Die Deletion von Alox15 verbessert die Nierenfunktionsstörung und hemmt Fbrose durch erhöhte PGD2 in der Niere
Mar 12, 2022
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENINFEKTIONEN VERBESSERN
Einführung
Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) und ihre Metaboliten sind mit Entzündungen und deren Auflösung in mehreren Organen verbunden [1]. Oxylipine, die durch die Oxidation von PUFA produziert werden, sind wichtig für die biologische Aktivität von PUFA als Lipidmediatoren [1, 2]. Die Biosynthese von Oxylipinen wird durch mehrere Enzyme wie Lipoxygenase (LOX), Cyclooxygenase (COX) und Cytochrom P450 (CYP) vermittelt [3]. Diese Enzyme produzieren mehrere Lipidmetaboliten wie Prostaglandine, Leukotriene und Lipoxine, die alle stark an der Regulation von Entzündungen beteiligt sind [1, 4]. Zum Beispiel hat ALOX15, ein wichtiger Subtyp von LOX, durch seine Metaboliten einen doppelten Aspekt von entzündungsfördernden und entzündungshemmenden Eigenschaften [5]: ALOX15 wird in Eosinophilen, bronchoalveolären Epithelzellen und alveolären Makrophagen unter nichtpathologischen Bedingungen stark exprimiert [5, 6 ] und fördert die Schwere von Asthma [7], Lungenverletzungen [8] und Herzinsuffizienz [9], während es Entzündungen bei Arthritis [10] und ischämischem Gehirn entgegenwirkt [11]. Zusätzlich beeinflussen Lipidmediatoren und ihre Enzyme Organfibrose sowie Entzündungen. Spezifische Lipidmediatoren sind an der Pathogenese von Lungen- [12], Leber- [13] und Herzfibrose [14] beteiligt. In ähnlicher Weise ist das oben erwähnte ALOX15 auch mit der Pathogenese von Fibrose wie dermalen Fibrose verbunden [15].
Eine der häufigsten chronischen Krankheiten ist chronisch Nierenerkrankung(CKD), die etwa 8–16 Prozent der Allgemeinbevölkerung in allen Stadien zusammen betrifft [16]. Obwohl die CNE-Pathogenese komplex ist und je nach zugrunde liegender Erkrankung variiert, ist dieNiereGewebe wird im Allgemeinen dysfunktional, was zum Endstadium führtNierenversagenverursacht durch chronische Entzündung und nachfolgende Fibrose [17]. Wie bereits erwähnt, sind von PUFAs abgeleitete Lipidmediatoren stark mit Entzündungen und der daraus resultierenden Fibrose verbunden. Beispielsweise hemmen Lipoxine und Resolvine die Nierenfibrose [18, 19], aber diese Effekte werden noch nicht im CKD-Modell mit Beeinträchtigung untersuchtNierenfunktion.Darüber hinaus umfassende lipidomische Profile bei CKDNiereGewebe sind noch nicht gemeldet. Daher ist die Rolle von Enzymen des Lipidstoffwechsels und ihrer Produkte in der CNE-Pathogenese noch wenig verstandenDiese Studie zielte darauf ab, die Beteiligung von fettsäuremetabolisierenden Enzymen und ihren Produkten an der Fettsäure aufzuklärenNieren-Beeinträchtigung von 5/6 nephrektomierten (Nx) CNE-Modellmäusen. Diese Studie ergab, dass sowohl die Transkriptions- als auch die Proteinexpressionsniveaus von Alox15 bei CKD erhöht warenNierenund Alox15–/–-Mäuse zeigten eine VerbesserungNiereDysfunktion und Fibrose im CKD-Modell. Darüber hinaus PGD2, das ist der erhöhte Lipidmetabolit in der CKDNierenvon Alox15–/–-Mäusen, hemmten den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) in proximalen tubulären kultivierten Zellen. Daher könnten die Hemmung von Alox15 und/oder die Verabreichung von PGD2 ein neues therapeutisches Ziel für CKD und Fibrose sein.
Schlüsselwörter:chronisches Nierenleiden; Lipoxygenase; ALOX15; Mediator Lipidomik; Polyungesättigten Fettsäuren; Nieren-
CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN
Materialen und Methoden
Tiere und ExperimenteIn dieser Studie wurden 8- Wochen alte männliche C57BL/6 J-Mäuse (CLEA Japan) verwendet, die eine Woche lang akklimatisiert wurden, bevor alle Experimente durchgeführt wurden. Darüber hinaus wurden Alox15–/–-Mäuse im C57BL/6 J-Hintergrund (Jackson Laboratory) erzeugt, und das 5/6 Nx-Modell wurde gemäß einer früheren Studie etabliert [20]. Wir haben Blutproben zur Auswertung entnommenNierenfunktionundNiereGewebeproben für Immunoblotting und Polymerase-Kettenreaktion nach 8 Wochen nach 5/6 Nx und zur histologischen Analyse nach 40 Wochen nach 5/6 Nx. Alle Experimente entsprachen den Richtlinien für Tierversuche von TMDU, und das Animal Care and Use Committee von TMDU genehmigte unser Studienprotokoll (Genehmigungsnummer: A2019-117C4).
LC–MS/MS-basierte Mediator-LipidomikWir führten eine LC-MS/MS-Analyse wie zuvor beschrieben durch [21, 22]. Einzelheiten des Verfahrens sind in Ergänzende Methoden beschrieben.Andere experimentelle MethodenWir haben andere experimentelle Methoden in Ergänzende Methoden beschrieben.
Ergebnisse
Der mRNA-Spiegel von Alox15 hat sich in 5/6 Nx-Nieren erhöhtDie quantitativen Veränderungen von Oxylipin-Enzymen bei der CKDNierewurden untersucht, indem C57BL/6-Mäuse einer Scheinoperation oder 5/6 Nx wie zuvor beschrieben unterzogen wurden [20]. Um die Expression der wichtigsten Oxylipin-Enzyme zu analysieren, die in der Niere exprimiert werden (Alox15, Alox5, Ptgs1 (COX1), Ptgs2 (COX2), Cyp4a12 und Cyp2c44) [23, 24], haben wir extrahiertNiereProben. Unter den Enzymen Alox15 in 5/6 NxNierenhatte einen signifikant erhöhten mRNA-Spiegel (P=0.0004) im Vergleich zu dem in der ScheinprobeNieren(Abb. 1). Umgekehrt veränderten sich die mRNA-Spiegel der anderen Hauptenzyme in diesem CKD-Modell nicht signifikant.
Der Proteinspiegel von Alox15 war in proximalen Tubuluszellen der Niere erhöhtIn 5/6 NxNieren, waren die ALOX15-Proteinspiegel ebenfalls erhöht (P=0.0078), wie von erhöhten Transkriptionsspiegeln erwartet (Abb. 2a). Um zu bestimmen, welche Zelltypen bei der CNE einen erhöhten Alox15-Proteinspiegel aufwiesenNiere,wir untersuchten die Lokalisierung von Alox15-mRNA durch In-situ-Hybridisierung. In-situ-Hybridisierung an mRNA zeigte, dass das hohe Expressionsniveau von Alox15 lokalisiert warNieren-tubuläre Zellen im 5/6 Nx-Modell, aber nicht in Glomeruli (Abb. 2b). Histologische Merkmale legten nahe, dass Alox15-mRNA in den proximalen Tubuli stark exprimiert wurde.
Alox15–/–-Mäuse waren im 5/6-Nx-Modell resistent gegen Nierenschäden und FibroseIn 5/6 Nx CKDNierenwaren die Transkriptions- und Proteinexpressionsniveaus von ALOX15 erhöht. Daher haben wir untersucht, ob und wie ALOX15 bei CKD eine Rolle spielt im Hinblick aufNiereDysfunktion und Nierenfibrose. Zu diesem Zweck wurden Alox15–/–-Mäuse auf das 5/6 Nx CKD-Modell angewendet. Interessanterweise waren die Serum-Cre- und Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN)-Spiegel bei Alox15−/− 5/6 Nx-Mäusen niedriger
als die in Wildtyp (WT)-Mäusen (Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass die Alox15-Depletion eine schützende Wirkung auf die CNI-Pathogenese zeigte. Dementsprechend ist NGAL (aNierenschädenMarker)-Proteinexpression wurde in Alox15–/–-Mäusen im Vergleich zu der in WT-Mäusen unterdrückt (Abb. 3b). Außerdem Alox15−/− MausNierenzeigten verringerte Col1a1-, Fn- und Acta2 (SMA)-mRNA-Spiegel (Fig. 3c) und zeigten auch eine verringerte Fibronectin- und SMA-Proteinexpression (Fig. 3d). Außerdem Alox15−/− MausNierenzeigten deutlich unterdrückte interstitielle fibrotische Veränderungen, die in der Masson-Trichrom-Färbung gezeigt werden (Fig. 3e). Daher verbessert sich die Alox15-DeletionNiereDysfunktion und Fibrose im CNE-Tiermodell.
Die Mediator-Lidomomik zeigte einen veränderten PUFA-Metabolismus in Alox15−/− CKD-NierenWie im Einführungsabschnitt dieser Veröffentlichung erwähnt, hängen die biologischen Wirkungen von Alox15 mit den von Alox15 erzeugten Lipidmediatoren zusammen. Um das Profil von Lipidmetaboliten aufzuklären, die von Alox15 in der CKD produziert werdenNiere,Wir haben den Schein und 5/6 Nx untersucht und verglichenNiereProben durch LC-MS / MS-basierte Mediator-Lipidomik zur Bestimmung der Lipidmediatorprofile zwischen WT-Mäusen und Alox15–/– CKD-Mäusen (Ergänzungstabelle 1). Tabelle 1 zeigt Lipidmetabolite, die zwischen Alox15 plus/plus- und Alox15–/–-Mäusen unter 5/6 Nx-Bedingungen signifikant unterschiedlich waren. Darüber hinaus haben wir Wegkarten von Lipidmediatoren mit Klassifizierung nach ihren Substraten und ihren metabolisierenden Enzymen erstellt (Abb. 4). Eine Reihe von Alox15--abgeleiteten PUFA-Metaboliten wie 14-HDoHE, 17-HDoHE und 15-HEPA [5, 25–27] war in korrelierenden CKD-Modellen signifikant erhöht gut auf das erhöhte Niveau der ALOX15-Expression in derNieren (P=0.0018, 0.0008,<0.0001, respectively),="" and="" their="" elevations="" under="" ckd="" conditions="" were="" completely="" suppressed="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 5).="" besides="" 14-hdohe,="" 17-hdohe,="" and="" 15-hepa,="" the="" levels="" of="" 18-hepa,="" 10-hdohe,="" 11-hdohe,="" 13-hdohe,="" 16-hdohe,="" and="" dgla="" were="" also="" significantly="" decreased="" in="" alox15−/−="" ckd="">Nierenverglichen mit denen in WT-CNI-Nieren, während nur PGD2 in Alox15–/–-CNI-Nieren signifikant erhöht war (Abb. 6).
PGD2 unterdrückte EMT in kultivierten NierenzellenDie Wirkungen von Lipidmetaboliten, die zwischen Alox15 plus / plus- und Alox15−/− -Mäusen unter 5/6 Nx-Bedingungen signifikant unterschiedlich waren, wurden untersucht, indem diese Lipide an NRK-52E-Zellen verabreicht wurden, die durch das profibrotische Zytokin TGF aktiviert wurden - 1. Wir untersuchten die mRNA-Expression von Cola1a und Acta2 (SMA) als Antwort auf TGF- 1, um die Wirkungen dieser Lipide in Kultur zu bestimmen (Fig. 7a). Unter diesen verlieh PGD2 eine starke antifibrotische Wirkung auf NRK-52-E-Zellen als Antwort auf TGF- 1. Die unterdrückende Wirkung von PGD2 auf die COL1A1- und SMA-Expression war dosisabhängig mit EC50 von 7,12 μM bzw. 6,48 μM (Abb. 7b). Zusätzlich führten wir die gleichen Experimente in HK-2-Zellen durch, bei denen es sich um immortalisierte Epithelzellen des proximalen Tubulus eines normalen erwachsenen Menschen handeltNieren,und fanden ein ähnliches Ergebnis, d. h. eine dosisabhängige Hemmung von COL1A1 und SMA, als Reaktion auf die Behandlung mit PGD2 (Abb. 7c). Daher erhöhte PGD2-Spiegel bei Alox15−/− CKDNierenkann zu den antifibrotischen Wirkungen bei CKD beitragen.
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN
15‑PGDH, ein wichtiges PGD2‑metabolisierendes Enzym, war in Alox15−/− CNE-Nieren reduziertZur Klärung des Mechanismus des Anstiegs der PID2 in derNierenvon Alox15−/− CKD-Modellmäusen haben wir den mRNA-Spiegel der PGD2-Synthase gemessen. PGD2-Synthase (PGDS) hat zwei Isoformen: Lipocalin-PGDS (L-PGDS) und hämatopoetische PGDS (H-PGDS) [28]. Sowohl die L-PGDS- als auch die H-PGDS-Spiegel waren unter 5/6 Nx-Bedingungen im Vergleich zu denen unter Scheinbedingungen signifikant erhöhtNierenvon WT-Mäusen (Abb. 8a, beide P<0.0001) indicating="" that="" increased="" pgd2="" in="" ckd="" is="" due="" to="" increased="" pgd2="" synthases.="" conversely,="" the="" increase="" in="" l-pgds="" and="" h-pgds="" under="" 5/6="" nx="" conditions="" was="" significantly="" inhibited="" in="" alox15−/−="" mice="" (fig. 8a)="" indicating="" that="" the="" increase="" in="" pgd2="" in="" alox15−/−="" ckd="" model="" mice="" was="" not="" due="" to="" increased="" production="" by="" pgds.="" then,="" we="" examined="" mrna="" levels="" of="" cox-1="" and="" cox-2="" as="" more="" upstream="" synthases="" of="" the="" prostaglandin-producing="" pathway.="" we="" also="" measured="" mrna="" levels="" of="" 15-pgdh="" and="">1C18, die bekanntermaßen wichtige PGD2--metabolisierende Enzyme sind [29, 30]. Während die mRNA-Spiegel von COX-1, COX-2 und AKR1C18 unverändert waren, war der mRNA-Spiegel von 15-PGDH bei CKD signifikant reduziertNierenvon Alox15–/–-Mäusen im Vergleich zu denen von WT-Mäusen (Abb. 8b, P=0.0325), was möglicherweise zu einem Anstieg von PGD2 bei CNI führtNierenvon Alox15−/− Mäusen.
Diskussion
Diese Studie hat gezeigt, dass bei CKDNiereProben wurden sowohl die Transkriptions- als auch die Proteinspiegel von Alox15 erhöht, undNiereDysfunktion und Fibrose wurden bei Alox15–/–-Mäusen gebessert. Darüber hinaus ergab die LC-MS/MS-basierte Mediator-Lipidomik, dass Alox15–/– CKD-MausNierenhatten im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant erhöhte PGD 2-Spiegel. PGD2 hemmte die EMT von NRK-52E- und HK-2-Zellen; daher kann eine PGD2-Erhöhung zur Resistenz von Alox15–/–-Mäusen beitragenNierenverletzungund Fibrose. Die Beziehung zwischenNierenkrankheitund Lipidprofile unter Verwendung von Lipidomik an menschlichem Serum oder Plasma wurden ausführlich untersucht [31–33], aber nicht anNiereGewebe. Obwohl nur wenige Berichte über Lipidomik unter Verwendung von CNE-Tiermodellen vorliegen [34–36], führten alle diese Studien Lipidomik an Plasmaproben aus einem CNI-Tiermodell durch; jedoch keine umfassende Lipidomik aufNiereGewebe aus dem CKD-Modell wurden bisher gemeldet. Direkte Lipidomik auf Gewebe ist ebenso effektiv wie Plasmaproben, um funktionelle Metaboliten zu identifizieren. Darüber hinaus sind Metabolitenveränderungen in Geweben sowie Blutproben je nach Organ erheblich unterschiedlich [20]. In der vorliegenden Studie analysierten wir gründlich das Profil von PUFA-abgeleiteten Lipidmediatoren in derNiereGewebe eines CKD-Tiermodells.
Diese Studie konzentrierte sich auf ALOX15, eines der wichtigsten Enzyme, die PUFAs metabolisieren. In dieser Studie waren sowohl die Protein- als auch die mRNA-Expressionsniveaus von ALOX15 bei CKD deutlich erhöhtNieren. Wir befassten uns mit den Zelltypen, die für die ALOX15-Expression bei CNE verantwortlich sindNieren,und durch In-situ-Hybridisierung fanden wir eine erhöhte Expression von ALOX15-mRNA inNieren-Röhrenzellen im Modell 5/6 Nx.
ALOX15 ist an chronischen Krankheiten wie Atherosklerose beteiligt, und seine Deletion in Tierkrankheitsmodellen verbessert diese Krankheiten [5]. In Bezug auf die Assoziation von ALOX15 mitNierenkrankheit, wird die Proteinurie bei Alox15–/–-Mäusen unter glomerulärer Verletzung durch ein Streptozotocin-induziertes diabetisches Nephropathiemodell verringert [37]. Dieses Diabetes mellitus-Mausmodell zeigt jedoch keinen Rückgang derNierenfunktion; Somit ist der Mechanismus, wie ALOX15 mit beeinträchtigt verbunden istNierenfunktionbei CKD-Modellen ist unklar geblieben. In der vorliegenden Studie fanden wir unter Verwendung des 5/6 Nx-Mausmodells heraus, dass sich die ALOX15-Deletion verbesserteNiereFunktionsstörungen uNieren-Fibrose in einem CKD-Modell. Bisher sind nur IL-4 und IL-13 in Monozyten als regulatorische Faktoren bekannt, die die Expression von ALOX15 direkt erhöhen [5]. Es bleibt jedoch unklar, was ALOX15 in erhöhtNieren-tubuläre Zellen. Es ist bekannt, dass eine Vielzahl von Zytokinen und urämischen Toxinen im Plasma und in den Nieren bei CKD erhöht sind [38, 39]. Darunter könnten neue Regulatoren von ALOX15 sein. Weitere Studien sind erforderlich, um die wichtigsten regulatorischen Faktoren von ALOX15 bei CKD aufzuklären. In unseren Studien zur Identifizierung spezifischer intervenierender Oxylipine, die die Alox15-Deletion mit ihrer renoprotektiven Wirkung im 5/6-Nx-Modell in Verbindung bringen, fanden wir heraus, dass PGD2 möglicherweise an der Resistenz gegen Alox15 beteiligt istNierenschädenverursacht durch ALOX15-Deletion. Als allgemeines Verständnis zum Generieren von PGD2, COX-1 und
CCOX-2 produziert PGG2 aus Arachidonsäuren, die dann in PGH2 umgewandelt werden. Wenn PGH2 durch PGD2-Synthase (PGDS) metabolisiert wird, wird PGD2 produziert [28]. PGDS hat zwei genetisch unterschiedliche Isoformen, nämlich PGDS vom Lipokalintyp (L-PGDS) und PGDS vom hämatopoetischen Typ (H-PGDS) [28]. Obwohl PGD2 in der Alox15−/− CKD-Maus erhöht warNieren, weder L-PGDS noch H-PGDS war in der Alox15–/– CKD-Maus erhöhtNieren, trotz des großen Anstiegs von PGDS in der WT-CNI-MausNieren(Abb. 8a). Darüber hinaus zeigten wir auch, dass weder COX-1 noch COX-2 in den Alox15−/− CKD-Mausnieren erhöht waren (Abb. 8b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Anstieg von PGD 2 in den Nieren der Alox15−/− CKD-Mäuse nicht auf einen Anstieg der Synthasen zurückzuführen war, sondern auf die erhöhte Substratverfügbarkeit oder die Hemmung des Abbaus, und tatsächlich haben wir eine Verringerung von {{ 7}}PGDH, eines der wichtigsten PGD2-metabolisierenden Enzyme [29], in den Alox15−/− CKD-Mausnieren (Abb. 8b). Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den Grund aufzuklären, warum die Deletion von Alox15 zu einer Abnahme von 15-PGDH führt.
Wie oben erwähnt, könnte PID2 an der Resistenz beteiligt seinNierenverletzungverursacht durch ALOX15-Verlust. In dieser Studie hemmte PGD2 EMT durch TGF- 1 in NRK-52E- und HK-2-Zellen, die proximale tubuläre Zellen darstellen. PGD2 bindet an zwei verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, nämlich DP1 und DP2, deren Funktionen unterschiedlich sind [28]. In unseren In-vitro-Experimenten war PGD2 jedoch bei Konzentrationen im Bereich von 4 bis 32 μM wirksam, was relativ hoch ist, wenn man bedenkt, dass die Ki-Werte von DP1 und DP2 1,7 nM bzw. 2,4 nM betragen [28]. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass PGD2 möglicherweise antifibrotische Wirkungen nicht über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, sondern über andere Wege wie PPAR ausübt, über die bekannt ist, dass 15-d-PGJ2, ein nachgeschalteter PGD2-Metabolit, seine Wirkung ausübt [28]. In dieser Studie, die sich auf Lipidstoffwechselenzyme und ihre Metaboliten konzentriert, könnte die ALOX15-Hemmung und/oder PGD2-Verabreichung ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für CKD sein. Leider wurde kein ALOX15-spezifischer Inhibitor entwickelt, der in der klinischen Praxis eingesetzt werden kann [40, 41]. Therapeutisches Targeting nachgeschalteter funktioneller Metaboliten wie PGD2 anstelle der Hemmung von Fettsäure metabolisierenden Enzymen, die verschiedene Metaboliten beeinflussen, könnte eine neue ideale CKD-Therapie sein.
CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/RENALE DIALYSE VERBESSERN