Kreuzreaktives, natürliches IgG, das L. Major erkennt, fördert die Internalisierung von Parasiten durch dendritische Zellen und fördert die schützende Immunität

Abstrakt

Schlüsselnachrichten

• Unter Verwendung verschiedener gentechnisch veränderter Mäuse fanden wir heraus, dass diese Antikörper IgG sein können, nicht nur IgM.

Schlüsselwörter

Leishmania major · Dendritische Zelle · B-Zelle ·Natürliches IgG

Einführung

Infektionen mit Leishmania spp. stellen in endemischen Ländern eine große Belastung dar. Die Krankheitsmanifestation reicht von selbstlimitierender kutaner Leishmaniose bis hin zu disseminierter, rezidivierender, mukokutaner und viszeraler Erkrankung. Unbehandelt ist die viszerale Leishmaniose eine ernsthafte Bedrohung für das Leben des Wirts. Einen Impfstoff gibt es noch nicht. Heilung und lebenslangImmunitätgegen dieses wichtige intrazelluläre Pathogen hängen von der Entwicklung von IFN-produzierenden Th1/Tc1-Zellen ab, während die Parasitenpersistenz und das Fortschreiten der Krankheit mit der Dominanz von Th2-Zellen, regulatorischen T-Zellen und/oder Th17-Antworten assoziiert sind. Die IFN-Freisetzung führt zur NO-Produktion, die die Parasiten eliminiert.Schützende Immunitätwird durch infizierte dendritische Zellen (DC) induziert. Nach der Inokulation von Leishmania major in die Haut durch die Sandmücke werden Promastigoten-Parasiten-Lebensformen von in der Haut ansässigen Makrophagen (MΦ) und Neutrophilen aufgenommen. Innerhalb von MΦ verwandeln sich Parasiten in unbegeißelte Amastigoten-Lebensformen und replizieren sich. Später werden freigesetzte Amastigoten von anderen Wirtszellen wie DC aufgenommen. Infizierte DC verarbeiten Parasiten-Antigene und wandern zu drainierenden Lymphknoten und primen T-Zellen. Die Freisetzung von IL-12 sowie anderer Zytokine aus infizierten DC lenkt die Th1/Tc1-Bildung parasitenspezifischer T-Zellen.

Während MΦ den Komplementrezeptor (CR)3 für die Parasitenaufnahme nutzt, ist in DC Fc RI/III dafür verantwortlichParasitVerinnerlichung. Interessanterweise führt die Aufnahme von CR3--assoziierten Parasiten schon früh zum Stummschalten der infizierten MΦ, während bei etablierten Infektionen die FcR-vermittelte Aufnahme von Amastigoten durch MΦ eine entzündungshemmende IL-10-Produktion induziert, die die Entwicklung von Th2/Treg fördert und Parasitenpersistenz. Im Gegensatz dazu induziert die FcR-vermittelte Parasitenaufnahme in DC die Zellaktivierung, das CD4-T-Zell-Priming und auch die Antigen-Kreuzpräsentation. Daher ist die antikörpervermittelte Parasitenaufnahme durch DC wichtig für die Entwicklung eines Schutzes gegen den Parasiten. Die Produktion von Anti-Leishmania-IgG ist somit eine Voraussetzung für ein effizientes (Cross-)Priming von Leishmania-spezifischen Th1/Tc1-Zellen. In Übereinstimmung damit war die Krankheitsentwicklung in Abwesenheit von B-Zellen schwerwiegender mit größeren Läsionsvolumina, höherer Parasitenbelastung, verzögertem T-Zell-Priming und reduzierter IFNΓ-Produktion. Zuvor haben wir gezeigt, dass Leishmania-spezifisches IgG in Seren zum Zeitpunkt der DC-Akkumulation in Läsionen vorhanden war.

Es bleibt eine offene Frage, wie sich die anfängliche B-Zell-Antwort auf den Parasiten selbst ohne B-Zell-Priming durch infizierte DC entwickelt. Sogenannte natürliche Antikörper, die Leishmania spp. kann früh erleichternInternalisierung durch Parasitenvon DC. Da Parasitenmembranen Phosphatidylserin ähnlich wie apoptotische Körper enthalten,kreuzreaktivAntikörper können eine Rolle spielen. In der vorliegenden Studie untersuchten wir, ob Anti-Phospholipid-Antikörper, die z. B. während übermäßigem Zelltod erzeugt wurden, oder natürliches IgG, das Leishmania erkennt, das in nichtimmunen Tieren vorhanden ist, dazu beitragen, dass Parasiten DC aufnehmen, um das Priming von B-Zellen und T-Zellen zu fördern. Wir fanden heraus, dass Anti-Phospholipid-Antikörper aus murinem oder menschlichem Serum sowie "natürliches IgG" in normalem Mausserum (NMS) an Leishmania-Parasiten binden, was zur Förderung ausreichtParasitVerinnerlichungdurch DC und fördert bessere Krankheitsergebnisse in vivo.

Material und Methoden

Tiere

Sechs bis acht Wochen alte C57BL/6-Mäuse wurden von Janvier erworben. B-Zell-defiziente µMT-Mäuse wurden freundlicherweise von Hansjörg Schild, Institut für Immunologie, Universitätsmedizin Mainz, zur Verfügung gestellt. IgGi- und IgMi-Mäuse (beide auf C57BL/6-Hintergrund) wurden zuvor beschrieben. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen im Translational Animal Research Center (TARC) der Johannes Gutenberg-Universität Mainz gehalten. Alle Versuche wurden mit einer genehmigten Genehmigung des Tierschutz- und Verwendungsausschusses der Region Rheinland-Pfalz durchgeführt.

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Parasiten und Infektionen 

Amastigoten oder metazyklische Promastigoten von L. major Clon VI (MHOM/IL/Friedlin) wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Amastigoten wurden wie zuvor beschrieben aus infizierten Ohren von BALB/c- oder B-Zell-defizienten uMT-Mäusen isoliert. Isolierte Parasiten wurden mit 5 % NMS, IMS oder Anti-PL für 10 min bei 37 Grad opsonisiert und vor in vitro- oder in vivo-Infektionen gewaschen.

Seren, IgG-Anreicherung und Parasitenbindungsassay

Normales Mausserum (NMS) wurde von naiven C57BL/6-Mäusen erzeugt, während Immunserum (IS) von geheilten Mäusen genommen wurde, die mit 2 × 10E5 metazyklischen Promastigoten von L. major für größer als oder gleich infiziert waren bis 6 Wochen. Antiphospholipid-Antikörper (PL)-Seren wurden durch wiederholte Immunisierung mit apoptotischen Thymozyten erzeugt. Vor der Gewinnung des Serums wurde der Immunisierungserfolg verifiziert, indem die spezifische IgG-Bindung an apoptotische Zellen mittels Durchflusszytometrie oder in einem -Glykoprotein-spezifischen ELISA bestimmt wurde. Gruppen von C57BL/6-Mäusen wurden mit rekombinantem 2--Glykoprotein (2G) in Gegenwart von Freuds Adjuvans (FA) immunisiert; Serum, das Anti- 2G enthielt, wurde nach 4 Wochen geerntet. Anti-Leishmania-IgG Größer als oder gleich 5–6- Wochen L. major-infizierte BALB/c-Mäuse, PL- oder b2G-spezifisches IgG, wurde aus gepoolten Seren unter Verwendung von Protein-G-Säulen (Pierce Chemical Co.) präpariert. nach dem Protokoll des Herstellers. Die Seren wurden vor der IgG-Reinigung bei –20 Grad gelagert. Gereinigtes IgG wurde vor der Verwendung bei 4 Grad (0,8 mg/ml) in PBS gelagert.

Normales Humanserum (NHS) stammte von gesunden Kontrollpersonen und Serum, das Anti-Leishmania-Antikörper enthielt, wurde von Patienten mit kutaner Leishmaniose (LM) aus Marokko erhalten. Serum von Patienten mit Antiphospholipid-Syndrom (PL) wurde ebenfalls verwendet.

Parasiten (Promastigoten oder Amastigoten) wurden auf oberflächenassoziiertes Ig gefärbt, wobei Isotyp-spezifische Sekundärantikörper verwendet wurden, die mit Maus-Ig reaktiv waren: Anti-IgM (Serotec), Anti-IgG1 (A85-1) und Anti-IgG2a/b ( R2-40, alle von BD Biosciences). Nach dem Färben wurden die Parasiten mit PBS/2 Prozent BSA gewaschen, fixiert und durch Durchflusszytometrie analysiert.

In-vitro-Stimulation

Aus Knochenmark stammende DC wurden in RPMI/5 Prozent FCS-Medium, ergänzt mit IL-4 (10 µg/ml) und GM-CSF (10 µg/ml) für 6 Tage wie zuvor beschrieben erzeugt. Die Zellen wurden am Tag 6 als unreife DC geerntet. 2× 105 DC wurden mit opsonisierten Amastigoten aus infizierten BALB/c- oder µMT-Mäusen kokultiviert oder mit opsonisierten metazyklischen Promastigoten (MOI 1:5) für 18 h kultiviert. Danach wurden die Zellen geerntet und Cytospins wurden wie zuvor beschrieben erzeugt. DifQuick-gefärbte Zellen wurden auf das Vorhandensein von intrazellulären und extrazellulären Parasiten analysiert. Pro Probe wurden mindestens 200 Zellen gezählt.

In-vivo-Infektionen

Die Läsionsvolumina wurden wöchentlich in drei Dimensionen gemessen und als Ellipsoide [(a/2×b/2×c/2)×4/3×π] angegeben. Parasiten, die in Läsionsgewebe vorhanden waren, wurden unter Verwendung eines Grenzverdünnungsassays, wie zuvor beschrieben, gezählt.

Zur Messung der antigenspezifischen Zytokinproduktion wurden entwässernde LN-Zellen infizierter C57BL/6-Mäuse gewonnen und Einzelzellsuspensionen hergestellt. Eine Million LN-Zellen/200 μl vollständiges RPMI 1640 (Biochrome) wurden in Gegenwart von 25 ug/ml SLA zu 96--Well-Platten gegeben. Die Überstände wurden 48 h nach der Stimulation geerntet und unter Verwendung von ELISAs getestet, die spezifisch für IFNΓ (R&D Systems) sowie IL-4 und IL-10 (BD) waren.

Myeloide humane DC, infiziert mit opsonisierten Parasiten

Myeloides humanes CD1c plus DC (hDC) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines magnetischen Zellisolationssystems und des BDCA-1-Human-DC-Isolationskits (Miltenyi, Deutschland) aus peripherem Blut isoliert. 1,5 × 107 Zellen wurden in 2,5 ml RPMI 1640/2 Prozent autologem Plasma ausplattiert. Um die Reinheit anzureichern, wurden die Zellen mit warmem PBS gewaschen und schließlich mit X-VIVO 15/Plasma (1 Prozent), ergänzt mit rekombinantem humanem IL -4 (150 U/ml) und GM-CSF (400 U/ml) kultiviert. . Unreife hDC wurden am Tag 6 geerntet. 2 × 105 hDC wurden mit opsonisierten Amastigoten aus infizierten µMT-Mäusen kokultiviert oder mit opsonisierten metazyklischen Promastigoten (MOI 1:5) für 18 h kultiviert. Danach wurden die Zellen geerntet und Cytospins wurden wie zuvor beschrieben erzeugt. DifQuick-gefärbte Zellen wurden auf das Vorhandensein von intrazellulären und extrazellulären Parasiten analysiert. Pro Probe wurden mindestens 200 Zellen gezählt.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde unter Verwendung der StatView-Software und des ungepaarten Student-t-Tests durchgeführt.

Ergebnisse

Antiphospholipid-Antikörper enthaltendes Serum bindet an L. major

Da Parasiten über einen als "apoptotische Mimikry" bezeichneten Prozess in Wirtszellen eindringen können und L. major-Lebensformen Phospholipide auf ihrer Oberfläche exprimieren, haben wir unter Verwendung etablierter Protokolle ein Serum erzeugt, das Antiphospholipid-Antikörper (PL) enthält. Zu diesem Zweck wurden Gruppen von C57BL/6-Mäusen mit L. major infiziert und mit apoptotischen Thymozyten in Gegenwart von Freuds Adjuvans (FA) immunisiert. Da 2-Glykoprotein (2G) das primäre Antigen beim Antiphospholipid-Syndrom (APS) ist, immunisierten wir auch Mäuse mit 2G in Gegenwart von FA, um Serum zu erhalten, das Anti- 2G-Antikörper enthält. Als Kontrollen wurden normales Mausserum (NMS) von nicht infizierten C57BL/6-Mäusen und Immunserum (IS) von L. major-infizierten Mäusen verwendet.

Um zu testen, ob diese verschiedenen Mausseren von naiven oder immunisierten Mäusen Antikörper enthalten, die an L. major binden, haben wir zunächst die Antikörperbindung an Parasitenantigen durch ELISA unter Verwendung von L. major-Promastigoten-Gefrier-Tau-Lysat (lösliches Leishmania-Antigen, SLA) als Substrat untersucht (Abb. 1A, schwarze Säulen). Als Standard verwendeten wir IgG, das aus den Seren von mit L. major infizierten Mäusen isoliert wurde. Interessanterweise enthielten sowohl IS- als auch PL-Serum vergleichbare Niveaus der Antikörperbindung an Leishmania-Lysat, die 3- bis 4-mal höher war als die Bindung, die mit NMS oder Seren von Mäusen beobachtet wurde, die nur mit Adjuvans immunisiert wurden. Darüber hinaus wird auch Serum, das 2G-Antikörper enthält, an SLA gebunden. Mit einem für 2G spezifischen ELISA (weiße Säulen) identifizierten wir hohe 2G-IgG-Spiegel im Serum, während die 2G-IgG-Spiegel in allen anderen Seren unter der Nachweisgrenze lagen.

Feige. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>6 Wochen mit 2× 105 L. major (Immunserum, IS). Eine andere Gruppe wurde wiederholt mit apoptotischen Thymozyten (Anti-Phospholipid-Ak, a-PL) oder rekombinantem 2--Glykoprotein (a- 2G) in Gegenwart von unvollständigem Freuds (FA)-Adjuvans immunisiert, wobei FA als verwendet wurde Kontrolle. Ein Serum wurde in einem ELISA unter Verwendung von L. major-Lysat als Substrat oder 2--Glykoprotein auf Reaktivität getestet. Der ELISA wurde unter Verwendung von Anti-Maus-IgG entwickelt. Die Daten werden als Mittelwert ausgedrückt (±SEM, n größer als oder gleich 1). B Metazyklische Promastigoten von L. major wurden aus Kulturen in stationärer Phase erhalten (n{{10}}). C Amastigoten wurden aus Läsionen von B-Zell-defizienten µMT-Mäusen (n=3) präpariert. B- und C-Parasitenpräparate wurden mit unterschiedlichen Seren opsonisiert (5 Prozent, 10 min, 37 Grad). Die Antikörperbindung wurde durch FACS mit Anti-Maus-Sekundärantikörpern bewertet. Die Bindung von Ig wurde über die Ausgangswerte von nicht opsonisierten Parasiten berechnet (*p kleiner oder gleich 0,05, **p kleiner oder gleich 0,005 und ***p kleiner oder gleich 0,002).

Als nächstes inkubierten wir metazyklische Promastigoten von L. major im infektiösen Stadium mit unterschiedlichen Konzentrationen von IgG, angereichert aus IS-, PL- oder 2G-Seren. Wir beobachteten eine dosisabhängige Bindung von IS- und 2G-abgeleitetem IgG mit einem Maximum bei 100 ng/ml (Abb. 1B). Eine Bindung von PL-abgeleitetem IgG an Promastigoten von L. major wurde nicht nachgewiesen.

Darüber hinaus inkubierten wir L. major-Amastigoten, die aus Läsionen von B-Zell-defizienten µMT-Mäusen isoliert wurden, mit den verschiedenen Seren für 10 min. Die Parasiten wurden dann ausgiebig gewaschen, und danach wurde der oberflächengebundene Antikörper durch Durchflusszytometrie nach Markierung mit PE-konjugiertem Anti-IgG1, Anti-IgG2a/b oder Anti-IgM nachgewiesen ( 1C ). Wie erwartet enthielt IS Leishmania-spezifisches IgM, IgG1 und IgG2a/b. Wir bestätigen auch frühere Arbeiten, da wir Leishmania-spezifisches IgM im Pool sogenannter „natürlicher Ab“ nachgewiesen haben. Interessanterweise fanden wir IgG und IgM auch so stark im PL-Serumkreuzreagiertmit der Oberfläche von L. major amastigotes. Anti- 2G-haltige IgG-Antikörper banden nicht an Leishmania, aber das 2G-Serum enthielt IgMkreuzreagierendmit amastigoten Oberflächen.

Kreuzreaktive Antikörper vermitteln die Internalisierung des Parasiten durch DC

Als nächstes wollten wir beurteilen, ob die verschiedenen IgG-Antikörper, die an die Oberfläche von L. major-Amastigoten binden können, funktionell aktiv sind. Daher erzeugten wir DC unter Verwendung von Kulturen von Knochenmarkzellen (BM), ergänzt mit GMCSF und IL-4. BM-DC wurden am Tag 6 als unreife Zellen geerntet und mit 2 × 10 5 Zellen/ml ausplattiert. Parasiten-Amastigoten, die von infizierten Fußballen von Wildtyp-BALB/c- oder B-Zell-defizienten uMT-Mäusen stammten, wurden mit verschiedenen Seren (5 Vol.-%) opsonisiert, ausgiebig gewaschen und dann zu DC in einem Parasiten/Zell-Verhältnis von 5:1 gegeben. Nach 18 h wurden die Zellen geerntet, gewaschen und zytospiniert.

ParasitVerinnerlichungwurde auf DifQuickstained-Objektträgern bei 100× bestimmt (Abb. 2). Wie beschrieben, war die Aufnahme von Parasiten, die aus µMT-Mäusen isoliert wurden, signifikant beeinträchtigt. Die Vorinkubation mit NMS verstärkte die Parasitenaufnahme leicht, während die Inkubation mit IS zu einer "Normalisierung" der DC-Infektionsraten auf Werte führte, die bei BALB/c-abgeleiteten Amastigoten beobachtet wurden. Bemerkenswert ist, dass die Parasiten-Opsonisierung mit PL auch die DC-Infektionsraten signifikant und deutlich um ~ 100 Prozent verbesserte. In Übereinstimmung mit den niedrigeren Spiegeln der IgG-Opsonisierung von Amastigoten mit b2G-haltigem Serum (vergleiche Fig. 1C) erhöhte dies auch die Infektionsraten von DC, jedoch in geringerem Ausmaß.

Abb. 2Die Opsonisierung von L. major mit kreuzreaktiven Antikörpern führt zu einer verstärkten Parasitenaufnahme durch DC. Unreife C57BL/6 BMDC(2× 105) wurden zusammen mit Amastigoten aus BALB/c- oder B-Zell-defizienten µMT-Mäusen (1:3) kultiviert. Vor der Co-Inkubation wurden Amastigoten mit normalem Mausserum (NMS), Immunserum (IS), Serum, das Anti-Phospholipid-Antikörper enthielt, das durch wiederholte Immunisierung mit apoptotischen Thymozyten (aPL) erhalten wurde, oder Serum, das Anti-- 2-Glykoprotein enthielt, opsonisiert Antikörper (2G). Nach 18 h wurden die Infektionsraten an Cytospins durch Lichtmikroskopie bestimmt (n=3, *p kleiner oder gleich 0.05,**p kleiner oder gleich 0,005, und ***p kleiner oder gleich 0,002 im Vergleich zu nicht opsonisierten Kontrollen)

Kreuzreaktive Anti-Phospholipid-Antikörper verbessern den Krankheitsverlauf bei kutaner Leishmaniose

In nachfolgenden Experimenten wollten wir beurteilen, ob eine Parasiten-Opsonisierung mitkreuzreaktivAntikörper verändern den Krankheitsverlauf in vivo. Zu diesem Zweck wurden aus Parasitenkulturen isolierte und angereicherte metazyklische Promastigoten mit verschiedenen Seren opsonisiert, wie oben beschrieben. Mit NMS opsonisierter Parasit diente als Negativkontrolle. Nach ausgiebiger Parasitenwäsche wurden Gruppen von fünf C57BL/6-Mäusen intradermal mit 103 L. major infiziert. Die Läsionsentwicklung wurde für ~4 Monate überwacht. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen induzierten mit IS opsonierte Parasiten kleinere Ohrläsionen im Einklang mit einer erhöhten Häufigkeit von infizierten Haut-DC zu frühen Zeitpunkten (Abb. 3). Überraschenderweise förderten mit PL oder 2G opsonisierte Parasiten in ähnlicher Weise ähnlich verbesserte Krankheitsergebnisse, wie durch um 50 Prozent reduzierte Läsionsvolumina zwischen Woche 5 und 8 nach der Infektion bestimmt wurde.

Kreuzreaktive Anti-Phospholipid-Antikörper verbessern den Krankheitsverlauf bei kutaner Leishmaniose

In nachfolgenden Experimenten wollten wir beurteilen, ob eine Parasiten-Opsonisierung mitkreuzreaktivAntikörper verändern den Krankheitsverlauf in vivo. Zu diesem Zweck wurden aus Parasitenkulturen isolierte und angereicherte metazyklische Promastigoten mit verschiedenen Seren opsonisiert, wie oben beschrieben. Mit NMS opsonisierter Parasit diente als Negativkontrolle. Nach ausgiebiger Parasitenwäsche wurden Gruppen von fünf C57BL/6-Mäusen intradermal mit 103 L. major infiziert. Die Läsionsentwicklung wurde für ~4 Monate überwacht. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen induzierten mit IS opsonierte Parasiten kleinere Ohrläsionen im Einklang mit einer erhöhten Häufigkeit von infizierten Haut-DC zu frühen Zeitpunkten (Abb. 3). Überraschenderweise förderten mit PL oder 2G opsonisierte Parasiten in ähnlicher Weise ähnlich verbesserte Krankheitsergebnisse, wie durch um 50 Prozent reduzierte Läsionsvolumina zwischen Woche 5 und 8 nach der Infektion bestimmt wurde.

Als nächstes verwendeten wir µMT-Amastigoten, die mit 100 µg IgG, angereichert von NMS, IS oder PL, inkubiert wurden (Abb. 4). Auch hier beobachteten wir, dass sowohl IgG von IS als auch PL im Vergleich zu nicht opsonisierten Parasiten zu einer milderen Erkrankung mit kleineren Läsionen führten (Abb. 4A). Parallel dazu zeigten die Parasitenlasten des Läsionsgewebes, wie sie in Woche 6 nach der Infektion bestimmt wurden, (signifikant) geringere Parasitenlasten bei Infektionen, die in Gegenwart von Parasiten-bindenden Antikörpern initiiert wurden (Abb. 4B). Die Antigen-spezifische Restimulation von drainierenden Lymphknotenzellen mit SLA ergab unveränderte IFN-Spiegel, während niedrigere Spiegel von IL-4 und IL-10 bei Mäusen gefunden wurden, die mit IgG-opsonisierten Parasiten infiziert waren (Abb. 4C). . Dies steht im Einklang mit verringerten Läsionsgrößen, da frühere Arbeiten zeigten, dass die Eliminierung von Parasiten bei Mäusen von der Aktivierung infizierter MΦ durch läsionales IFN abhängt, dem durch IL-4 und – sehr wichtig – IL-10 entgegengewirkt wird. . Daher führten die Wirkungen von IL-10 auf infizierte MΦ zu einer Persistenz des Parasiten. Daher scheint das Verhältnis zwischen IFN einerseits und Th2/Treg-assoziierten Zytokinen wie IL-4 und IL-10 am relevantesten für den Krankheitsverlauf zu sein.

Interessanterweise wurden in dieser Umgebung jedoch auch kleinere Läsionsvolumina beobachtet, wenn IgG von NMS zur Opsonisierung verwendet wurde, was das Vorhandensein von anzeigtekreuzreaktivnatürliche Antikörper auch im Serum naiver Mäuse.

Sowohl Leishmania‑spezifische als auch kreuzreaktive Antikörper können den genetischen Mangel an IgG ersetzen

Um den spezifischen Beitrag von Immunglobulin-Subtypen bei der Reaktion auf Leishmania besser zu analysieren, haben wir IgMi- und IgG1i-Mäuse verwendet, die wir zuvor generiert haben. IgMi-Mäuse sind Mäuse, bei denen alle B-Zellen IgM exprimieren, aber weder die Klasse wechseln noch Antikörper sezernieren können. In den IgG1i-Mäusen entwickeln sich alle B-Zellen unter Verwendung von IgG1 als ihrem B-Zell-Rezeptor, aber diese Zellen können auch keinen Klassenwechsel durchführen, sind jedoch in der Lage, IgG1-Antikörper zu sezernieren. Wir infizierten IgMi- und IgG1i-Mäuse mit dem genetischen Hintergrund C57BL/6 mit 103 L. major. Wir fanden heraus, dass das Vorhandensein von IgG1 in den Seren ausreichte, damit die Mäuse eine vollständige Antwort auf den Parasiten zeigten, ähnlich wie bei den Wildtyp-Tieren ( 5A ). Im Gegensatz dazu war das Fehlen von sezernierten Antikörpern, wie es bei den IgMi-Mäusen beobachtet wurde, ausreichend, um die Genesung der Mäuse zu verzögern (Fig. 5A).

Als nächstes rekonstituierten wir die IgMi-Mäuse oder Wildtyp-Kontrollen entweder mit NMS oder IS und infizierten sie dann mit L. major-Promastigoten. Wie erwartet induzierte die IS-Rekonstitution in beiden Mausstämmen signifikant kleinere Läsionen in vivo, was bestätigt, dass die IgG-vermittelte beschleunigte Parasitenaufnahme durch DC eine verbesserte Anti-Leishmania fördertImmunität(Abb. 5B). Schließlich bewerteten wir das Krankheitsergebnis nach der Verwendung von opsonisierten Parasiten. Vor der Infektion von IgMi-Mäusen wurden Parasiten mit IgG opsonisiert, das aus NMS-, IS- oder PL-Serum angereichert war (Fig. 5C). In Übereinstimmung mit dem in Fig. 5B gezeigten Experiment erleichterten IS-opsonisierte Parasiten eine verstärkte Parasitenabwehr. Wiederum waren Antiphospholipid-Antikörper in der Lage, Leishmania-spezifisches IgG von IS zu ersetzen, da beide IgG-Antikörper, die vor der Infektion an L. major-Promastigoten gebunden waren, bessere Krankheitsergebnisse von IgMi-Mäusen förderten. IS- und PL-opsonisierte Parasiten induzierten im Vergleich zu nicht opsonisierten Parasiten signifikant kleinere Läsionsvolumina und eine frühere Heilung.

Wichtig ist, dass die Verabreichung von NMS an IgMi-Mäuse ihren Phänotyp auf den bei C57BL/6-Mäusen beobachteten Krankheitsverlauf "normalisierte" ( 5B ). Diese Ergebnisse stimmen mit unseren oben gezeigten Daten überein, was darauf hindeutet, dass NMS auch a enthältkreuzreaktivAntikörper-IgG-Isotyp, der in der Lage ist, an Parasiten mit nachfolgenden funktionellen Konsequenzen in vitro und in vivo zu binden. Eine weitere Bestätigung kommt von IgMi-Mäusen, die mit NMS-umhüllten Parasiten infiziert waren, die ebenfalls in der Lage waren, die Infektion besser zu kontrollieren (Fig. 5C).

Feige. 4Antikörper-opsonisierte Parasiten induzieren eine effiziente Immunität bei B-Zell-defizienten µMT. Parasiten wurden mit normalem Mausserum (NMS), Immunserum (IS), Serum mit Antiphospholipid-Antikörpern (a-PL) oder — nur C57BL/6-Mäusen — Serum mit Anti- 2-Glykoprotein-Antikörpern (2G) opsonisiert Vorhandensein von Freuds Adjuvans (FA). Gruppen von Mäusen mit mehr als oder gleich 5 µMT wurden mit 103 opsonisierten metazyklischen Promastigoten von L. major infiziert. Die Läsionsentwicklung wurde wöchentlich beurteilt. B In Woche 6 wurden Läsionsparasitenbelastungen von infizierten µMT-Mäusen durch limitierenden Verdünnungsassay bestimmt. Einzelne Parasitennummern werden angezeigt; Balken drücken Mittel aus. C Zytokinprofile von drainierenden µMT LN-Zellen wurden durch Restimulation mit löslichem Leishmania-Antigen (SLA) bestimmt. Die Freisetzung von IFNΓ, IL{{10}} und IL-10 in 48- h Überstände wurde durch ELISA bestimmt (Mittelwert ± SEM, n=15 Mäuse/Gruppe von unabhängigen 3 Experimente, *p kleiner oder gleich 0,05, **p kleiner oder gleich 0,005 und ***p kleiner oder gleich 0,002 im Vergleich zu Mäusen, die mit nicht opsonisierten Parasiten infiziert waren)

Humanserum enthält die funktionell aktiven, parasitenkreuzreaktiven Antikörper

Um die Relevanz unserer Ergebnisse für den Menschen zu testen, wurden aus B-Zell-defizienten µMT-Mäusen isolierte Promastigoten oder Amastigoten mit normalem Humanserum (NHS), Serum von L. major-infizierten Patienten (LM) oder Serum von APS-Patienten (APS ). Oberflächengebundenes IgG auf Parasiten wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Interessanterweise band LM-Serum schwach an die Oberflächen von Promastigoten, aber stark an Amastigoten. Interessanterweise enthielt APS-Serum ähnliche IgG-Spiegelkreuzreaktivmit Parasitenoberflächen (Abb. 6A).

Als nächstes wurde IgG aus LM-Seren unter Verwendung von Protein-A-Säulen angereichert (Fig. 6B). Diese und verschiedene Konzentrationen von intravenösen Immunglobulinen (IVIG), die zur Behandlung verschiedener (Immun-)Erkrankungen von Patienten verwendet werden, wurden als nächstes zur Parasiten-Opsonisierung vor der Durchflusszytometrie verwendet. Leishmania IgG wird signifikant an Promastigoten und Amastigoten von L. major gebunden. Interessanterweise enthielt im Handel erhältliches IVIG dieses IgGkreuzreagiertsowohl mit Promastigoten- als auch mit Amastigoten-Parasitenpräparaten.

Schließlich wurden CD1c plus primäre myeloische humane DC aus Buffy Coats mit uMT-Amastigoten von L. major inkubiert, die mit LM-Serum oder Serum von APS-Patienten oder IVIG inkubiert wurden (MOI 3; Fig. 7). Zur Bestätigung unserer murinen Daten mit menschlichen Zellen beobachteten wir, dass das Vorhandensein von IgG (kreuzreaktivoder Leishmania-spezifisch) auf Leishmania-Oberflächen reicht aus, um verstärkt zu fördernParasitVerinnerlichungvon DC. APS-Serum erhöhte den Prozentsatz infizierter DC um fast 100 Prozent, während LM-Serum und IVIG die Parasitenaufnahme im Vergleich zu nicht opsonisierten Parasiten um 30 Prozent steigerten. Interessanterweise enthielt NMS-Serum auch Parasiten-reaktives IgG-förderndParasitVerinnerlichung.

Feige. 5 C57BL/6-, IgMi- und IgGi-Mäuse, die mit verschiedenen Seren rekonstituiert oder mit verschiedenen gereinigten IgG-opsonisierten L. major infiziert wurden, zeigen verbesserte Krankheitsergebnisse. Eine Gruppe von mehr als oder gleich 5 C57BL/6-, C57BL/6-IgMi- oder IgGi-Mäusen wurde mit physiologischen niedrig dosierten Inokula von L. major (103 metazyklische Promastigoten) infiziert. B Eine Woche vor der Infektion wurden C57BL/6- und B6-IgMi-Mäuse ip zweimal mit 100 µl entweder normalem Mausserum (NMS) oder Immunserum (IS) rekonstituiert. C Vor der Infektion von IgMi-Mäusen wurden Parasiten mit IgG opsonisiert, das aus Seren durch Bindung an Protein-A-Säulen [normales Mausserum (NMS), Immunserum (IS) oder Serum mit Anti-Phospholipid-Antikörpern (a-PL)] angereichert war. Die Entwicklung der A–C-Läsion wurde wöchentlich bewertet (Mittelwert ± SEM, n=10 Mäuse/Gruppe aus 2 unabhängigen Experimenten, *p kleiner oder gleich 0,05, **p kleiner oder gleich 0,005 und *** p Kleiner oder gleich 0,002 im Vergleich zu C57BL/6 [A], C57BL/6 oder IgMi [B] oder keine [C])

Feige. 6Antiphospholipid-Antikörper in Humanseren kreuzreagieren mit L.-Hauptoberflächenmolekülen. Metazyklische Promastigoten aus Kulturen in der stationären Phase oder läsionale Amastigoten von L. major, isoliert aus µMT-Mäusen, wurden mit verschiedenen Arten von menschlichen Seren (5 Prozent) oder gereinigtem IgG opsoniert. Normale Humanseren (NHS) wurden von gesunden Kontrollpersonen erhalten. Es wurden auch Seren von Patienten mit nachgewiesener kutaner Leishmaniose (LM, erworben in Marokko, n=4) und von Patienten mit Antiphospholipid-Syndrom (PL, n=3) verwendet. B-IgG wurde aus LM-Seren unter Verwendung von Protein-A-Säulen (n=3) angereichert. Es wurden verschiedene Konzentrationen von intravenösen Immunglobulinen (IVIG, n=2) verwendet (µg/ml). Die A- und B-Parasiten wurden unter Verwendung von Durchflusszytometrie auf die Oberflächenbindung von Gesamt-Human-Ig analysiert. Die Bindung von Ig wurde in Bezug auf die Ausgangswerte von nicht opsonisierten Parasiten berechnet (Mittelwert ± SEM, *p kleiner als oder gleich 0.05, **p kleiner als oder gleich {{10 }}.005 und ***p Kleiner oder gleich 0,002)

Diskussion

Die Heilung von kutaner Leishmaniose erfordert ein effizientes T-Zell-Priming und eine IFN-Freisetzung, die beide von infizierten DC abhängen, um naiven T-Zellen Antigene zu präsentieren. Im Gegensatz zur CR3--abhängigen Phagozytose durch MΦ haben wir das gezeigtParasitVerinnerlichungdurch DC erfolgt über Fc RI und Fc RIII, die sich gegenseitig substituieren können. Als solche entwickelten Fc-, Fc RI/Fc RIII-defiziente Mäuse und B-Zell-defiziente µMT-Mäuse (alle mit C57BL/6-Hintergrund) im Vergleich zu Wildtypmäusen größere Läsionen und eine verzögerte Heilung aufgrund einer beeinträchtigten DC- abhängiges T-Zell-Priming. Unsere vorliegende Studie bestätigt diese frühere Beobachtung, aber zusätzlich deuten unsere Daten mit IgMi- und IgGi-Mäusen auch darauf hin, dass tatsächlich sezernierte Antikörper und nicht das bloße Vorhandensein von B-Zellen entscheidend für eine wirksame Reaktion auf den Parasiten sind. Als solche zeigten IgMi-Mäuse mit B-Zellen, die nicht in der Lage waren, IgG zu produzieren, ähnlich wie B-Zell-defiziente Mäuse größere Läsionen im Vergleich zu IgGi-Mäusen oder Wildtyp-Mäusen.

Da sowohl NMS- als auch IS-opsonisierte Amastigoten in ähnlichem Ausmaß aufgenommen wurden und NMS-opsonisierte Promastigoten nicht von DCs phagozytiert wurden (mit effizienter Bindung von IgM an ihre Oberfläche), kamen wir zuvor zu dem Schluss, dass IgM für die Parasitenaufnahme nicht erforderlich ist. In der vorliegenden Studie konnten wir diese Befunde bestätigen, indem wir normale Mausseren in Mäusen verwendeten, denen entweder überhaupt keine B-Zellen oder nur Antikörper sezernierten. Außerdem konnten wir zeigen, dass IgG1--haltige Seren den Eintritt von Amastigoten sowohl in humane als auch in Maus-DC steigern konnten.

Es blieb ungeklärt, wie sich die anfängliche B-Zell-Antwort ohne infizierte DC entwickelt. Eine Möglichkeit war, dass im Pool von "natürlichem" IgG,kreuzreaktivAntikörper sind möglicherweise in der Lage, Parasiten zu erkennen und dienen als Ersatz für die Leishmania-spezifischen Antikörper, die sich später entwickeln (Anstieg zwischen Woche 4 und Woche 6 nach der Infektion). Neben antigenspezifischen Antikörpern werden sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen nach der Geburt sogenannte natürliche Antikörper von B-1-Zellen produziert. Einige haben die Fähigkeit, Selbstantigene zu erkennen; lange Zeit glaubte man, ihnen fehle die Spezifität für fremde Antigene. Später lieferten die Daten Hinweise darauf, dass natürliches IgM verschiedene mikrobielle Antigene erkennt und zur Eliminierung von Krankheitserregern beiträgt. In letzter Zeit haben jedoch mehrere Studien gezeigt, dass natürliches IgG eine Rolle spieltangeboren Immunitätsowie. Es wurde gezeigt, dass es mit Pathogen-assoziierten Lektinen (z. B. MBL) interagiert und Immunkomplexe bildet, um die Pathogene zu beseitigen. Es wird auch erwartet, dass pathogengebundenes natürliches IgG mit anderen PRRs wie C1q interagiert, um den klassischen Komplementweg zu aktivieren. Es wurde gezeigt, dass natürliches IgG spezifisch mit Pathogen-assoziierten Lektinen zusammenarbeitet, um eine wirksame antimikrobielle Wirkung gegen opportunistische Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus auszulösen.

Während des apoptotischen Zelltods wird eine Exposition gegenüber Phosphatidylserin (PS) auf apoptotischen Körpern beobachtet. Die Wirtserkennung von PS auf der Oberfläche sterbender oder toter Zellen über Antikörper ist ein wichtiger Schritt bei ihrer Beseitigung. In einem als „apoptotische Mimikry“ bezeichneten Prozess exponieren Leishmania-Parasiten PS auch auf ihrer eigenen Oberfläche, die als „Eat-me“-Signal für phagozytische Zellen dient, ähnlich dem, was von apoptotischen Zellen gesehen wird. Darüber hinaus sterben einige der Promastigoten im infektiösen Stadium (ohne Beteiligung von Caspasen) und setzen PS selbst frei. Obligatorische intrazelluläre Amastigoten-Lebensformen weisen jedoch alle PS auf ihrer Oberfläche auf, was es ihnen ermöglicht, effizient in Wirtszellen einzudringen. Wir haben nun untersucht, ob künstlich induzierte PL-Antikörper in der Lage sind, Leishmania-Parasiten zu erkennen, und ob diese funktionell aktiv sind, um den Eintritt des Parasiten in relevante Wirtszellen zu erleichtern. Wir haben beobachtet, dass murine und menschliche Anti-Phospholipid-Antikörper Leishmania-Lebensformen binden. Mit verschiedenen Ansätzen identifizierten wirkreuzreaktivAntikörper in PL-Serum, das bevorzugt an Oberflächen-Phospholipide von L. major zu binden scheint. Obwohl Promastigoten-Parasiten diese Phospholipide ebenfalls exprimieren, scheinen interessanterweise Oberflächen-Phospholipide auf Amastigoten stärker exponiert zu sein, wie unter Verwendung von löslichem Parasiten-Antigen aus dieser Parasiten-Lebensform in einem ELISA gezeigt wurde. Darüber hinaus zeigten wir, dass diese IgG-Opsonisierung ausreichte, um die Parasitenaufnahme durch DC zu fördern. Wichtig ist, dass PL-opsonisierte Parasiten in vivo einen verbesserten Krankheitsverlauf mit kleineren Läsionsvolumina und früherer Läsionsauflösung induzierten. Daher, in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen unserer Gruppe, aufgrund einer verstärkten DC-Infektion in Gegenwart von(kreuzreaktiv)IgG auf den Parasiten wurde eine bevorzugte Induktion von Th1/Tc1-Zellen induziert, verbunden mit einer verringerten Anzahl von Th2- und Treg-Zellen und somit einem besseren Krankheitsverlauf.

Abb. 7Primäre myeloische DC aus menschlichem Blut internalisieren bevorzugt Parasiten mitkreuzreaktivan ihre Oberfläche gebundenes Antiphospholipid-IgG. CD1a plus myeloide humane DC wurden aus Buffy Coats unter Verwendung von MACS-Kügelchen isoliert und mit 2 × 105 Zellen/ml ausplattiert. Aus µMT-Mäusen isolierte Amastigoten wurden vor der Koinkubation mit DC (1:3) mit 5 % Serum oder 1 0 µg/ml IVIG inkubiert. Nach 18 h wurden die Infektionsraten an Zytospins durch Lichtmikroskopie bestimmt (n=3, *p kleiner oder gleich 0,05 und ***p kleiner oder gleich 0,002 im Vergleich zu nicht opsonisierten Kontrollen).

Interessanterweise fanden wir heraus, dass Parasiten, die mit NMS opsoniert wurden, bessere Krankheitsergebnisse im Vergleich zu nicht opsonisierten Parasiten förderten, was auf das Vorhandensein von natürlichem IgG in NMS hinweist, das in der Lage ist, Leishmania zu erkennen. Dies war am besten sichtbar in IgMi (ohne B-Zellen, die in der Lage sind, jegliches IgG zu produzieren), das mit NMS ersetzt wurde. Dabei wurden die deutlich größeren Läsionsgrößen von IgMi-Mäusen auf die von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen reduziert (Abb. 5). Allerdings ist das Vorhandensein von natürlichen, LeishmaniakreuzreaktivIgG wurde auch bei Wildtyp-Mäusen beobachtet, die mit NMS-opsonisierten Parasiten im Vergleich zu nicht-opsonisierten Parasiten infiziert waren. Die Spezifität dieser natürlichen IgG in Maus- und Humanserum ist bisher unklar. Es ist verlockend zu spekulieren, dass dies auch Antikörper sind, die PS auf Parasitenoberflächen erkennen, da sie bevorzugt an Amastigoten mit bekanntermaßen höherer PS-Exposition im Vergleich zu Promastigoten binden.

Wir fanden heraus, dass das Serum gesunder menschlicher Kontrollpersonen (aus einer Region, in der Leishmaniose nur als Reisekrankheit und ohne Vorgeschichte einer früheren Infektion gemeldet wird) auch IgG enthielt, das in der Lage war, an L. major-Amastigoten zu binden und eine verstärkte Aufnahme von Parasiten durch DC zu fördern. Es ist wichtig zu beachten, dass das für unsere Studie verwendete IVIG in Deutschland hergestellt wird (nicht endemisch für Leishmaniose). Interessanterweise enthielt angereichertes menschliches IgG aus IVIG von Leishmania-negativen Personen somit IgG, das in der Lage war, sowohl Promastigoten als auch (wahrscheinlich aufgrund einer höheren PS-Exposition) L. major-Amastigoten zu binden. Dementsprechend enthielt das Serum von APS-Patienten mit hohen Konzentrationen an Antiphospholipid-Antikörpern IgG, das vorzugsweise an Amastigoten und weniger an Promastigoten band. Sowohl IgG aus APS-Seren als auch IgG aus IVIG förderten die verstärkte Aufnahme von Parasiten durch primäre menschliche DC in einem Ausmaß, das vergleichbar (oder sogar besser im Fall von PL-enthaltenden APS-Seren) mit dem aus Immunserum stammenden IgG von Leishmaniose-Patienten war.

Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass sowohl normale Maus- als auch Menschenseren, selbst von Personen, die nie Leishmania ausgesetzt waren, IgG-Antikörper enthalten, die in der Lage sind, an diesen Parasiten zu binden, seine Aufnahme durch DCs zu erleichtern und eine schützende Immunantwort des Parasiten zu verstärken Gastgeber. Obwohl das/die erkannte(n) Leishmania-Antigen(e) nicht vollständig klar ist/sind, kann ein Teil der Reaktivität gegen Phospholipide gerichtet sein, die auf Amastigoten-Oberflächen häufiger vorkommen als auf Promastigoten-Oberflächen. Unsere Ergebnisse könnten den Weg für die Entwicklung einer besseren Therapie für diesen Parasiten ebnen und sogar als erste Vorsorgemaßnahme für Personen dienen, die in Leishmania-infizierte Gebiete reisen.

Danksagungen

Die Autoren danken Mark C. Udey und Philipp von Landenberg herzlich für die hilfreichen Diskussionen und die Bereitstellung von Patientenproben.

Autorenbeitrag 

FD, SLK und ST führten die in diesem Manuskript beschriebenen Experimente durch. ST, AW und EvS sicherten die Finanzierung des Projekts und begleiteten die Arbeiten. AW und EvS haben das Manuskript verfasst.

Finanzierung

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Die Studie wurde gefördert durch Mittel der DFG (SFB 490 an EvS und AW und SFB 1292 an EvS, AW und ST) und des Centrums für Molekulare Medizin (CMMC) Köln an EvS.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien 

Unzutreffend.

Erklärungen

Ethik-Zustimmung und Zustimmung zur Teilnahme

Alle Experimente mit Mäusen wurden nach den Vorgaben des Landes Rheinland Pfalz durchgeführt.

Zustimmung zur Veröffentlichung

Alle Autoren stimmen der Veröffentlichung zu.

Konkurrierende Interessen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

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