Vergleich zweier diagnostischer Tests zum Nachweis von Serum-neutralisierenden Antikörpern gegen das Schweine-Epidemie-Diarrhoe-Virus

Abstrakt:

Die laktogene Immunität ist wichtig für den Schutz von Ferkeln vor vielen Krankheitserregern, einschließlich des porcinen epidemischen Durchfallvirus. Der zirkulierende neutralisierende Antikörperspiegel im Sauenserum kann dabei helfen, festzustellen, ob eine nachweisbare Immunantwort den Ferkeln Schutz verleihen könnte. Neutralisierende Antikörper können durch verschiedene diagnostische Tests nachgewiesen werden. In dieser Studie wurden die diagnostischen Eigenschaften von zwei neutralisierenden Antikörpertests für neutralisierende Antikörper gegen das porcine epidemische Diarrhöevirus im Serum von Jungsauen untersucht, die einer Infektion ausgesetzt waren. Vier Behandlungsgruppen, Kontrolle, nicht geimpft, vor der Belastung geimpft und nach der Belastung geimpft, bestanden aus 20 Jungsauen. Von jeder Jungsau wurden vor und nach der Belastung mit dem Schweine-Epidemie-Diarrhoe-Virus Serumproben entnommen. Die Proben wurden mittels eines Fluoreszenzfokus-Neutralisationstests und eines Hochdurchsatz-Neutralisationstests auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper untersucht. Die diagnostische Sensitivität und Spezifität für die Fluoreszenzfokus-Neutralisations- und Hochdurchsatz-Neutralisationstests für diese Studie wurden bei einem Grenzwert einer Verdünnung von 80 bzw. 80 % Fluoreszenzreduktion optimiert und zeigten eine moderate Übereinstimmung basierend auf der Kappa-Statistik. Die Fokus-Fluoreszenz-Neutralisations- und Hochdurchsatz-Neutralisationstests können verwendet werden, um den Status neutralisierender Antikörper bei Tieren oder einer Tierpopulation zu überwachen. Der Hochdurchsatz-Assay hat gegenüber dem Fokus-Fluoreszenz-Assay Vorteile, da er beim angegebenen Grenzwert eine höhere Spezifität aufweist und die Art der Ergebnisse eine bessere Unterscheidung zwischen einzelnen Ergebnissen ermöglicht.

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Schlüsselwörter: PEDV; neutralisierender Antikörper; diagnostischer Test

1. Einleitung

Das Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) ist ein Alphacoronavirus, das nach seinem Auftreten in den Vereinigten Staaten im Jahr 2013 auf dem amerikanischen Kontinent endemisch geworden ist [1–3]. Biosicherheitsmaßnahmen konzentrieren sich darauf, Krankheitserreger wie PEDV aus Schweineherden fernzuhalten, um die Auswirkungen von Krankheiten abzumildern [4]. Serologische Tests sind ein nützliches Instrument, um festzustellen, ob Schweine zuvor einem Krankheitserreger ausgesetzt und damit infiziert waren. Die Exposition kann auf natürliche Weise (z. B. Aufnahme von virusbeladenem Material) oder absichtlich (z. B. Vermischung mit ausscheidenden Sämlingstieren, Mund-Nasen-Inokulation oder Magenspülung) erfolgen. Für die Zwecke dieser Studie wurde die Exposition durch absichtliche Belastung mit einem PEDV-positiven Gewebehomogenat aus einem bestätigten klinischen PEDV-Ausbruch erreicht. Lied et al. [5] zeigten, dass sich die Titer neutralisierender Antikörper im Serum zwischen Sauen, denen ein oraler oder intramuskulärer Vero-Zell-abgeschwächter PEDV-DR13-Impfstoff verabreicht wurde, nicht unterschieden. Diese Studie zeigte auch, dass oral geimpfte Sauen im Vergleich zur intramuskulären Impfung eine geringere Ferkelsterblichkeit aufwiesen. Darüber hinaus haben de Arriba et al. [6] zeigten eine Korrelation zwischen IgA- und IgG-Antikörper-sekretierenden Zellen (ASC) im Blut und darmassoziierten Lymphgewebe. Die diffuse, epitheliochoriale Plazenta von Sauen verhindert, dass Immunzellen und Antikörper in der Gebärmutter auf Ferkel übertragen werden, wodurch Schweine bei der Geburt agammaglobulinämisch werden [7]. Die mütterliche Immunität wird über Milchsekrete von der Sau auf ihre Ferkel übertragen und spielt eine entscheidende Rolle beim Schutz vor Darmpathogenen wie PEDV, TGEV und Rotavirus. Daher sind Ferkel zum Schutz vor diesen Krankheitserregern auf Kolostrum und Milchantikörper angewiesen. Serum-Immunglobuline tragen maßgeblich zum Kolostrum bei, wohingegen Immunglobuline in der Milch in der Brustdrüse produziert werden [8]. Daher können neutralisierende Antikörpertests dabei helfen, festzustellen, ob eine nachweisbare Immunantwort in Sauenseren vor der Geburt den Ferkeln Schutz verleihen könnte. Zu den Mechanismen neutralisierender Antikörper gehören Aggregation, Hemmung des Viruseintritts in die Zielzelle und Hemmung der Virusreplikation innerhalb der Zielzelle [9]. Es wurden diagnostische Tests zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen PEDV entwickelt, darunter Virusneutralisation (VN), Fluoreszenzfokusneutralisation (FFN) und Hochdurchsatz-Neutralisationstest (HTNT) [2,10–13]. Wie von Sarmento et al. [2] stellt der FFN-Assay eine Verbesserung gegenüber dem VN-Assay dar, da der Assay empfindlicher ist, da der Assay auf dem Nachweis viraler Antigene basiert, die auf der Oberfläche infizierter Vero-Zellen exprimiert werden, während der VN-Assay auf der verursachten zytopathischen Wirkung basiert durch das Virus. Darüber hinaus können FFN-Ergebnisse schneller erhalten werden als VN-Ergebnisse, da die Beobachtung des zytopathischen Effekts im Vergleich zur Virusanheftung mit dem FFN länger dauert. Der HTNT-Assay stellt eine weitere Verbesserung gegenüber dem FFN-Assay dar, da der HTNT-Assay zur Gewinnung der Ergebnisse auf digitaler Bildzytometrie und nicht auf technischer Interpretation beruht. Dies ermöglicht das Ablesen einer ganzen Platte in weniger als 3 Minuten, eine quantitative Messung der Fluoreszenzintensität und die Möglichkeit, Bilder zur Überprüfung zu speichern. Somit schien das HTNT für den Einsatz in kommerziellen Schweineherden geeignet zu sein. In der vorliegenden Studie wurden die diagnostischen Eigenschaften (Sensitivität und Spezifität) sowie positive und negative Vorhersagewerte zweier neutralisierender Antikörpertests für PEDV-, FFN- und HTNT-Tests verglichen. Dies baut auf der Arbeit von Sarmento et al. auf. [2] durch Tests naiver, infizierter und geimpfter Tiere, um die Validierung des Tests für die Verwendung in einem Hochdurchsatz-Diagnoselabor zu unterstützen. Basierend auf den Ergebnissen von Sarmento et al. [2] lautet unsere Nullhypothese, dass es keinen Unterschied in den diagnostischen Eigenschaften der beiden Tests zum Nachweis neutralisierender PEDV-Antikörper im Serum von PEDV-infizierten Jungsauen gibt.

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2. Materialien und Methoden

2.1. Quellen und Auswahl von Schweinen

Wie bereits von Brown et al. [14] verwendete diese Studie 4 Behandlungsgruppen, die als Kontrolle, NV (nicht geimpft), Pre (geimpft vor der Herausforderung) und Post (geimpft nach der Herausforderung) bezeichnet wurden. Jede Gruppe bestand ursprünglich aus 20 kommerziellen, gekreuzten Jungsauen. Insgesamt wurden 60 Jungsauen praktischerweise von einem kommerziellen Schweinebetrieb in Zentral-Iowa ausgewählt, der in der Vergangenheit keine PEDV-Erkrankung aufwies. Die 20 Jungsauen der Kontrollgruppe wurden für die NV-Gruppe wiederverwendet. Die NV-Gruppe bestand nur aus 18 Schweinen, da zwei Jungsauen aufgrund von Komplikationen, die nichts mit der PEDV-Provokation zu tun hatten, aus der Studie ausgeschlossen wurden.

Als weiteren Beweis für den PEDV-negativen Status wurden 12 ml Blut über eine Halsvenenpunktion mit einem 16-Gauge, einer 1,{3}}-Zoll-Nadel und einer 12-ml-Spritze entnommen. Serum wurde aus Blutproben durch 8-minütige Zentrifugation bei 1.500 × g gewonnen, in 1-ml-Aliquots aufgeteilt und bei –80 °C gelagert. Serumproben wurden mit einem wv-ELISA am Veterinärdiagnostischen Labor der Iowa State University (ISU-VDL, Ames, IA, USA) getestet [15].

2.2. Zuordnung der Tiere zu Behandlungsgruppen

Die sechzig Jungsauen wurden gleichmäßig in drei Gruppen aufgeteilt, die jeweils aus 20 kommerziellen Kreuzungsweibchen bestanden. Um vier Behandlungsgruppen zu bilden, wurden 20 Jungsauen nacheinander für zwei der Behandlungsgruppen, CONTROL und NV, verwendet. Die Wiederverwendung der 20 Jungsauen ermöglichte die Entwicklung und Kontrolle einer Gruppe PEDV-positiver Jungsauen, die PEDV ausgesetzt waren, und reduzierte die Gesamtzahl der in der Studie verwendeten Tiere. Die restlichen 40 Jungsauen umfassten die PRE- und POST-Gruppen mit 20 Jungsauen in jeder Gruppe. Der zeitliche Verlauf der Ereignisse nach Behandlungsgruppe ist in Brown et al. beschrieben. [14]. Kurz gesagt, wurden nach der Belastung einmal wöchentlich in jeder Behandlungsgruppe individuelle Blutproben entnommen. Weitere Ausarbeitungen werden in den Abschnitten 2.4 und 2.5 besprochen. Die Jungsauen der Behandlungsgruppe „PRE“ wurden vor der Ankunft in der externen Einrichtung geimpft. Die Jungsauen der Behandlungsgruppe „POST“ wurden erst nach der Provokation geimpft.

2.3. Unterbringung und Pflege von Schweinen

Bei der Ankunft in der Forschungseinrichtung wurden die Jungsauen in einer Behandlungsgruppe untergebracht: Alle 20 Jungsauen einer Behandlungsgruppe befanden sich in einem Stall mit Ad-libitum-Futter und Wasser. Alle Stifte befanden sich im selben Raum. Zwischen den NV PRE- und POST-Gruppen wurde ein Stift leer gelassen, um eine Kontamination zu minimieren. Futter, Wasser, Raumtemperatur-Höchst- und -Tiefstwerte sowie Höchst- und Tiefstwerte der Luftfeuchtigkeit wurden überwacht, um die Übereinstimmung mit den Produktionsstandards sicherzustellen. Einmal täglich wurden Gesundheitsbeobachtungen durchgeführt und aufgezeichnet, um Gehfähigkeit, Lethargie, Stuhlkonsistenz und andere klinische Anzeichen einer Krankheit zu beurteilen. Zur individuellen Identifizierung des Tieres wurde jeder Jungsau eine Ohrmarke (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, USA) in das rechte Ohr geklebt.

2.4. Mündliche Herausforderung

Nach einer Akklimatisierungsphase von 4-Tagen wurde jede Jungsau in der Kontrollgruppe oral PEDV ausgesetzt, wobei ein Gewebehomogenat verwendet wurde, das bei einem bestätigten klinischen PEDV-Ausbruch in einem kommerziellen Betrieb gesammelt wurde. Das Homogenat wurde vom Veterinärdiagnostischen Labor der Iowa State University sequenziert und es stellte sich heraus, dass es sich um den US-amerikanischen Prototypstamm der Genogruppe G2b handelte. Zehn Milliliter des Homogenats wurden mit 590 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gemischt und 30 ml der Mischung ironischerweise jedem Jungsauen verabreicht. Das Inokulum wurde durch Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion als PEDV-positiv bestätigt, mit einem CT-Wert von 19,6 und 14,23 × 107 genomischen Kopien pro ml und der Entwicklung von Durchfall bei den Jungsauen nach der Belastung. Einzelne Blutproben wurden alle 7 Tage nach der Belastung durch Halsvenenpunktion wie oben beschrieben bis zum 42. Tag nach der Belastung entnommen. Das Serum wurde wie oben beschrieben geerntet und gelagert und die Proben wurden zum Nachweis neutralisierender Antikörper durch einen Fokusfluoreszenz-Neutralisationstest und einen Hochdurchsatz-Virusneutralisationstest an die ISU VDL geschickt. Am 60. Tag nach der ersten Herausforderung mit CONTROL wurden die verbleibenden 40 Jungsauen in die Forschungseinrichtung gebracht und 18 der CONTROL-Jungsauen wurden NV. Zwei Jungsauen wurden aufgrund von Bedingungen, die nichts mit der Studie zu tun hatten, aus der KONTROLLE ausgeschlossen. Nach einer Akklimatisierungsphase von 3-Tagen nach der Ankunft wurden 18 Jungsauen einer erneuten Belastung (NV) und 40 Jungsauen (PRE und POST) ausgesetzt. Es wurden Blutproben entnommen, Serum entnommen und die Proben wie hier beschrieben zum Testen eingereicht .

2.5. Impfung von Jungsauen

Vierzig Jungsauen waren im Herkunftsbetrieb geblieben und wurden 8,5 Wochen nach der Ankunft von CONTROL in die Forschungseinrichtung gebracht. Zwanzig Jungsauen waren 5 und 2 Wochen vor der Herausforderung gemäß der Empfehlung des Herstellers des Impfstoffs mit einem kommerziell erhältlichen abgetöteten PEDV-Impfstoff der Genogruppe G2b (Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ) geimpft worden , USA), bestehend aus der PRE-Gruppe. Die restlichen zwanzig wurden 1 und 3 Wochen nach der PEDV-Provokation, die die POST-Gruppe umfasste, mit demselben Impfstoff geimpft. Achtzehn der ursprünglich zwanzig Kontroll-Jungsauen blieben in der Studie und bildeten die NV-Gruppe und erhielten keine Impfung gegen PEDV

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2.6. Neutralisierende Antikörpertests

2.6.1. Verfahren zur Neutralisierung des Fluoreszenzfokus (FFN).

Die FFN wurde vom Veterinärdiagnostischen Labor der Iowa State University gemäß der Standardarbeitsanweisung 9.5324 durchgeführt [16]. Kurz gesagt, Vero 76-Zellen wurden durch Spülen und Inkubieren mit Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 5 Minuten bei 37 °C hergestellt. Eine 1:20-Verdünnung von Zellen und Zellvermehrungsmedium wurde hergestellt und 200 µL in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte gegeben und 48 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden entsorgt und mit Virus-Inokulationsmedium gespült. Serumproben wurden in einem Wasserbad bei 56 °C 30 Minuten lang hitzeinaktiviert und dann in einer {{15}fachen Reihenverdünnung beginnend bei 1:10 in der Platte verdünnt. Das Stammvirus wurde auf 100–200 Herde bildende Einheiten pro 100 µL verdünnt und 100 µL in jede Vertiefung gegeben und 60 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid (CO2) inkubiert. Die Testplatte wurde entleert, gespült und 150 µL Serum/Virus-Gemisch in die entsprechenden Vertiefungen gegeben und 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Serum/Virus-Mischungen wurden verworfen und die Vertiefungen wurden mit Virus-Inokulationsmedium gewaschen. 150 µL Virus-Inokulationsmedium wurden in jede Vertiefung gegeben und 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Das Medium wurde von der Platte entfernt und die Zellen wurden durch Zugabe von 80 % Aceton, das in einem Eisbad gekühlt wurde, für 15 Minuten fixiert. Aceton wurde verworfen und die Platte wurde an der Luft getrocknet. Eine 1:100-Verdünnung des in PBS (pH 7,2) verdünnten FITC-konjugierten monoklonalen PEDV-NP-Antikörpers wurde hergestellt und 50 µL in alle Vertiefungen gegeben und 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Platte wurde mit PBS gewaschen und dann mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX51, 10X-Objektiv, FITC-Filter) abgelesen. Positive Vertiefungen zeigen keine fluoreszierenden Plaques und negative zeigen grüne Plaques. Neutralisierende Antikörpertiter wurden als höchste Serumverdünnung mit einer 90-prozentigen Reduktion der Virusreplikation im Vergleich zur Viruskontrolle ausgedrückt. Proben mit einem Titer größer oder gleich 20 wurden als positiv für PEDV-neutralisierende Antikörper eingestuft. Ein höherer Titer weist auf eine höhere Konzentration neutralisierender Antikörper in der Probe hin. Ein Beispiel für positive und negative Serumproben finden Sie in den ergänzenden Materialien.

2.6.2. Verfahren zum Hochdurchsatz-Fluoreszenzneutralisationstest (HTNT).

Die HTNT wurde vom Veterinärdiagnostischen Labor der Iowa State University, Standardarbeitsanweisung 9.5324 Version 2, durchgeführt [17]. Serumproben wurden 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 56 °C hitzeinaktiviert. Der Virusstamm wurde in Virus-Inokulationsmedium (DMEM mit 2 µg/ml Trypsin-TPCK) seriell um das 10-fache verdünnt, auf Vero 81-Zellen (ATTC® CCL-81™) übertragen und bei 37 °C inkubiert mit 5 % CO2 für 5 Tage. Die letzte Verdünnung, bei der eine zytopathische Wirkung beobachtet wurde, wurde zur Bestimmung der mittleren Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) unter Verwendung der Methode von Spearman und Karber verwendet [18]. Einhundert Mikroliter Zelllösung (Zellvermehrungsmedium, Trypsin-EDTA und Vero 81-Zellen) wurden mit 100 µL Zellvermehrungsmedium (DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin) verdünnt, um eine 1:1-Verdünnung herzustellen . Ein Hämozytometer wurde verwendet, um die Verdünnung zu zählen und zu berechnen, um 5 × 104 Zellen/Vertiefung zu ergeben, und zu jeder Vertiefung einer schwarzen 96-Vertiefungsplatte mit klarem Boden (Coring 96 Well CellBind-Mikroplatte, Sigma) zuzugeben und 48 Stunden lang bei zu inkubieren 37 ◦C mit 5 % CO2, um eine Zellkonfluenz (100 % Konfluenz) zu erreichen. Jede Platte verfügte über Vertiefungen für Positivkontrolle, Negativkontrolle und Viruskontrolle. Dann wurden fünf Mikroliter hitzeinaktivierter Kontrollen und Proben in doppelte Vertiefungen gegeben, um eine 1:40-Verdünnung zu erreichen, indem zunächst 1:20 durch Zugabe von 95 µL Virus-Inokulationsmedium und dann 100 µL 1:10 verdünntes PEDV-Virus (3,16 × 105) hinzugefügt wurden TCID50/ml). Das Serum/Virus-Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Alle Zellvertiefungen der Testplatte wurden dreimal mit 150 µL Zellwaschmedium (DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin) gewaschen, und 150 µL Serum/Virus-Gemisch und Viruskontrollen wurden auf die Testplatte übertragen und 90 Minuten lang inkubiert bei 37 ◦C. Das Serum/Virus-Gemisch wurde verworfen und die Platten wurden einmal mit einem Zellwaschmedium, wie oben beschrieben, und anschließend einmal mit einem Virus-Inokulationsmedium gewaschen. In jede Vertiefung wurde Virus-Inokulationsmedium (150 µL) gegeben und 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Das Virus-Inokulationsmedium wurde verworfen und die Platte mit PBS pH 7,4 gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 4 °C, 80 % Aceton zu jeder Vertiefung fixiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Aceton entfernt und die Platte 30 Minuten lang an der Luft getrocknet. Jede Vertiefung wurde mit PBS pH 7,4 gespült. 50 µL FITC-konjugierter monoklonaler PEDV-NP-Antikörper (SD6-29-Klon, Medgene Labs), 1:100 in PBS pH 7,4 verdünnt, wurden in jede Vertiefung gegeben und 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Platte wurde viermal mit PBS pH 7,4 gewaschen, wobei die letzte Waschlösung 5 Minuten in der Platte belassen wurde, dann verworfen und durch 100 µL PBS pH 7,4 ersetzt wurde. Die Platten wurden dann mit SpectraMax i3× unter Verwendung von SoftMax Pro 6.5 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) mit einer Belichtungszeit von 30 ms und Fokuseinstellungen von 20 μm für 541 Wellenlängen gelesen. Proben mit einer Gesamtfluoreszenzreduktion (%FR) von mindestens 85 % wurden als positiv für neutralisierende Antikörper eingestuft [2]. Die Gesamtfluoreszenzreduktion wurde als 100 − ([Durchschnittliche Gesamtfluoreszenzintensität der Probe/Durchschnittliche Gesamtfluoreszenzintensität der Negativkontrolle]) × 100 berechnet. Eine höhere Gesamtfluoreszenzreduktion weist auf höhere neutralisierende Antikörperkonzentrationen in den Proben hin. Ein Beispiel für positive und negative Serumproben finden Sie in den ergänzenden Materialien.

2.7. Diagnostische Merkmale: Sensitivität und Spezifität sowie positive und negative Vorhersagewerte

Die diagnostische Sensitivität und Spezifität wurden für das HTNT unter Verwendung eines %FR-Grenzwerts von 70, 75, 80, 85 und 90 und für das FFN unter Verwendung von Probenverdünnungsgrenzwerten von 20, 40, 80 und 160 berechnet, um den optimierten Grenzwert zu bestimmen. Optimiert wurde als der Grenzwert definiert, bei dem die diagnostische Spezifität bei minimalem Verlust der diagnostischen Spezifität maximiert ist. Eine Teilmenge von 76 bekannten PEDV-negativen Proben wurde aus den ersten beiden Probenahmepunkten für die CONTROL- und POST-Gruppen ausgewählt. 36 bekannte PEDV-positive Proben wurden aus den letzten beiden Probenahmepunkten für die NV-Gruppe ausgewählt. Zur Definition positiver Proben wurde ein Cutoff-Wert von mehr als 85 verwendet, der mit der ISU VDL-Standardarbeitsanweisung für den Test übereinstimmt [17]. Die diagnostische Sensitivität wurde geschätzt, indem die Anzahl bekanntermaßen positiver Proben, die positiv getestet wurden, durch die Gesamtzahl bekannter positiver Proben dividiert wurde. Die diagnostische Spezifität wurde geschätzt, indem die Anzahl bekanntermaßen negativer Proben, die negativ getestet wurden, durch die Anzahl bekannter negativer Proben dividiert wurde. Für den Assay-Vergleich wurde der Grenzwert ausgewählt, der die diagnostische Spezifität und Sensitivität optimierte. Für die Zwecke dieser Studie wurden die diagnostische Spezifität (DSp) und Sensitivität (DSe) maximiert, wobei der absolute Wert der Differenz zwischen Sensitivitäts- und Spezifitätswerten am kleinsten ist. Der positive Vorhersagewert (PPV) wurde geschätzt, indem die Anzahl der bekanntermaßen positiven Proben, die positiv getestet wurden (TP), durch die Gesamtzahl der positiv getesteten Proben (TP plus falsch positiv [FP]) dividiert wurde. Der negative Vorhersagewert (NPV) wurde geschätzt, indem die Anzahl bekannter negativer Proben (TN), die negativ getestet wurden, durch die Gesamtzahl der Test-Negativproben (TN plus falsch negativ [FN]) dividiert wurde.

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2.8. Statistische Analyse

In dieser Studie gab es keine unbestimmten Ergebnisse oder fehlenden Daten. Alle Daten wurden mit SAS Version 9.4 (SAS Instit. Cary NC) analysiert. Es wurden 609 Beobachtungen von 6{{10}} Schweinen verwendet, die einer von 4 Gruppen angehörten. Zwei mögliche Cutoff-Werte (40 und 80) für den FFN-Assay wurden berücksichtigt und mit einem Cutoff von 85 für den HTNT verglichen. Für jeden wurde ein lineares Mixed-Effects-Modell angepasst, um den Effekt der Gruppe auf die Übereinstimmung der FFN- und HTNT-Tests mit einem schweinespezifischen Zufallseffekt zu erklären. Alle paarweisen Vergleichsanalysen der Gruppen wurden durchgeführt. Darüber hinaus wurde für zwei der drei Cutoff-Werte, die für den FFN-Assay verwendet wurden, der Kappa-Koeffizient von Cohen berechnet, um die Gesamtübereinstimmung der FFN- und HTNT-Assays zu bestimmen. Kappa-Koeffizienten wurden wie folgt interpretiert: weniger als 0.0, „schlechte“ Übereinstimmung; zwischen 0.0 und 0.20, „leichte“ Übereinstimmung; zwischen 0.21 und {{30}}.40, „faire“ Vereinbarung; zwischen 0,41 und 0,60, „mäßige“ Übereinstimmung; zwischen 0,61 und 0,80, „erhebliche“ Übereinstimmung; und zwischen 0,81 und 1,0 „nahezu perfekte“ Übereinstimmung [19]. Die Signifikanz wurde auf p kleiner oder gleich 0,05 festgelegt. Box- und Whisker-Plots wurden mit R-Software entwickelt.

3. Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt die diagnostische Sensitivität und Spezifität für die FFN- und HTNT-Tests bei den ausgewählten Grenzwerten. Die diagnostische Sensitivität und Spezifität der beiden Tests für diese Studie wurden bei einem Grenzwert einer Verdünnung von 80 bzw. 80 % FR optimiert.

Tabelle 1. Diagnostische Sensitivität (DSe), diagnostische Spezifität (DSp), positiver Vorhersagewert (PPV) und negativer Vorhersagewert (NPV) für HTNT- und FFN-Assays unter Verwendung verschiedener in der zweiten Zeile der Tabelle aufgeführter Grenzwerte. Beispielsweise beträgt für den HTNT-Assay bei einem Cutoff von 70 der DSe=0,97 (97 %), der DSP=0,91 (91 %), der PPV=0,83 ( 83 % und Kapitalwert=0,95 (95 %). U=undefiniert.

Abbildung 1 zeigt Box- und Whisker-Diagramme der HTNT-Ergebnisse nach Tagen nach der Exposition und nach Studienbehandlungsgruppe. Proben aus den Gruppen CONTROL und POST (n=76) wurden an den Tagen −4, 0 und 7 erwartungsgemäß aufgrund des vorherigen Status der Schweine als negativ eingestuft. Die NV-Gruppe entwickelte im Anschluss an die Herausforderung eine anamnestische Reaktion. Bei den HTNT-Ergebnissen kam es zu einer verringerten Variabilität, was sich in einer Verringerung des Wertebereichs in beiden geimpften Gruppen (PRE und POST) nach der Belastung mit PEDV zeigte. Diese verringerte Variation ist in Abbildung 1 zu beobachten, da die Whiskers und Ausreißer der POST- und PRE-Plots 14 Tage nach der Belastung kürzer werden. Abbildung 2 zeigt Box- und Whisker-Diagramme der natürlichen logarithmisch transformierten FFN-Ergebnisse nach Tagen nach der Exposition nach Behandlungsgruppe, die ähnliche Ergebnisse wie der HTNT-Assay liefern. Sowohl die HTNT- (Abbildung 1) als auch die FFN-Ergebnisse (Abbildung 2) zeigen eine Reaktion auf Provokation und Impfung, was sich in einem Anstieg der %FR und der Titer beider Tests zeigt. Die Variation der Ergebnisse jedes Assays war zwar in ihrer Größenordnung ähnlich, wurde jedoch nach der homologen Belastung (NV) verringert. Auch nach der Impfung (PRE und POST) kam es zu einer geringeren Variation. Diese Schwankung der neutralisierenden Antikörperwerte in der Woche nach der Exposition nimmt nach der Impfung und der homologen Belastung mit PEDV ab (Abbildungen 1 und 2). Es gab eine ähnliche Tendenz bei der Abnahme der Variation des neutralisierenden Antikörpers, die in den Ergebnissen beider Tests für geimpfte und homolog provozierte Behandlungsgruppen beobachtet wurde. Die homologe Belastung mit PEDV und Zweitimpfungen führte zu einer anamnestischen Reaktion, die einen höheren Grad an neutralisierenden Antikörpern mit geringerer Variation zwischen den Schweinen im Vergleich zu den Werten vor und nach der Impfung erzeugte, die mit beiden Tests gemessen wurden (Abbildung 1). Basierend auf der Analyse der diagnostischen Sensitivität und Spezifität wurden die Cutoffs von 80 (Titer) und 85 (%FR) ausgewählt, um die Testübereinstimmung für die FFN- bzw. HTNT-Assays zu analysieren. Der Kappa-Test zeigte eine „moderate“ Übereinstimmung von 0.5257 mit einem 95 %-Konfidenzintervall von 0.461, 0,5904 der Tests für den Cutoff 80 (Titer) und 85 (%FR) für FFN- und HTNT-Assays.

Abbildung 1. Box-and-Whisker-Diagramme der HTNT-Antikörper-Reaktionskurven nach den Tagen nach der Exposition für jede Behandlungsgruppe. Der mittlere Balken stellt den Medianwert der Ergebnisse pro Woche dar. Die Scharniere (oben und unten in der Box) stellen das erste (Q1) und dritte (Q3) Quartil dar. Der schattierte Bereich stellt den Interquartilbereich (IQR) dar. Die Whisker werden wie folgt bestimmt: Top Whisker=Q3 + 1.5∗IQR; Unterer Whisker=Q1 + 1.5∗IQR. Wenn sich kein Datenpunkt auf dem berechneten Wert befindet, ist der nächste Datenpunkt, der Q1 oder Q3 am nächsten liegt, die Grenze des Whiskers. Offene Kreise (◦) zeigen Ausreißer an. Ein Schnitt von 85 wird durch die gestrichelte Linie bei 85 auf der y-Achse angezeigt.

Abbildung 2. Box-and-Whisker-Diagramme der FFN-Antikörper-Antwortkurven nach den Tagen nach der Exposition für jede Behandlungsgruppe. Der mittlere Balken stellt den Medianwert der Ergebnisse pro Woche dar. Die Scharniere (oben und unten in der Box) stellen das erste (Q1) und dritte (Q3) Quartil dar. Der schattierte Bereich stellt den Interquartilbereich (IQR) dar. Die Whisker werden wie folgt bestimmt: Top Whisker=Q3 + 1.5∗IQR; Unterer Whisker=Q1 + 1.5∗IQR. Wenn sich kein Datenpunkt auf dem berechneten Wert befindet, ist der nächste Datenpunkt, der Q1 oder Q3 am nächsten liegt, die Grenze des Whiskers. Offene Kreise (◦) zeigen Ausreißer an. Ein Schnitt von 40 wird durch die gestrichelte Linie bei ln(40) auf der y-Achse angezeigt.

4. Diskussion

Wir gehen davon aus, dass eine verringerte Variation und eine anamnestische Reaktion mit einer homogenen Herdenimmunität und einem Schutz vor Krankheiten verbunden sind, auch wenn in der PRE-Gruppe weiterhin klinische Symptome beobachtet wurden, wie zuvor beschrieben [14]. Die klinischen Auswirkungen und die Schwere der Erkrankung bei diesen Tieren wurden für die Zwecke dieser Studie nicht bewertet. Die Krankheit manifestiert sich bei Erwachsenen und Neugeborenen unterschiedlich, mit schwerwiegenderen klinischen Symptomen und Tod bei Neugeborenen im Vergleich zu erwachsenen Tieren [1,20]. Während zirkulierende neutralisierende Antikörperspiegel allein keinen Schutz bieten [21], können sie zur Beurteilung einer Antikörperreaktion nach absichtlicher Exposition oder Impfung in Herden verwendet werden. Während das Fehlen einer Virämie charakteristisch für PEDV ist, wurde über Virämie bei Ferkeln im Alter von bis zu 4 Wochen berichtet [22,23]. Somit können zirkulierende neutralisierende Antikörper den klinischen Krankheitsverlauf beeinflussen [21]. Allerdings wäre die laktogene Immunität, insbesondere IgA in Milchsekreten, ein genaueres Maß für den Schutz von Ferkeln [21]. Die in dieser Studie beschriebenen Tests könnten zur Überwachung neutralisierender Serumantikörper nach der Impfung in Gruppen von Sauen oder Jungsauen sowie zum Sammeln von Milchsekreten zum Testen auf laktogenes/sekretorisches IgA verwendet werden. Es wäre von Vorteil, wenn die aus diesen Tests gewonnenen Daten die Menge und Stabilität der nach der Impfung erzeugten laktogenen Immunität vorhersagen könnten. Dies wurde in der vorliegenden Studie jedoch nicht analysiert. Es wurde gezeigt, dass Serum-IgG-Antikörperreaktionen nach der Impfung prädiktiv für die kolostrale IgG-Reaktion sind, es gab jedoch keine Korrelation zwischen Serum-neutralisierenden Antikörpern und denen von Brustsekreten [15]. Während es keinen Zusammenhang zwischen neutralisierenden Antikörpern im Serum und denen der Brustsekrete gab, wurde gezeigt, dass geimpfte Tiere im Vergleich zu Kontrolltieren höhere neutralisierende Antikörper in den Brustsekreten aufwiesen [15]. Daher, wie von Bjustrom-Kraft et al. [15]: Wenn die neutralisierenden Antikörper im Serum hoch sind, können auch IgG und IgA im Brustsekret erhöht sein. Daher würde die Entnahme von Serumproben vor dem Umzug der Weibchen in den Abferkelstall den Stress und die Schmerzen minimieren, die während der peripartalen Entnahme von Blut und Milchsekreten entstehen und sich negativ auf die Sau und den Wurf auswirken können [24]. Für Benutzer ist es wichtig zu verstehen, wie sich der Grenzwert auf die diagnostische Sensitivität und Spezifität eines Tests auswirken kann. Eine Erhöhung des Grenzwerts verringert die Anzahl falsch positiver Ergebnisse und erhöht die Anzahl falsch negativer Ergebnisse. Umgekehrt erhöht eine Senkung des Grenzwerts die Anzahl falsch positiver Ergebnisse und verringert die Anzahl falsch negativer Ergebnisse. Dieses Wissen ermöglicht es einem Benutzer, den Grenzwert zu wählen, der für seine spezifische Situation verwendet werden soll. Für diese Studie, basierend auf den Ergebnissen dieser Studie und früheren Ergebnissen, die von Sarmento et al. [2] wählten wir 80 % FR für das HTNT und eine Verdünnung von 80 FFN. Bei diesen Grenzwerten ist die diagnostische Spezifität für das HTNT (97 %) höher als für das FFN (76 %) und bietet einen höheren positiven Vorhersagewert für das HTNT im Vergleich zum FFN. Es muss auch verstanden werden, dass Vorhersagewerte von der Prävalenz der Krankheit abhängen [25,26]. In dieser Studie betrug die Prävalenz basierend auf den klassifizierten Proben 32,1 % (36 positive und 76 negative Proben). Mit zunehmender Prävalenz würde auch der PPV steigen, da das getestete Tier (Probe) mit größerer Wahrscheinlichkeit positiv ist; Mit abnehmender Prävalenz würde der Kapitalwert sinken. Die Abbildungen 3A und B veranschaulichen dies für die HTNT- und FFN-Tests bei den verschiedenen Grenzwerten, die in dieser Studie nach den von Erb [25] beschriebenen Methoden bewertet wurden. Daher sollte man bei der Betrachtung diagnostischer Ergebnisse die diagnostische Sensitivität und Spezifität des Tests berücksichtigen und die Prävalenz innerhalb der Gruppe verstehen, wenn Vorhersagewerte verwendet werden.

Abbildung 3. (A). Positive Vorhersagewerte für die HTNT- (schwarze Linien) und FFN-Tests (graue Linien) bei verschiedenen Grenzwerten. Für den HTNT wird kein Grenzwert von 90 angegeben. (B). Negative Vorhersagewerte oder HTNT- (schwarze Linien) und FFN-Tests (graue Linien) bei verschiedenen Grenzwerten. Für den FFN-Assay wird kein Grenzwert von 20 angegeben.

Das HTNT weist im Vergleich zum FFN eine überlegene diagnostische Sensitivität und Spezifität auf. Bei der Analyse von Antikörperergebnissen ist dies ideal, um die Anzahl falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse zu minimieren. Bei Verwendung eines Cutoff-Werts von 80 für das FFN beobachteten wir beispielsweise eine Sensitivität von 97 % und eine Spezifität von 76 %. Dies bedeutet, dass es nur wenige falsch-negative Ergebnisse, aber eine große Anzahl falsch-positiver Ergebnisse geben würde. Wenn Ergebnisse fälschlicherweise als positiv eingestuft werden, kann dies zu der Fehlinterpretation führen, dass eine Herde Antikörper gegen PEDV aufweist, obwohl dies in Wirklichkeit nicht der Fall ist. Da der HTNT über verschiedene Grenzwerte hinweg eine höhere Diagnose und Spezifität aufweist, ist er der bevorzugte Test für den Nachweis von PEDV-Antikörpern. Ergebnisse von Sarmento et al. [2] zeigten deutlich höhere diagnostische Spezifitäten für das FFN und vergleichbare Sensitivitäten und Spezifitäten für das HTNT. Diese diagnostischen Tests zeigten gemäß der Kappa-Statistik (κ) eine mäßige Übereinstimmung. Eine Schwäche von κ besteht darin, dass ein Test als Goldstandard angesehen werden muss. Beim Vergleich zweier unvollständiger Tests kann dies die Interpretation von κ verfälschen. Für diese Studie haben wir die diagnostische Leistung der Tests in Verbindung mit κ bewertet, um festzustellen, ob der Test übereinstimmt, aber möglicherweise einen unterschiedlichen Nutzen hat. Ein zusätzlicher Vorteil des HTNT gegenüber dem FFN-Assay besteht darin, dass die HTNT-Ergebnisse aus kontinuierlichen Daten im Vergleich zu den kategorialen Werten (Titrationen) des FFN berechnet werden. Die kontinuierliche Natur der HTNT-Daten ermöglicht eine bessere Unterscheidung der Probenergebnisse zur Beschreibung des neutralisierenden Antikörperstatus von Sauen. Wie von Sarmento et al. [2]: Das HTNT hat eine kürzere Lesezeit einer 96-Well-Platte auf weniger als 4 Minuten, was eine schnellere Ergebnisbereitstellung ermöglicht. Zirkulierende systemische Antikörper können zum Schutz der Ferkel vor PEDV-Infektionen beitragen [21]. Es gibt jedoch keine Literatur darüber, welche Menge an zirkulierenden neutralisierenden Antikörpern in der Sau den Ferkeln einen PEDV-Schutz verleihen würde. Hohe Konzentrationen an zirkulierenden Antikörpern führen zu höheren Konzentrationen im Kolostrum und bieten einen erhöhten Schutz. Eine weitere Untersuchung ist erforderlich, um einen Zusammenhang zwischen dem Zeitpunkt der Probenentnahme während der Schwangerschaft und dem kolostralen Antikörperschutz gegen eine PEDV-Infektion festzustellen. Die laktogene und mukosale Immunität ist für die Überlebensfähigkeit von Schweinen, die PEDV ausgesetzt sind, von entscheidender Bedeutung. Antikörper sammeln sich über die Darm-MG-sIGA-Achse in der Milch und werden an die Ferkel weitergegeben, um ihnen Schutz zu verleihen. Langel et al. [27] fanden heraus, dass Jungsauen, die im zweiten Trimester exponiert wurden, im Vergleich zu Jungsauen im ersten und dritten Trimester signifikant höhere Werte an zirkulierenden IgA-, IgG- und neutralisierenden Antikörpern aufwiesen. Darüber hinaus haben Langel et al. [27] fanden heraus, dass Ferkel von Jungsauen, die im zweiten Trimester PEDV ausgesetzt waren, eine Überlebensrate von 100 % aufwiesen, verglichen mit weniger als 87,2 % in anderen Trimestern PEDV. Obwohl Serumantikörper keinen Schutz vor PEDV bieten, deuten die Ergebnisse unserer Studie darauf hin, dass Serum-neutralisierende Antikörperspiegel mit einem Schutz vor PEDV-Infektionen verbunden sind. Wie bereits von Brown et al. [14], PEDV wird nach homologer Belastung und Impfung von Jungsauen mit dem Kot ausgeschieden. Die vorliegende Studie verwendete Proben von denselben Tieren wie Brown et al. [14]. zeigt außerdem, dass erhöhte neutralisierende Antikörper im Serum nach Exposition oder Impfung keinen Einfluss auf das Ausscheidungsmuster des Virus haben, da die Antikörperspiegel nach Exposition und Impfung anstiegen. Weitere Studien sind erforderlich, um zu bestätigen, ob die Menge des im Stuhl ausgeschiedenen Virus mit der Menge an neutralisierenden Antikörpern im Serum zusammenhängt [21].

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5. Schlussfolgerungen

Die Nullhypothese dieser Studie war, dass es keinen Unterschied in den diagnostischen Eigenschaften der beiden PEDV-neutralisierenden Antikörpertests, FFN und HTNT, gab. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Tests basierend auf der Kappa-Statistik mäßig übereinstimmen, während es Unterschiede in ihren diagnostischen Eigenschaften und Vorhersagewerten basierend auf dem Cutoff für den Test gibt. Diese Tests könnten verwendet werden, um die Impfreaktion einer Herde zu messen. Die Nichtablehnung der Nullhypothese zeigt, dass HTNT der bevorzugte Test zum Nachweis von PEDV-neutralisierenden Antikörpern im Serum ist. Nach der Impfung sowohl in der PRE- als auch in der POST-Gruppe ergab diese Studie, dass die meisten Ergebnisse positiv waren. In der PRE-Gruppe kam es nach der Herausforderung auch zu einer geringeren Variation zwischen den Ergebnissen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Schweineärzte serumneutralisierende Antikörper messen könnten, um festzustellen, ob PEDV-Impfstoffe in der Herde ordnungsgemäß verabreicht werden.

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