierung durch Osteoblasten Zugabe von CD(CistancheDeserticola)Extrakt für 24 oder 48 h beeinflusste die Proliferation von Maus-Osteoblasten-MC3T3-E1-Zellen in einem MTT-Assay nicht (Daten nicht gezeigt). Da die Differenzierung von Osteoblasten ein komplexer Prozess ist, der Zellproliferation und -migration umfasst, haben wir auch die Migrationsfähigkeit von MC3T3-E1-Zellen nach der Behandlung mit CD getestet(CistancheDeserticola)Extrakt. Unter Verwendung von Transwell- und Wundheilungsassays fanden wir diese CD(CistancheDeserticola)Extrakt beeinflusste die Osteoblastenmigration nicht (Daten nicht gezeigt). Die Bildung mineralisierter Knötchen ist einer der Marker für die Reifung von Osteoblasten. Alizarinrot-S-Färbung zeigte, dass sich mineralisierte Knötchen bildeten, wenn Osteoblasten zwei Wochen lang in einem Medium kultiviert wurden, das Vitamin C (50 &mgr;g/ml) und &bgr;-Glycerophosphat (10 mm) enthielt, und zwar konzentrationsabhängig durch die Zugabe von CD(CistancheDeserticola)(Abbildung 1a). Daher CD(CistancheDeserticola)extraktinduzierte Knochenknötchenbildung durch kultivierte Osteoblasten, aber nicht deren Proliferation oder Migration. Wir haben auch die Rolle von CD untersucht(CistancheDeserticola)Extrakt bei RANKL-induzierter Osteoklastogenese, fand aber keine Wirkung (Daten nicht gezeigt).
Cistanche Deserticola-Extrakt erhöht die alkalische Phosphatase, das knochenmorphogenetische Protein -2 und die Osteopontin-Expression in kultivierten Osteoblasten
Differenzierte Osteoblasten zeigen eine erhöhte ALP-Aktivität, die mit einer hohen Enzymexpression korreliert.[18] Wir fanden diese Behandlung mit CD(CistancheDeserticola)Extrakt für 72 h erhöhte signifikant die Osteoblasten-ALP-Aktivität (Abbildung 1b). Angesichts der entscheidenden Rolle von BMP-2, ALP und OPN bei der Differenzierung von Osteoblasten haben wir getestet, ob CD(CistancheDeserticola)Extrakt übt seine Wirkung auf die Differenzierung von Osteoblasten aus, indem es die BMP-2-, ALP- und OPN-Expression reguliert. Behandlung von Zellen mit CD(CistancheDeserticola)extrahiert eine erhöhte mRNA-Expression von ALP, BMP-2 und OPN in einer konzentrationsabhängigen Weise (Abbildung 1c), was diese CD zeigt(CistancheDeserticola)extrahieren induzierte Differenzierung von Osteoblasten durch Heraufregulieren der ALP-, BMP-2- und OPN-Expression.
Cistanche Deserticola-Extrakt erhöht die Bildung von Knochenknötchen durch den mitogenaktivierten Proteinkinase-Weg
Es wurde berichtet, dass MAPK dabei eine wichtige Rolle spieltKnochenFormation[24,25], also untersuchten wir als nächstes, ob dieser Signalweg an CD beteiligt ist(CistancheDeserticola)extraktinduzierte Knochenmineralisierung. Vorbehandlung von Zellen mit ERK-Inhibitor U0126, p38-Inhibitor SB203580 oder JNK-Inhibitor SP600125 reduzierte CD(CistancheDeserticola)Extrakt-erhöhte Knochenmineralisierung (Abbildungen 2a, 3a und 4a). Darüber hinaus blockierten die Inhibitoren auch CD(CistancheDeserticola)Extrakt-induzierte ALP-, BMP-2- und OPN-Expression (Abbildungen 2b–4c). Die Transfektion von Zellen mit ERK2-, p38- oder JNK-Mutanten reduzierte CD(CistancheDeserticola)Extrakt-Erhöhung der ALP-, BMP-2- und OPN-mRNA-Expression (Abbildungen 2c, 3c und 4c). Als nächstes untersuchten wir direkt die ERK-, p38- und JNK-Aktivierung nach CD(CistancheDeserticola)Behandlung extrahieren. Inkubation von Zellen mit CD(CistancheDeserticola)Extrakt induzierte ERK-, p38- und JNK-Phosphorylierung (Abbildungen 2d, 3d und 4d). Daher vermitteln ERK, p38 und JNK die ErhöhungKnochenFormationdurch CD ausgelöst(CistancheDeserticola)Behandlung von Osteoblasten.
Cistanche-Deserticola-Extrakt erhöht die Bildung von Knochenknötchen über den Nuklearfaktor-kB-Weg
Wie bereits erwähnt, ist eine NF-kB-Aktivierung erforderlichKnochenFormation[26,27] Als nächstes behandelten wir Osteoblasten mit den NF-kB-Inhibitoren Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC) und N-Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK), die von Calbiochem (Darmstadt, Deutschland) bezogen wurden, um zu bestimmen, ob eine NF-kB-Aktivierung vorliegt an CD beteiligt(CistancheDeserticola)extraktinduzierte Knochenmineralisierung. 5a zeigt, dass die Vorbehandlung von Osteoblasten mit PDTC oder TPCK CD hemmte(CistancheDeserticola)Extrakt-induzierte Knochenknötchenbildung und reduzierte auch den Anstieg der ALP-, BMP-2- und OPN-Expression (Abbildungen 5b und 5c). Die Phosphorylierung der NF-kB-p65-Untereinheit ist ein Indikator für die NF-kB-Aktivierung;[28] im Einklang damit fanden wir, dass CD(CistancheDeserticola)extrahieren erhöhte p65-Phosphorylierung in den Osteoblasten (Abbildung 5d). Diese Ergebnisse zeigten, dass die NF-kB-Aktivierung für die CD-Extrakt-induzierte ALP-, BMP-2- und OPN-Expression und die Bildung von Knochenknötchen wichtig ist.
Abbildung 4 Beteiligung von c-Jun N-terminalen Kinasen (JNK) inCistancheDeserticola(CD) Extrakt-induzierte Knochenmineralisierung in Osteoblasten. (a) Die Zellen wurden in Platten mit 24- Vertiefungen ausplattiert und zwei Wochen lang in einem Medium kultiviert, das Vitamin C (50 mg/ml) und b-Glycerophosphat (10 mM) enthielt. Die Zellen wurden gleichzeitig mit CD behandelt(CistancheDeserticola)Extrakt (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). Die mineralisierte Knötchenbildung wurde durch Alizarinrot-S-Färbung (n=5) bewertet. (b, c) Zellen wurden mit SP600125 für 30 min vorbehandelt oder mit JNK-Mutante oder 24 h transfiziert, gefolgt von Stimulation mit CD-Extrakt und alkalischer Phosphatase (ALP)-Aktivität und ALP, knochenmorphogenetischem Protein (BMP)-2 und Die mRNA-Expression von Osteopontin (OPN) wurde mit dem ALP-Kit und der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion gemessen. (d) Die Zellen wurden für die angegebenen Zeitintervalle mit CD-Extrakt behandelt, und die p-JNK-Expression wurde durch Western-Blotting untersucht. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(CistancheDeserticola)extraktbehandelte Gruppe.
Hemmung des Knochenverlusts durch Cistanche-Deserticola-Extrakt bei ovariektomierten Mäusen
Um die Wirkung von CD zu untersuchen(CistancheDeserticola)Extrakt auf Knochenschwund wurde Osteoporose bei weiblichen Mäusen durch Ovarektomie induziert. Wie erwartet zeigten ovariektomierte Mäuse eine verringerte Gesamtkörper-Knochenmineraldichte und einen verringerten Knochenmineralgehalt (Fig. 6a und 6b). Behandlung mit CD(CistancheDeserticola)Extrakt für vier Wochen hemmte den Verlust der Knochenmineraldichte und des Knochenmineralgehalts dosisabhängig (Abbildung 6a und 6b). Blutkonzentrationen von ALP können die osteoblastische Aktivität widerspiegeln.[29] Wie in Abbildung 6c gezeigt, CD(CistancheDeserticola)Extrakt hemmte die durch Ovarektomie induzierte Abnahme der Serum-ALP-Aktivität. Außerdem CD(CistancheDeserticola)Extrakt erhöhte auch den Gehalt an Osteocalcin, einem Marker fürKnochenFormationund reduzierte die Menge an C-terminalen Telopeptiden von Typ-I-Kollagen, einem Marker für Knochenresorption ( 6d und 6e ). Diese Befunde unterstützen somit die Potenz und Wirksamkeit von CD(CistancheDeserticola)Extrakt zur Verhinderung von Knochenschwund in vivo.
Abbildung 6 Hemmung der durch Ovarektomie induzierten Abnahme der Knochenmineraldichte und des KnochenmineralgehaltsCistancheDeserticola(CD) Auszug. Weibliche ICR-Mäuse wurden einer Scheinoperation unterzogen oder ihnen wurden die Eierstöcke entfernt. Ovariektomierte Mäuse wurden mit den angegebenen CD-Konzentrationen behandelt(CistancheDeserticola)Extrakt durch orale Fütterung. Die Gesamtkörper-Knochenmineraldichte (a), der Knochenmineralgehalt (b), die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) im Serum (c), das Serum-Osteocalcin (d) und die C-terminalen Telopeptide des Typ-I-Kollagens im Serum (e) wurden vier bestimmt Wochen nach der Operation. Die Daten werden als Mittelwert SE, n=8–10 Mäuse/Gruppe dargestellt. *P < 0.05,="" verglichen="" mit="" schein;="" #p="">< 0,05,="" verglichen="" mit="" der="" ovariektomierten="">
DISKUSSION
Aus: 'CistancheDeserticolaExtrakt steigtKnochenFormationin Osteoblasten' durchTe-Mao Liaet al
---© 2012 Die Autoren. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Zeitschrift für Pharmazie und Pharmakologie, 64, S. 897–907