Umfassende Profilerstellung von Sekretomformulierungen aus fötalen und perinatalen menschlichen Fruchtwasserstammzellen Teil 1

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Abstrakt:Wir haben zuvor berichtet, dass c-KIT plus Htaman-Amnionflüssigkeitsstammzellen, die aus übrig gebliebenen Proben der routinemäßigen vorgeburtlichen Diagnose im Ⅱ Trimester (fötales hAFS) gewonnen wurden, mit einem regenerativen parakrinen Potenzial ausgestattet sind, das überlebensfördernde, antifibrotische und proliferative Wirkungen antreibt. haben können auch aus klinischen Abfallproben des III. Trimesters während geplanter Kaiserschnitte (perinatales hAFS) isoliert werden und bieten somit eine leichter zugängliche Alternative im Vergleich zu fötalem hAFS. Dennoch ist wenig über das parakrine Profil von perinatalem hAFS bekannt. Hier stellen wir eine detaillierte Charakterisierung des hAFS-Gesamtsekretoms (dh der Gesamtheit der löslichen parakrinen Faktoren, die von Zellen im konditionierten Medium freigesetzt werden, hAFS-CM) und der extrazellulären Vesikel ( hAFS-EVs) darin, aus Ⅱtrimester fötalen versus III Trimester perinatalen Zellen. Fetales und perinatales hAFS wurden charakterisiert und einer hypoxischen Präkonditionierung unterzogen, um ihr parakrines Potenzial zu erhöhen. hAFS-CM- und hAFS-EV-Formulierungen wurden auf Protein- und Chemokin-/Zytokingehalt analysiert, und die EV-Fracht wurde durch RNA-Sequenzierung weiter untersucht. Der Phänotyp von fötalem und perinatalem hAFS, zusammen mit ihren entsprechenden Sekretomformulierungen, überlappte sich; dennoch zeigte fötales hAFS im Vergleich zu perinatalen eine unreife oxidative Phosphorylierungsaktivität. Die Profilierung ihrer parakrinen Fracht ergab einige Unterschiede je nach Gestationsstadium und hypoxischer Vorkonditionierung. Beide Zellquellen lieferten Formulierungen, die mit neurotrophen, immunmodulatorischen, antifibrotischen und endothelialen stimulierenden Faktoren angereichert waren, und das unreife fötale hAFS-Sekretom war durch ein ausgeprägteres provaskulogenisches, regeneratives, pro-auflösendes und Anti-Aging-Profil definiert. Kleine RNA-Profile zeigten eine microRNA-Anreicherung sowohl in der fötalen als auch in der perinatalen hAFS-EV-Fracht mit einem stabil exprimierten pro-auflösenden Kern als molekulare Referenzsignatur. Hier bestätigen wir, dass hAFS eine attraktive Quelle für regenerative parakrine Faktoren darstellt; Die Auswahl von fötalen oder perinatalen hAFS-Sekretomformulierungen für eine zukünftige parakrine Therapie sollte unter Berücksichtigung des spezifischen klinischen Szenarios bewertet werden.

Schlüsselwörter:Fruchtwasser; Stammzellen; parakrine Wirkungen; extrazelluläre Vesikel; zellkonditioniertes Medium; Chemokin; Zytokine; Proteomik; RNA-Sequenzierung; microRNA

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1. Einleitung

Regenerative Medizin hat sich in letzter Zeit zu einem aufstrebenden Gebiet entwickelt, um mittels mehrerer Strategien eine funktionelle Wiederherstellung von verletztem Gewebe bereitzustellen. Da Tissue-Engineering-Ansätze in den letzten Jahren deutlich vorangekommen sind, hat sich gleichzeitig die Untersuchung parakriner Effekte von Stammzellen zunehmend intensiviert. Es wurde allgemein gezeigt, dass das therapeutische Potenzial transplantierter Stammzellen hauptsächlich durch ihre sekretierten löslichen Faktoren vermittelt wird, die eine proregenerative Mikroumgebung im Wirtsgewebe orchestrieren und gleichzeitig die Aktivierung endogener Mechanismen der funktionellen Wiederherstellung auslösen können [1,2]. Daher wurde das Stammzellsekretom, die Gesamtheit der zellfreigesetzten parakrinen trophischen Moleküle, sowie membrangebundene extrazelluläre Vesikel zunehmend als innovatives Therapiearzneimittel in mehreren unabhängigen präklinischen Studien vorgeschlagen, die auf kardiovaskuläre, neurologische und/oder entzündliche Erkrankungen abzielen Erkrankung. Dementsprechend können Stammzellen als biologische Fabriken für die Nutzung ihres therapeutischen Sekretoms angesehen werden, indem sie gebrauchsfertige und handelsübliche regenerative Behandlungen anbieten. Durch die Anwendung einer solchen zellbasierten, aber zellfreien Strategie können viele einschränkende Aspekte im Zusammenhang mit der kanonischen Zelltherapie überwunden werden, während gleichzeitig positive Wirkungen sichergestellt werden.was ist eine cistancheIn dieser Hinsicht wurden mesenchymale Stromazellen (MSC) ausgiebig als mutmaßliche Zellkandidaten getestet? Tatsächlich wurden MSC und Stamm-/Vorläuferzellen durch verschiedene Vorkonditionierungsstrategien verändert und/oder stimuliert, um ihre Regenerationsfähigkeit und ihr sekretorisches Potenzial zu verbessern [3,4] mit einem ausdrücklichen Interesse an der biologischen Relevanz ihrer sekretierten extrazellulären Vesikel (EVs).

EVs sind Partikel in Nanogröße, die von einer Lipiddoppelschicht begrenzt sind und von allen Zelltypen aktiv ausgeschieden werden. EVs umfassen sehr kleine (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 Nanometer); Sie fungieren als kritische biologische Übermittler der interzellulären Signalübertragung, indem sie ihre molekulare Fracht von einer Elternzelle zu einer Responder-/Zielzelle transportieren [5,6]. Da ihr besonderes parakrines Potenzial bei der Ausübung positiver Wirkungen mit ihren Ursprungszellen vergleichbar ist, haben sich Stammzellen-Elektrofahrzeuge als attraktive therapeutische Optionen in präklinischen Krankheitsmodellen wie Ischämie, Entzündung oder Verletzung herausgestellt, wie ausführlich in [{{3 }}]. Aus translationaler Sicht sind neben dem zellmodulatorischen Potenzial auch die Durchführbarkeit der Isolierung und eine erhöhte Selbsterneuerung Schlüsselaspekte der idealen Quelle für therapeutische EVs und lösliche Faktoren. In einem solchen Szenario können fötale und perinatale MSC aufgrund ihres proliferativen Potenzials und ihres entwicklungsmäßig unreifen Profils mit intermediären Merkmalen zwischen embryonalen und erwachsenen somatischen Vorläufern eine interessante Option darstellen [10,11]. Fetale MSC können aus extraembryonalen Anhängen während der Schwangerschaft als übriggebliebene Proben isoliert werden, die während des pränatalen Screenings erhalten wurden (d. h. Chorionzotten [12-14] und Fruchtwasser [15,16]) oder als perinatale Vorläufer bei der Geburt erhalten wurden. aus klinischem Abfallmaterial (dh Amnion- und Plazentamembranen [17-21], Nabelschnurkomponenten [22-24] und Fruchtwasser [25,26]).

Cistanche kann Anti-Aging

Insbesondere humane Amnionflüssigkeitsstammzellen (hAFS) wurden als vielversprechende therapeutische Strategien in der regenerativen Medizin hervorgehoben. und es wurde gezeigt, dass sie in vitro und in vivo breit multipotent sind [16,27,28], zur hämatopoetischen Linie nach einer In-utero-Transplantation beitragen [29] und sich in verletzte Organe einpflanzen, während sie immunmodulatorische Wirkungen ausüben [26,30] und aktivieren endogene reparative Reaktionen, wie umfassend in [31] beschrieben. Unser Team und andere haben ferner gezeigt, dass hAFS ein Sekretom freisetzt, das hochgradig mit bioaktiven trophischen Molekülen angereichert ist, die in der Lage sind, auf verschiedene Reparaturmechanismen abzuzielen. Es wurde berichtet, dass parakrine hAFS-Faktoren überlebensfördernde Stimuli mit dem Löschen von Entzündungen bereitstellen [32], Kardioprotektion gegen prolongierte Ischämie [33.34] und Kardiotoxizität [35] bieten und die lokale Angiogenese mit Wiedereintritt in den Kardiomyozyten-Zellzyklus stimulieren [ 34,36]. Da gezeigt wurde, dass die meisten dieser Wirkungen allein durch die hAFS-EV-Verabreichung rekapituliert werden, haben sich unabhängige Studien darauf konzentriert, ihr regeneratives Profil vor verschiedenen pathologischen Hintergründen zu analysieren, darunter Skelett- und Herzmuskelverletzungen, Nierenerkrankungen, Osteoarthritis, Osteoporose, nekrotisierende Enterokolitis und neurodegenerative Erkrankungen Modelle [34,37-44].

Während Beweise die klinische Übertragung von hAFS-EVs für die zukünftige parakrine Therapie unterstützen können, ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die meisten dieser Studien hauptsächlich das modulatorische Potenzial von fötalem hAFS untersucht haben, das während des pränatalen Screenings im Ⅱ Trimester tatsächlich ein vollständiges Profil des Sekretoms von erhalten wurde das perinatale Gegenstück (dh Kaiserschnitte im III. Trimenon) wurde noch nicht im Detail untersucht. Perinatales hAFS im 3. Trimenon hat im Vergleich zu denen im 1. und 2. Trimenon unterschiedliche immunregulatorische Eigenschaften gezeigt [26], während das relevante endotheliale regenerative Potenzial erhalten bleibt [25].wie viel cistanche zu nehmenBemerkenswert ist, dass der kürzlich erschienene Bericht über die heterogene Morphologie von fötalem hAFS[45] neue Einblicke in ihre Stammhaftigkeit und ihr Genexpressionsprofil geliefert hat.BioflavonoideDies hat insgesamt ein neues Licht auf den regenerativen Wert der verschiedenen Zellfraktionen von hAFS geworfen[46]. Daher zieht die umfassende Charakterisierung der verschiedenen Subpopulationen von hAFS zunehmende Aufmerksamkeit auf sich. Wir haben zuvor berichtet, dass eine 24-stündige hypoxische und serumfreie Stimulation eine wirksame Strategie darstellt, um das parakrine Potenzial von fötalem hAFS im Ⅱ Trimester zu steigern [34,35,37]. Da wenig über die Zusammensetzung des Sekretoms von III Trimester hAFS bekannt ist, berichten wir hier über den umfassenden Vergleich von Ⅱ versus Ⅲ Trimester hAFS und ihren Sekretomfraktionen (einschließlich Hats-EVs), um den Einfluss des Gestationsstadiums und der hypoxischen Zelle zu untersuchen Vorkonditionierung auf Zell- und Sekretomeigenschaften.

2. Ergebnisse

2.1. Perinatales hAFS zeigt eine enge phänotypische Übereinstimmung mit fötalem Hasen

Es wurde kein statistisch relevanter Unterschied im Spenderalter zwischen Fruchtwasserproben des fötalen II. Trimesters und perinatalen III. Trimester festgestellt. Fetales c-KIT* hAFS (f-hAFS aus Amnionflüssigkeitsproben des zweiten Trimesters) und perinatales c-KIT* hAFS (p-hAFS aus klinischem Fruchtwasser aus III. Trimester) bestätigten ähnliche Merkmale mit Fibroblasten-ähnlicher und oval-runder Morphologie (Abbildung 1A) und mesenchymaler Stroma-Phänotyp (Daten nicht gezeigt), wie zuvor berichtet [16,25]. Sowohl f-hAFS als auch p-hAFS, die bis zu Passage 5 in vitro kultiviert wurden, zeigten in etwa 4 % der Zellen ein vernachlässigbares Maß an Seneszenz durch die Aktivierung von seneszenzassoziierter - --Galactosidase (SA- -Gal) (Abbildung 1B). . Sowohl f-hAFS als auch p-hAFS zeigten ein hohes Maß an Koexpression der mesenchymalen Marker CD107a und CD146, von denen kürzlich berichtet wurde, dass sie einen stark sekretorischen Phänotyp definieren[47]. CD107at CD146*-Zellen stellten die Mehrheit der f-hAFS-Population dar (ungefähr 64 Prozent ,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Abbildung 1. Fetale und perinatale phänotypische Auswertung. (A) Repräsentative Bilder von fötalem hAFS (f-hAFS, linkes Feld) und perinatalem hAFS (p-hAFS, rechtes Feld), das in vitro unter Standardbedingungen kultiviert wurde; Maßstabsleiste: 200 um. (B) Analyse des seneszenten Markers Beta-Galactosidase (SA- -Gal, in blau) über zytochemische Färbung auf f-hAFS und p-hAFS nach 5 Passagen in Kultur; repräsentative Bilder sind im linken Feld angegeben, Maßstabsbalken: 200 um. Der entsprechende Prozentsatz von -Gal-positiven Zellen/Feld ist in der Grafik im rechten Bereich angegeben (f-hAFS: 4,12 ± 0,58 Prozent und p-hAFS: 3,88 ± 2,10 Prozent; p=0.1424,n{ {24}}-Experimente). (C) Immunphänotyp von hAFS, der die mesenchymalen Marker CD146 und CD107a exprimiert. Repräsentative durchflusszytometrische Diagramme von f-hAFS und p-hAFS (linkes Feld) und entsprechende Werte beziehen sich auf doppelt positive CD107a-plus-CD146-plus-Zellen; CD107a plus CD146* f-hAFS: 63,68 ± 5,82 Prozent, * p =0 0,016 im Vergleich zu den restlichen g 36,32 ± 5,82 Prozent f-hAFS (andere); CD107 bei CD146 plus p-hAFS: 52,07 ± 6,76 Prozent mit den restlichen 47. 93±56,76 Prozent p-hAFS (andere); CD107a plus CD146 plus f-hAFS vs. CD107a plus CD146 plus p-hAFS p=0.2403,n=4 Experimente. Sonstiges: Gesamtmenge an verbleibendem CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS und CD107at CD146-hAFS. Alle Werte sind als Mittelwert ± SEM von unabhängigen Experimenten ausgedrückt. SA- -Gal: Seneszenz-assoziierte- -Galactosidase.

2.2. Fetales hAFS zeigt einen anderen Stoffwechsel als perinatales hAFS

Um zu bewerten, ob das Gestationsstadium den mitochondrialen Metabolismus beeinflussen kann, wurden f-hAFS und p-hAFS unter Standard-in-vitro-Kulturbedingungen durch biochemische Analysen analysiert. Die Auswertung des aeroben Stoffwechsels zeigte, dass die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die ATP-Synthese bei f-hAFS im Vergleich zu p-hAFS niedriger waren, beides, wenn sie mit Pyruvat plus Malat stimuliert wurden (P/M; ***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Hypoxische Vorkonditionierung beeinträchtigt nicht die fetale und perinatale Lebensfähigkeit und erhält ihre sekretorische Aktivität aufrecht

Um hAFS-Sekretomformulierungen zu definieren, wurden Zellen unter serumfreien Bedingungen kultiviert, um jegliche Kontamination durch FBS zu vermeiden. Wir haben zuvor gezeigt, dass 24 h serumfreie (SF) und 1 Prozent O2 hypoxische Kulturbedingungen die Lebensfähigkeit von Ⅱtrimester fötalem hAFS (f-hope) nicht signifikant veränderten, während sie die Freisetzung von regenerativen parakrinen Faktoren in ihrem zellkonditionierten Medium unterstützten (hAFS-CM) und in extrazellulären Vesikeln (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Hier haben wir zusätzlich zum erstmaligen Profilieren der p-hAFS-Sekretomfraktionen bewertet, ob p-ein ähnliches Verhalten unter demselben Vorkonditionierungsregime gezeigt haben, wobei die normoxischen Kulturbedingungen als Kontrolle verwendet wurden. Die Lebensfähigkeit von f-hAFS und p-hAFS wurde nach 24 h in den folgenden Einstellungen analysiert: normoxische (20 Prozent O2) Bedingung in vollständigem Kontroll(Ctrl)-Kulturmedium (Ctrlf-hAFSnormo und Ctrl p-hAFSnormo), eine normoxische Bedingung in SF-Medium (SF f-hAFSnormo und SF p-hAFSnormo), hypoxischer (1 Prozent O2) Zustand in vollständigem Kontrollmedium (Ctrlf-has hypo und Ctrl p-hAFSnypo) und hypoxischer Zustand in SF-Medium (SF f-has hypo und SF p -hat Hypo, Abbildung 3A). Wir bestätigten, dass die Lebensfähigkeit von f-has sowohl unter Ctrl- als auch unter SF-Bedingungen und unter hypoxischer Stimulation unverändert blieb, wobei mehr als 80 Prozent (bis zu fast 88 Prozent) der gesamten Zellen nicht betroffen waren. Frühe und späte apoptotische Zellen reichten von ca. 13 Prozent bis 18 Prozent unter SF-Bedingungen, ohne statistisch signifikante Relevanz. Ebenso lag die perinatale Lebensfähigkeit im Bereich von 80-92 Prozent, und frühe und späte apoptotische Zellen machten unter SF-Bedingungen bis zu 18 Prozent aus. p-hAFS wurden nur unter den kombinierten hypoxischen und SF-Bedingungen geringfügig beeinflusst; tatsächlich, während die Vorkonditionierung das Zellüberleben nicht beeinflusste, wenn p-hAFS in einem vollständigen Medium kultiviert wurden, zeigte die entsprechende SF-Bedingung einen Anstieg um ca. 4-falten (* S<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Abbildung 2. Metabolische Charakterisierung von fetalem und perinatalem hAFS. (A) Sauerstoffverbrauchsrate (OCR), ATP-Synthese durch F1-F.ATP-Synthase und P/O-Verhältnis in f-have und-have in Gegenwart von Pyruvat plus Malat (P/M) oder Succinat (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>Cistanche AustralienDer Vergleich des Prozentsatzes der Hemmung der OCR- und ATP-Synthese in f- und hAFS aufgrund der oben angegebenen Inhibitoren ist im unteren Feld B angegeben. Für OCR-Experimente: hAFS plus Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Wir haben dann die Ausbeute von Sekretomfraktionen, die aus f-hAFS erhalten wurden, im Vergleich zu p-hAFS basierend auf der Proteinanreicherung bewertet. Das Gesamtsekretom, als Gesamtheit der zellsekretierten parakrinen Faktoren, wird hier durch das hAFS-CM repräsentiert. Die Proteinkonzentration von f-hAFS-CM und p-hAFS-CM in SF-Medium nach hypoxischer Zellvorkonditionierung gegenüber normoxischem Kontrollzustand als Basislinie (nämlich f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo und p -hAFS-CMHypo) wurde durch BCA-Assay bewertet und als pro 10 § Zellen gemessen.ZistanchDie gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass f-has-CM und p-hAFS-CM einen gleich positiven Trend in der Proteinanreicherung nach hypoxischem Priming zeigten (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 Gradzellen; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 Gradzellen） gegenüber ihren normoxischen Gegenstücken (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 ug/10 Gradzellen; p- hAFS-CMhypoi 91,12 ± 24,39 ug/10 Grad Zellen） Ebenso wurde die Oberflächenproteinkonzentration von hAFS-EVs in f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo und p-hAFS-EVShypo gemessen EVs zeigten eine vergleichbare Ausbeute, wenn sie aus f-hAFS oder p-hAFS erhalten wurden. Was hAFS-CM-Formulierungen betrifft, wurde ein positiver Trend in der Erhöhung des Proteingehalts auf f-hAFS-EVs und p-hAFS geschätzt. EVs wurden nach hypoxischer Stimulation über die geschätzt entsprechender normoxischer Zustand （f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10-Grad-Zellen und p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10-Grad-Zellen; f-have-EVsnormo∶1,28±0,36ug/10-Grad-Zellen und p -hAFS-EVsnormo ∶ 1,19 ± 0,31 ug/10-Grad-Zellen, Abbildung 3C).

2.4.Fetale und perinatale hAFS-Freisetzungs-EVs mit analoger Morphologie und Größenverteilung

Die morphologische Analyse durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erhöhte die hohe EV-sekretorische Proliferation sowohl von f-hAFS als auch von p-hAFS (Abbildung 4). Wir untersuchten weiter die Größe und Fläche von f-hAFS-EVs und p-hAFS-EVs (Abbildung 4B) nach hypoxischer Vorkonditionierung im Vergleich zur normoxischen Grundlinie. Fetal- und perinatal haben EVs mit heterogener Größe im Bereich von 40-250 nm freigesetzt und umfassen daher sowohl Exosomen/kleine EVs als auch Mikrovesikel/Shedding-Vesikel. Die durchschnittliche Größe der EVs/Feld in den verschiedenen Gruppen war vergleichbar, fötale hAFS-EVs gemessen 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104,00 ±3,00 nm; f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) und perinatal gemessene 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, Abbildung 4B, linkes Feld). Was die Ausbeute betrifft, so zeigte hAFS, das unter Hypoxie stimuliert wurde, einen positiven Trend in der Zunahme der Menge an kleinen EVs, obwohl diese Zunahme statistisch nicht signifikant war. f-hAFS-EVStypo maß 40-70 nm, was im Vergleich zu ihrem normoxischen Gegenstück fast doppelt so hoch war. Perinatal-has-EVSHypo, die 40-70 nm, 70-100 nm und 100-130 nm gemessen haben, waren fast dreimal so hoch wie die in normoxischer Kultur erhaltenen (Abbildung 4B).

Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) zeigte eine erhöhte Anzahl von Partikeln sowohl in f-hAFS-EV- als auch in p-hAFS-EV-Präparationen und bestätigte den Anstieg von EVs in den hypoxischen Proben, wie auch in den vorherigen Analysen beobachtet (f-hAFS- EVsnormo: 182±0,10'Partikel/10-Grad-Zellen; f-have-EVshypo: 3,30±0,22×10-Grad-Partikel/10-Grad-Zellen ; p-hAFS-EVsnormo: 2,43 ± 0,80 × 10-Grad-Partikel/10-Grad-Zellen; p-hAFS-EVshypo: 3,05 ± 0,62 × 10-Grad-Partikel/10-Grad-Zellen, Abbildung 4C).

Abbildung 4. Morphologische Charakterisierung von fetalen und perinatalen Have-EVs. (A) Repräsentative Bilder der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von f-hAFS und p-hAFS (oberes bzw. unteres linkes Feld, mit schwarzen Pfeilen, die intrazytoplasmatische multivesikuläre Körper mit kleinen EVs/Exosomen darin anzeigen) und von f -hAFS-EVs und p-hAFS-EVs (oberes bzw. unteres rechtes Bild), freigesetzt unter serumfreien Bedingungen und unter normoxischer versus hypoxischer Vorkonditionierung (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; und f-hAFS-EVshypo), Maßstabsbalken: 200 nm. (B) Linkes Feld: TEM-Analyse der Größenverteilung von hAFS-EVs; rechts: Verteilung der Anzahl f-hAFS-EVs und p-hAFS-EVs pro Feldgröße Intervalle von 40 nm bis 250 nm wurden berücksichtigt; Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung von n=3 unabhängigen Experimenten ausgedrückt. (C) Nanopartikel-Tracking-Analyse für hAFS-Größe und -Verteilung. Linkes Feld: repräsentatives Bild der grafischen Ausgabe; rechtes Feld: hAFS-EVs-Konzentration, gemessen als 10-Grad-Partikel pro 10-Grad-sekretierenden Zellen; nm: Nanometer; ml: Milliliter.

2.5.Proteomische Charakterisierung von fötalem vs. perinatalem hAFS hebt Unterschiede in ihrer Sekretomzusammensetzung nach Gestationsalter und hypoxischer Vorkonditionierung hervor

Die proteomische Charakterisierung sowohl von f-hAFS- als auch von p-hAFS-Sekretom-Formulierungen wurde mittels einer Schrotflinten-Markierungs-freien Plattform durchgeführt, basierend auf der Kopplung von Nanoflüssigkeitschromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie (nLC-HRMS). Achtundvierzig proteomische Profile wurden durch die doppelte Analyse von drei biologischen Wiederholungen von hAFS-CM und have-EVs von f-hAFS und p-hAFS erworben, die eine hypoxische Zellvorkonditionierung im Vergleich zum normoxischen Zustand als Kontrolle durchmachten. Insgesamt wurden 4179 unterschiedliche Proteingruppen mit mindestens einem einzigartigen Peptid und mit Molekulargewichten im Bereich von 2 bis 3900 kDa und isoelektrischen Punkten von 3,6 bis 13 identifiziert. Im Vergleich zu hAFS-CM wurde eine höhere durchschnittliche Proteinexpression in hAFS-EVs beobachtet . Der Abgleich aller erhaltenen Proteinlisten erfolgte anhand identifizierter Proteine. Für jede experimentelle Bedingung wurde eine eindeutige Liste erstellt, die die den Proteinen zugeordneten Peptidspektrum-Match-Werte (PSMs) normalisierte und mittelte,[50] die die Anzahl der jedem zugeordneten Massenspektren und indirekt ihre Häufigkeit in den Proben darstellen. Die vollständige Liste der in hAFS-CM- und Have-EV-Formulierungen identifizierten Proteine ​​ist in Tabelle S1 aufgeführt.

Die Anwendung der linearen Diskriminanzanalyse (LDA[51]) auf dieser Masterliste ermöglichte die Extraktion statistisch signifikanter Proteine ​​(Fratio größer oder gleich 4,5 und** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 in hAFS-CM- und Have-EV-Formulierungen getrennt betrachtet. Während etwa 69,5 Prozent und 69,9 Prozent der Proteine ​​unter hAFS-EVs bzw. hAFS-CM-Bedingungen geteilt wurden, erschien der verbleibende Gehalt exklusiv in unterschiedlichen Anteilen, die von 3,7 Prozent bis 13,4 Prozent reichten, unter den Formulierungen.

Um die proteomischen Veränderungen quantitativ zu untersuchen, wurde eine kennzeichnungsfreie Differentialanalyse unter Verwendung der hausgemachten MAProMa-Software und unter Anwendung von zwei Algorithmen, DAve (Differential Average) und DCI (Differential Confidence Index, die das Verhältnis und das Vertrauen in die differenzielle Expression darstellen, durchgeführt, bzw.) auf den PSMs jedes einzelnen Proteins zwischen den beiden verglichenen Begriffen. Verwendung strenger Filter für DAve und DCI, um das Vertrauen der Identifizierung zu maximieren und Proteine ​​mit einer Variation von mehr als einer 1,5-fachen Änderung zu berücksichtigen, paarweise Vergleiche von f-hAFS-CM versus p-hAFS-CM und von f-hAFS-EVs versus p-hAFS-EVs wurden gemäß dem Gestationsstadium der Zellen hergestellt. Es wurden insgesamt 58 und 109 Proteine ​​gefunden, die in den obigen Fächern has-CM bzw. have-EV unterschiedlich exprimiert wurden (Abbildung S1B, C für ausgewählte Details und Tabellen S2-S3 in erweiterter Form). Unter diesen wurden 30 Proteine ​​in f-hAFS-CM hochreguliert und 28 in p-hAFS-CM hochreguliert (Abbildung S1B); ebenso führten 44 unterschiedliche Proteine ​​zu einer Hochregulierung in f-have-EVs und 65 wurden in p-hAFS-EVs hochreguliert (Abbildung S1C). Insbesondere sind Proteine, die zu einer Heraufregulierung von f-Has führten, als herunterregulierte von p-Has zu betrachten und umgekehrt.

Werte werden gemeldet; siehe Tabelle S2 für die vollständige Liste und detaillierte Parameter der berichteten Proteine. (C) Anreicherungsanalyse biologischer Prozesse von Proteinen, die mit einer Häufigkeit von mindestens 2 in fötalem hAFS-CM (linkes Feld) und perinatalem Have-CM (rechtes Feld) gemäß hypoxischer Vorkonditionierung der Zelle identifiziert wurden. Basierend auf dem FunRich-Tool werden Begriffe der Genontologie in Balkendiagrammen angezeigt, die den Prozentsatz der angereicherten Gene für jede Kategorie angeben (rosa Balken für-have-CMnormo, violette Balken für f-hAFS-CMhypor hellblaue Balken für p-hAFS-CMnormo, und blaue Kugeln für p-hAFS-CMhypo).Cistanche kaufenNur Begriffe der Genontologie mit Bonferroni, korrigiert mit *p<0.05 are="">

Dieser Artikel ist aus Int. J.Mol. Wissenschaft. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms