Die Löschung von MiR-29b2/c führt zu beschleunigtem Altern und Neuroprotektion bei MPTP-induzierten Parkinson-Mäusen

Abstrakt

Studien zeigen einen Zusammenhang zwischen miR-29s im Alter und der Parkinson-Krankheit (PD). Hier zeigen wir, dass die Serumspiegel von miR-29s in 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP)-induzierte PD Mäuse zeigten dynamische Veränderungen. Die Rolle von miR-29b2/c beim Altern und bei Parkinson wurde unter Verwendung von miR-29b2/c-Gen-Knockout-Mäusen (miR-29b2/c KO) untersucht. miR-29b2/c KO-Mäuse zeichneten sich im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen (WT) durch deutlich geringeres Gewicht, Kyphose, Muskelschwäche und abnormalen Gang aus. Der WT entwickelte außerdem eine offensichtliche Verdickung der Dermis und eine Verringerung des Fettgewebes. Ein Mangel an miR-29b2/c linderte jedoch MPTP-induzierte Schäden des dopaminergen Systems und der Gliaaktivierung im nigrostriatalen Signalweg und verbesserte folglich die motorische Funktion von MPTP-behandelten KO-Mäusen. Das Ausschalten von miR-29b2/c hemmte die Expression von Entzündungsfaktoren in mit 1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP plus) behandelten Primärkulturen von gemischten Gliazellen, primären Astrozyten oder LPS-behandelten Kulturen primäre Mikroglia. Darüber hinaus steigerte ein miR-29b2/c-Mangel die Aktivität von AMPK, unterdrückte jedoch die NF-κB p65-Signalübertragung in Gliazellen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass miR-29b2/c KO-Mäuse den Progerie-ähnlichen Phänotyp aufweisen. Weniger aktivierte Gliazellen und unterdrückte Neuroinflammation könnten bei miR- 29b2/c KO-Mäusen eine dopaminerge Neuroprotektion hervorrufen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass miR-29b2/c an der Regulierung des Alterns beteiligt ist und eine schädliche Rolle bei der Parkinson-Krankheit spielt.

Schlüsselwörter

MiR-29b2/c; Neuroprotektion; MPTP-induzierte Parkinson-Krankheit;Cistanche-Vorteile.

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Einführung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung, die durch den fortschreitenden Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra par compacta (SNpc) des Mittelhirns sowie eine erhöhte Glia-Aktivierung und Neuroinflammation gekennzeichnet ist [1–3]. MicroRNAs sind kurze nichtkodierende RNA-Moleküle, die die Genexpression auf der posttranskriptionellen Ebene regulieren [4, 5]. MicroRNAs sind an der Regulierung der Entwicklung des Nervensystems, der neuronalen Plastizität und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Die MicroRNA29-Familie (miR- 29s) besteht aus zwei Genclustern: miR-29a/b1 und miR-29b2/c, die sich auf Chromosom 6 bzw. Chromosom1 befinden das Mausgenom. miR-29a und miR-29c weisen nur einen Nukleotidunterschied auf, wohingegen miR-29b1 und miR-29b2 in der Sequenz identisch sind [6]. miR-29s sind an mehreren biologischen Prozessen beteiligt. Viele Zielgene von miR-29 wurden experimentell verifiziert, darunter die Procell-Überlebensgene Bcl-2, Mcl-1, Cdc42 und p85-; proapoptotische Gene Puma, Bim, Bak und Bmf; und proinflammatorische Zytokine IFN- und IL-12. Im peripheren System haben Studien gezeigt, dass miR-29s an der Gewebefibrose [7–9], dem Stoffwechsel und der Immunregulation beteiligt sind [10–13].

miR-29s kommen im Zentralnervensystem weit verbreitet vor und ihre Transkripte kommen sowohl in Neuronen als auch in Gliazellen vor [14, 15]. Der Zusammenhang zwischen miR-29s und neurologischen Erkrankungen wird immer deutlicher. miR-29s sind an der Regulierung der Amyloidproduktion beteiligt und werden im Gehirn von AD-Patienten herunterreguliert [16, 17]; Die miR-29s-Spiegel sinken auch bei Patienten mit Huntington-Krankheit (HD) und Huntington-Modellmäusen [18, 19], wohingegen sie bei Patienten mit Amyotropher Lateralsklerose (ALS) und ALS-Mausmodellen ansteigen [16, 20]. Sowohl miR-29a/b-1--defiziente als auch miR-29s-herunterregulierte Mäuse weisen einen Ataxie-ähnlichen Phänotyp auf [6, 21]. Bezüglich der Auswirkungen der miR-29-Expression auf die Neuroprotektion und die Förderung des neuronalen Todes in ischämischen Nagetiermodellen wurden gegensätzliche Ergebnisse berichtet [22, 23]. In früheren Studien haben wir beobachtet, dass die miR-29s-Spiegel im Serum von Parkinson-Patienten deutlich verringert waren, mit abnehmender Tendenz im Zusammenhang mit schwererem Parkinsonismus [24]. Darüber hinaus korrelierten die miR-29s-Werte mit der Gedächtnisleistung bei PD-Patienten [25]. Wir kamen zu dem Schluss, dass miR-29b2/c eng mit der Parkinson-Krankheit verbunden ist, seine physiologischen Funktionen und pathologischen Mechanismen bei der Parkinson-Krankheit sind jedoch weitgehend unbekannt.

In dieser Studie wurden die Serumspiegel von miR-29s bei Mäusen als Reaktion auf die MPTP-Verabreichung bis zu 120 Tage nach der Injektion gemessen. Die Auswirkungen von miR-29b2/c-Mängeln auf das periphere Gewebe wurden unter Verwendung von miR-29b2/c-KO-Mäusen untersucht. Das dopaminerge Neurotoxin MPTP wurde außerdem verwendet, um ein Mausmodell der Parkinson-Krankheit zu induzieren. Anschließend wurden Verletzungen des nigrostriatalen dopaminergen Systems, die Verhaltensleistung und mögliche Mechanismen untersucht. Wir beobachteten, dass die miR-29s-Spiegel im Mäuseserum nach der MPTP-Verabreichung dynamische Veränderungen aufwiesen. miR- 29b2/c KO-Mäuse zeigten eine beschleunigte Alterung, was durch ein geringeres Körpergewicht, eine Reduzierung des Fettgewebes, Kyphose, Hautverdickung, Muskelschwäche und Ganganomalien angezeigt wurde. Ein Mangel an miR-29b2/c führte jedoch zu einer Linderung der dopaminergen Schädigung und Gliaaktivierung und folglich zu einer verbesserten Verhaltensleistung in einem PD-ähnlichen Tiermodell.

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Ergebnis

1. Der Progerie-ähnliche Phänotyp in miR-29b2/c KO-Mäusen

miR-29b2/c-Knockout-Mäuse (miR-29b2/c KO) wurden mit der CRISPR-Cas9-Technik erzeugt. Die Strategie des Gen-Targetings und der Mutanten-Maus-Genotypisierung wurde in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Vier und 16- Monate alte miR-29b2/c-KO-Mäuse hatten ein verringertes Körpergewicht (Abbildung 1A). Im Alter von drei Monaten blieben die Merkmale von miR-29b2/c KO-Mäusen unverändert, wie durch einen Röntgen-Mikrocomputertomographie-Scan (Mikro-CT) nachgewiesen wurde (ergänzende Abbildung 2A). Es gab keine Unterschiede in der Knochenmineraldichte (BMD), der mittleren BMD der Trabekel, der Trabekeltrennung, der Trabekeldicke und dem Strukturmodellindex (SMI) zwischen miR-29b2/c-KO-Mäusen und ihrem WT-Gegenstück im Alter von 13 Monaten ( Ergänzende Abbildung 2B). Durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) stellten wir fest, dass 13-Monate alte miR-29b2/c-KO-Mäuse eine verdickte Dermis mit erhöhten und tieferen Falten aufwiesen (Abbildung 1B, 1C). Und Kyphose war bei 16-Monate alten miR-29b2/c KO-Mäusen erkennbar (Abbildung 1C). miR-29b2/c KO-Mäuse hatten in jungen Jahren (3 Monate alt) normales Fettgewebe (Ergänzende Abbildung 2C, 2D). Allerdings waren das Bauchfettgewebe (subkutanes Fett und viszerales Fett zusammen) und das braune Fettgewebe bei miR-29b2/c KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen im Alter von 16 Monaten dramatisch reduziert (Abbildung 1D). Darüber hinaus wurden die Transkriptionsniveaus der Seneszenzmarker p21 und p53 im Gehirn analysiert. Sie nahmen im Hippocampus deutlich zu, nicht jedoch im Kortex von miR-29b2/c KO-Mäusen im Alter von sechs Monaten. Die p53- und p16-Proteinspiegel im miR-29b2/c-defizienten Hippocampus unterschieden sich nicht von den WT-Kontrollen. Darüber hinaus unterschied sich die -Galactosidase-Aktivität, ein bekanntes Merkmal der zellulären Seneszenz, nicht zwischen den Gehirnen von drei Monate alten WT- und miR-29b2/c KO-Mäusen.

Muskelschwäche und Ganganomalie bei miR- 29b2/c KO-Mäusen

Das Verhalten von miR-29b2/c-defizienten Mäusen wurde bewertet. Die Muskelkraft wurde durch den Wire-Hanging- und den Grid-Hanging-Test gemessen. Die miR-29b2/c KO-Mäuse schnitten im Wire-Hanging-Test schlechter ab als die Kontrollmäuse (Abbildung 2A). Und die Latenzzeit bis zum Abfall war bei miR-29b2/c-KO-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Gegenstücken im Grid-Hanging-Test (Abbildung 2B) deutlich kürzer, aber die Rotarod-Testleistung von WT und miR{{10} }b2/c KO-Mäuse unterschieden sich nicht signifikant (Abbildung 2C). Der Gang der Tiere wurde mit dem Catwalk XT-Analysesystem erkannt. Überraschenderweise waren sowohl die Geschwindigkeit als auch die Schrittlänge von miR-29b2/c-KO-Mäusen höher als die ihrer Gegenstücke, während bei miR{ der Schrittzyklus, die Stand- und Schwungzeit kürzer und der Arbeitszyklus kürzer waren. {15}} b2/c-defiziente Mäuse (Abbildung 2D).

Veränderungen von miR-29s im MPTP-induzierten PD-Mausserum

Die miR-29s-Spiegel sanken im Serum von Patienten mit Parkinson im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen [24]. In dieser Studie wurden die miR-29s-Spiegel im Serum von PD-Mäusen 3, 30 und 120 Tage nach der Verabreichung einer subakuten MPTP-Therapie quantifiziert. Die miR-29a- und miR{7}}b-Spiegel sanken 3 Tage nach der Injektion, erholten sich nach 30 Tagen auf die Ausgangswerte und sanken nach 120 Tagen erneut. Der miR-29c-Wert änderte sich jedoch nicht wesentlich (ergänzende Abbildung 5).

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miR-29b2/c-Mangel lindert MPTP-induzierte nigrostriatale Verletzungen und motorische Defizite bei Mäusen

miR-29b2/c-Knockout-Mäusen und den WT-Wurfgeschwistern wurde MPTP injiziert, um das PD-Modell zu induzieren. Die Expressionsniveaus von p21, p53 und Pai1 im Striatum sowohl von miR-29b2/c-KO-Mäusen als auch von WT-Kontrollen änderten sich nach der MPTP-Verabreichung nicht. Die MPTP-Exposition verursachte eine signifikante Reduktion der TH-positiven dopaminergen Neuronen im SNpc [F(1, 20)=5.441, P=0.0302] und der TH-positiven Nervenendigungen, TH-Proteine [F(1, 20)=10.5, P=0.0041] und die Spiegel von Dopamin, DOPAC und HVA im Striatum (Abbildung 3A–3D). Allerdings wurden die nigrostriatalen Verletzungen bei MPTP-behandelten miR-29b2/c-KO-Mäusen im Vergleich zu MPTP-behandelten WT-Kontrollen dramatisch gelindert, da die Anzahl der dopaminergen Neuronen, die Dichte der dopaminergen Nervenendigungen und die striatalen TH-Proteinspiegel verbessert wurden die Dopaminkonzentration war deutlich höher; Darüber hinaus wurden Änderungen in den Verhältnissen von DOPAC zu DA und HVA zu DA [F(1, 19)=12.64, P=0.0021] deutlich abgeschwächt (Abbildung 3A–3D). Bei miR-29b2/c KO-Mäusen, denen normale Kochsalzlösung injiziert wurde, stiegen die striatalen Konzentrationen von 5-HT und seinem Metaboliten 5-HIAA im Vergleich zu ihren WT-Gegenstücken, und die NE-Konzentrationen lagen nahe beieinander Wildtyp- und miR-29b2/c-KO-Mäuse (Abbildung 3D). Der Rearing- und der Pole-Test wurden verwendet, um die spontane vertikale Aktivität [26, 27] bzw. die Bewegungsaktivität von Mäusen [28] zu bewerten. Zwei Tage nach der letzten MPTP-Injektion nahm die Aufzuchthäufigkeit bei WT-Mäusen während der letzten 2 Minuten im Vergleich zu mit normaler Kochsalzlösung behandelten WT-Kontrollen ab. Ähnliche Experimente zeigten keinen Einfluss des miR- 29b2/c-Mangels auf MPTP-induzierte Veränderungen der Aufzuchthäufigkeit (Abbildung 3E). In ähnlicher Weise erhöhte sich die Gesamtzeit, die für das Drehen und Herunterklettern aufgewendet wurde, bei WT-Mäusen nach der MPTP-Verabreichung im Pole-Test, während die Gesamtzeit zwischen normalen, mit Kochsalzlösung behandelten und mit MPTP behandelten miR-29b2/c-KO-Mäusen nahe beieinander lag (Abbildung 3F). .

Ein miR-29b2/c-Mangel schwächt die MPTP-induzierte Glia-Aktivierung bei Mäusen ab

Gliazellaktivierung und Gliazell-vermittelte Neuroinflammation sind an der PD-Pathologie beteiligt [29]. Astrozyten nahmen im nigrostriatalen Signalweg von WT-Mäusen deutlich zu, wohingegen GFAP plus Astrozyten im Striatum, jedoch nicht im SNpc [F(1, 8)=5.412, P=0.0484] von miR zunahmen -29b2/c KO-Mäuse drei Tage nach der MPTP-Injektion. Bemerkenswerterweise unterschieden sich die Astrozytendichten in den beiden Regionen der mit MPTP behandelten WT- und miR-29b2/c-KO-Mäuse nicht (Abbildung 4A, 4B). Iba 1 plus Mikroglia stieg in der Substantia nigra von WT-Mäusen und im Striatum [F(1, 8)=12.74, P=0.0073] sowohl von WT als auch miR{{21} }b2/c KO-Mäuse nach MPTP-Verabreichung. Darüber hinaus reduzierte die MPTP-Injektion in miR-29b2/c-KO-Mäusen die Mikrogliadichten deutlich (Abbildung 4C, 4D).

2. Die Auswirkungen eines miR-29b2/c-Mangels in primär kultivierten Astrozyten

Ein Scratch-Assay wurde verwendet, um zu testen, ob ein Mangel an miR-29b2/c die Proliferation und Migration von Astrozyten beeinflusst. Primäre miR-29b2/c KO-Astrozyten zeigten keinen Unterschied in der Fähigkeit zur Proliferation und Migration. Die Lebensfähigkeit der Zellen von primären WT- und miR-29b2/c KO-Astrozyten zeigte zu Studienbeginn keinen Unterschied. Nach MPP plus Intoxikation war die Zelllebensfähigkeit von WT-Astrozyten im Vergleich zu den Kontrollen höher, wohingegen sich die Lebensfähigkeit mutierter Astrozyten nicht veränderte [F(1, 18)=5.727, P=0.0278 ]. Eine erhöhte ROS-Produkt- und Glukoseaufnahme wurde in MPP plus-behandelten WT- und miR-29b2/c KO-Astrozyten beobachtet.

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Die Expressionsniveaus von neurotrophen Faktoren, entzündungsbedingten Molekülen, Markergenen vom Typ A1 und A2 der Astrozyten in mit MPP plus behandelten Astrozyten wurden gemessen. 12 Stunden nach der Belastung war die Expression von BDNF in den WT- und miR-29b2/c-KO-Astrozyten erhöht (Abbildung 5A). Das TGF- 1-Expressionsniveau war in WT-Astrozyten nach der Exposition gegenüber MPP plus signifikant hochreguliert, während es in miR- 29b2/c KO-Astrozyten im Vergleich zu Wildtyp-Astrozyten sowohl zu Studienbeginn als auch danach herunterreguliert war die Vergiftung (Abbildung 5B). Das Basisniveau des TNF-Transkripts war in miR-29b2/c-KO-Astrozyten im Vergleich zu WT-Astrozyten niedriger. Nach 12-stündiger Behandlung stiegen die Expressionsniveaus von IL-1, IL-6 und COX-2 in WT- und miR-29b2/c-Astrozyten signifikant an, wohingegen TNF-Transkript war nur in WT-Astrozyten erhöht, und die IL-1-, TNF- und COX{23}}-Transkripte verringerten sich in miR-29b2/c KO-Astrozytenzellen im Vergleich zu Wildtyp-Gegenstücken (Abbildung 5C). . Der A1-Marker H2-T23 und der A2-Marker CD14 waren in PBS-behandelten miR- 29b2/c-KO-Astrozyten im Vergleich zu WT-Kontrollen deutlich niedriger. Nach 12-stündiger Behandlung waren die A1-Marker H2-D1, Ggta1 und C3 sowie die A2-Marker Clcf1 und S100 10 sowohl in WT- als auch in miR-29b2/c-KO-Astrozyten hochreguliert; H2-T23 stieg nur in WT-Astrozyten an; Gbp2 und CD14 veränderten sich in den beiden Genotypen von Astrozyten nicht. Darüber hinaus waren die Transkripte von H2-T23, H2-D1 und CD14 in miR-29b2/c-KO-Astrozyten im Vergleich zu WT-Kontrollen herunterreguliert (Abbildung 5D, 5E). 12 Stunden und 24 Stunden nach der Behandlung veränderten sich die Spiegel der AMPK-Proteine ​​und der phosphorylierten AMPK-Proteine ​​in WT-Astrozyten nicht, wohingegen 24 Stunden nach der MPP-plus-Exposition der AMPK-Proteinspiegel in miR-29b2/ abnahm. c KO-Astrozyten und das Verhältnis von p-AMPK zu AMPK in mutierten Astrozyten stiegen im Vergleich zu WT-Astrozyten und PBS-behandelten mutierten Astrozyten ebenfalls an (Abbildung 5F). Zusätzlich wurde das konditionierte Medium aus mit PBS oder LPS behandelten BV2-Zellen (kurz CM und LCM genannt) verwendet, um primäre Astrozyten von WT- und miR-29b2/c KO-Mäusen zu stimulieren. Obwohl sich die Expression des p-AMPK-Proteins nach 12-stündiger Behandlung mit LCM nicht veränderte, war sie in miR-29b2/c-KO-Astrozyten im Vergleich zu WT-Astrozyten signifikant höher. Wir beobachteten, dass die pAMPK-Proteine ​​in beiden Genotypen von Astrozyten nach 24 Behandlungen mit LCM anstiegen. Die LCM-Stimulation erhöhte deutlich die Expression von COX- 2-Proteinen [F(2, 18)=10.29, P=0.0010], jedoch den COX-2-Proteinspiegel in miR-29b2/c verringerten sich die KO-Astrozyten im Vergleich zu WT-Astrozyten (Abbildung 5G). Die Nitritkonzentration in LCM-behandelten miR-29b2/c KO-Astrozyten war im Vergleich zu LCM-behandelten WT-Astrozyten ebenfalls signifikant niedriger [F(2, 30)=17, P<0.0001] (Figure 5H). Further, the expression of senescence marker genes was evaluated. 12 h-treatment of MPP+ increased p53 transcript levels in both WT and miR- 29b2/c KO astrocytes. p19 and Pai1 transcripts were elevated only in WT astrocytes, and Pai1 expression levels in miR-29b2/c KO astrocytes were decreased compared to WT astrocytes after the treatment. Moreover, Bcl-2, Bax protein levels, and the ratio of Bcl-2 to Bax did not change in WT and miR-29b2/c KO astrocytes.

3. Die Auswirkungen eines miR-29b2/c-Mangels in primär kultivierten Mikroglia

Um die Reaktion miR-29b2/c-defizienter Mikroglia auf Entzündungsreize zu messen, wurde LPS verwendet. Das BDNF-Expressionsniveau war zu Studienbeginn in miR-29b2/c-KO-Mikroglia niedriger. Vier und acht Stunden nach der LPS-Behandlung war die Menge der IL-1-, IL-6-, TNF- und COX-2-Transkripte hochreguliert, während die IGF-1-Expression im WT herunterreguliert war und miR-29b2/c KO-Mikrogliazellen verringerte sich die Expression von BDNF nur in WT-Mikroglia [F(2, 27)=41.5, P<0.0001]. IL-10 transcript increased in WT and miR-29b2/c KO microglia [F(2, 27) = 3.753, P=0.0365], and TGF-β1 transcript decreased in WT microglia at eight hours after the LPS challenge. BDNF and TGF-β1 transcripts were not changed in miR-29b2/c KO microglia. In addition, IL-6 transcripts were significantly reduced in miR-29b2/c KO microglia after the challenge compared to WT controls, IGF-1 and IL-10 transcripts were markedly higher in miR-29b2/c KO microglia after four and eight hours of intoxication, respectively (Figure 6A–6C). At baseline, the p-AMPK protein level and pAMPK to AMPK ratio were dramatically elevated in miR-29b2/c KO microglia when compared with WT microglia. 24 h after the treatment of LPS, p-AMPK level [F(1, 17) = 5.066, P=0.0379] and the ratio [F(1, 17) = 5.537, P=0.0309] were elevated only in WT microglia (Figure 6D). At one hour after the treatment, the phosphorylated-NF-κB p65 (p-p65) proteins and pp65 to p65 ratio, but not p65 proteins, increased in wildtype and miR-29b2/c KO microglial cells, yet the ratio decreased modestly in miR-29b2/c KO microglial cells when compared with WT microglia (p=0.071) (Figure 6E). The expression of COX-2 was enhanced in the two genotypes of microglial cells; whereas, the level of COX-2 in mutant microglia decreased when compared with WT controls after 24 h-treatment of LPS [F(1, 17) = 5.33, P=0.0338] (Figure 6D). Nitrite product was induced by the treatment of LPS in both genotypes of microglia, however, it was dramatically lower in miR- 29b2/c KO microglia at baseline and after the treatment of LPS [F(1, 20) = 14.03, P=0.0013] (Figure 6F).

Diskussion

Die Expression von Mitgliedern der miR-29-Familie wird mit zunehmendem Alter in mehreren Geweben hochreguliert [30–32]. Arbeiten aus unserem Labor und anderen haben einen Zusammenhang zwischen miR-29s und der Parkinson-Krankheit gezeigt [33]. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle von miR- 29b2/c beim Altern und bei der Parkinson-Krankheit untersucht. miR-29s üben je nach Gewebe, Art und Entwicklungsstadium eine Pro- und Anti-Aging-Wirkung aus. Wir fanden heraus, dass 3-Monate alte miR-29b2/c-KO-Mäuse ein normales Skelett und Fettgewebe hatten, und 4-Monate alte miR- 29b2/c-KO-Mäuse zeigten im Vergleich zu ihrem WT-Pendant ein geringeres Körpergewicht, was mit anderen Studien übereinstimmt [11, 34]. Bei {{20}Monaten alten miR- 29b2/c KO-Mäusen wurden Muskelschwäche und instabiler Gang festgestellt. Dreizehn Monate alte miR-29b2/c KO-Mäuse zeigten eine Verdickung der Dermis. Sie hatten jedoch die normale Feinstruktur des Oberschenkelknochens. Die Verringerung des Körpergewichts kam bei 16-Monate alten miR-29b2/c KO-Mäusen vor. In diesem Alter hatten miR-29b2/c KO-Mäuse weniger Bauchfett und braunes Fett und zeigten offensichtliche Kyphose. miR-29s sind am p53-vermittelten Zellzyklusstillstand [35, 36] und der p16/Rb-gesteuerten zellulären Seneszenz [37] beteiligt. Im Gehirn der miR-29b2/c KO-Mäuse war jedoch keine zelluläre Seneszenz erkennbar. Obwohl miR-29b2/c zur Regulierung des Alterns beiträgt, könnten seine Rollen in den peripheren Geweben und im Gehirn unterschiedlich sein.

Die Serumspiegel von miR-29s waren bei Patienten mit Parkinson im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen herunterreguliert [24]. Hier fanden wir heraus, dass die Expression von miR-29 im PD-Mausserum zwischen 3 und 120 Tagen nach der MPTP-Verabreichung schwankte. miR-29s sind im Gehirn reichlich vorhanden [6, 30]. Bei der Durchsicht des GEO-Profils wurde festgestellt, dass die miR-29c-Expression in der Substantia nigra von PD-Patienten hochreguliert ist (p=0.0059, durch Mann-Whitney-Test), außerdem miR{{12 Die }}c-Expression im oberen Frontalgyrus unterschied sich im Vergleich zu den Kontrollpersonen nicht (p=0,47, laut Student-T-Test (ergänzende Abbildung 10). Hier wurden miR-29b2/c KO-Mäuse mit MPTP herausgefordert, um PD-ähnliche Verletzungen hervorzurufen. Die mutierten Mäuse zeigten weniger schwere Verletzungen des nigrostriatalen dopaminergen Systems und eine mildere Glia-Aktivierung und anschließend bis zu einem gewissen Grad Verhaltensresistenz. Somit spielt miR-29b2/c eine schädliche Rolle in der Pathologie der Parkinson-Krankheit. Wir beobachteten, dass sich im MPTP-induzierten Maus-PD-Modell die Striatalspiegel der p21-, p53- und Pai1-Transkripte nicht veränderten, was darauf hindeutet, dass möglicherweise keine zelluläre Seneszenz auftritt. Das Alter gilt als Hochrisikofaktor für die Entwicklung einer Parkinson-Krankheit [38]. Allerdings könnten altersbedingte Veränderungen im Gehirn, insbesondere im dopaminergen System, ein relevanterer Faktor sein.

Primäre Gliazellen von WT- und miR-29b2/c-KO-Mäusen wurden kultiviert, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Die Behandlung mit MPP plus erhöhte die GDNF-Expression und verringerte die IL-1-Expression in der miR-29b2/c-defizienten gemischten Glia. MPP plus erhöhte auch die Expression proinflammatorischer Gene in WT-Astrozyten, jedoch nicht in miR- 29b2/c-defizienten Astrozyten. Ebenso produzierten mutierte Astrozyten im Vergleich zu WT-Astrozyten weniger NO, nachdem sie dem konditionierten Medium von mit LPS behandelten BV2-Zellen ausgesetzt wurden. In der primären Mikroglia-Kultur waren im Vergleich zu LPS-behandelten WT-Kontrollen die Transkripte des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 und des neurotrophen Faktors IGF-1 deutlich höher und die Transkripte des entzündungsfördernden Zytokins IL{ {15}} nahm in LPS-behandelten miR-29b2/c KO-Mikroglia ab. Die NO-Spiegel waren in miR-29b2/c KO-Mikroglia zu Studienbeginn und nach der LPS-Intoxikation verringert. Studien haben gezeigt, dass miR-29s und viele vorhergesagte Zielgene an Stoffwechselprozessen beteiligt sind [34, 39–41]. Als essentieller Regulator hat sich gezeigt, dass AMPK bei Aktivierung eine schützende Wirkung auf die Parkinson-Krankheit hat [42]. Die Aktivierung von AMPK stimuliert Sirtuin 1 und hemmt indirekt die Aktivierung von NF-κB und nachgeschalteten entzündlichen Zielgenen [43]. Wir beobachteten, dass der Gehalt an phosphoryliertem AMPK-Protein und das Verhältnis von p-AMPK zu AMPK in LCM-behandelten bzw. MPP plus-behandelten miR- 29b2/c-KO-Astrozyten hochreguliert waren. Der COX-2-Proteinspiegel war in LCM-behandelten mutierten Astrozyten im Vergleich zu WT-Astrozyten verringert. Zu Studienbeginn war die AMPK-Aktivität in miR-29b2/c KO-Mikroglia erhöht. Die Menge an COX-2-Protein war in miR-29b2/c KO-Mikroglia im Vergleich zu WT-Kontrollen nach der Behandlung von LPS signifikant reduziert. Unter der LPS-Behandlung wurde das p-p65- und p65-Verhältnis in der mutierten Mikroglia leicht herunterreguliert, was auf einen abgeschwächten NF-κB-Signalweg schließen lässt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine erhöhte AMPK-Aktivität und eine verringerte Entzündungsreaktion in Glia den nigrostriatalen Signalweg in miR-29b2/c KO-Mäusen schützen (Abbildung 6G). Zusammenfassend spielt miR-29b2/c eine wichtige Rolle bei der Alterung und Schädigung des nigrostriatalen dopaminergen Systems.

Verweise

1. Braak H, Del Tredici K. Eingeladener Artikel: Pathologie des Nervensystems bei sporadischer Parkinson-Krankheit. Neurologie. 2008; 70:1916–25.

2. Wang Q, Liu Y, Zhou J. Neuroinflammation bei der Parkinson-Krankheit und ihr Potenzial als therapeutisches Ziel. Transl Neurodegener. 2015; 4:19.

3. Wang Z, Dong H, Wang J, Huang Y, Zhang X, Tang Y, Li Q, Liu Z, Ma Y, Tong J, Huang L, Fei J, Yu M, et al. Überlebensfördernde und entzündungshemmende Rolle von NF-κB c-Rel in den Parkinson-Krankheitsmodellen. Redox-Biol. 2020; 30:101427.

4. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, Mo YY. MicroRNA- 21 zielt auf Tumorsuppressorgene bei Invasion und Metastasierung ab. Zellauflösung 2008; 18:350–59.

5. Qiu L, Zhang W, Tan EK, Zeng L. Entschlüsselung der Funktion und Regulation von microRNAs bei der Alzheimer- und Parkinson-Krankheit. ACS Chem Neurosci. 2014; 5:884–94.

6. Papadopoulou AS, Serneels L, Achsel T, Mandemakers W, Callaerts-Vegh Z, Dooley J, Lau P, Ayoubi T, Radaelli E, Spinazzi M, Neumann M, Hébert SS, Silahtaroglu A, et al. Ein Mangel des miR-29a/b-1-Clusters führt bei Mäusen zu ataktischen Merkmalen und Kleinhirnveränderungen. Neurobiol Dis. 2015; 73:275–88.

7. Hyun J, Choi SS, Diehl AM, Jung Y. Mögliche Rolle von Hedgehog-Signalisierung und microRNA-29 bei der Leberfibrose von Mäusen mit IKK-Mangel. J Mol Histol. 2014; 45:103–12.

8. Qin W, Chung AC, Huang XR, Meng XM, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. Die TGF-/Smad3-Signalübertragung fördert die Nierenfibrose durch Hemmung von miR-29. J Am Soc Nephrol. 2011; 22:1462–74.

9. Xiao J, Meng XM, Huang XR, Chung AC, Feng YL, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. miR-29 hemmt die Bleomycin-induzierte Lungenfibrose bei Mäusen. Mol Ther. 2012; 20:1251–60.

10. Steiner DF, Thomas MF, Hu JK, Yang Z, Babiarz JE, Allen CD, Matloubian M, Blelloch R, Ansel KM. MicroRNA-29 reguliert T-Box-Transkriptionsfaktoren und die Interferonproduktion in T-Helferzellen. Immunität. 2011; 35: 169–81.

11. Dooley J, Garcia-Perez JE, Sreenivasan J, Schlenner SM, Vangoitsenhoven R, Papadopoulou AS, Tian L, Schonefeldt S, Serneels L, Deroose C, Staats KA, Van der Schueren B, De Strooper B, et al. Die microRNA-29-Familie bestimmt das Gleichgewicht zwischen homöostatischem und pathologischem Glukose-Handling bei Diabetes und Fettleibigkeit. Diabetes. 2016; 65:53–61.

12. Adoro S, Cubillos-Ruiz JR, Chen X, Deruaz M, Vrbanac VD, Song M, Park S, Murooka TT, Dudek TE, Lustre AD, Tager AM, Streeck H, Bowman B, et al. IL-21 induziert antivirale microRNA-29 in CD4-T-Zellen, um eine HIV-1-Infektion zu begrenzen. Nat Commun. 2015; 6:7562.

13. Ma F, Xu S, Liu X, Zhang Q, Xu X, Liu M, Hua M, Li N, Yao H, Cao indem es auf Interferon abzielt. Nat Immunol. 2011; 12:861–69.

14. Jovičić A, Roshan R, Moisoi N, Pradervand S, Moser R, Pillai B, Luthi-Carter R. Umfassende Expressionsanalysen neuronaler zelltypspezifischer miRNAs identifizieren neue Determinanten der Spezifikation und Aufrechterhaltung neuronaler Phänotypen. J Neurosci. 2013; 33:5127–37.

15. Ouyang YB, Xu L, Lu Y, Sun X, Yue S, Xiong XX, Giffard RG. Mit Astrozyten angereichertes miR-29a zielt auf PUMA ab und verringert die neuronale Anfälligkeit für Ischämie des Vorderhirns. Glia. 2013; 61:1784–94.

16. Shioya M, Obayashi S, Tabunoki H, Arima K, Saito Y, Ishida T, Satoh J. Aberrante microRNA-Expression im Gehirn neurodegenerativer Erkrankungen: miR-29a vermindert in Gehirnen der Alzheimer-Krankheit auf Neuronennavigator 3. Neuropathol Appl Neurobiol. 2010; 36:320–30.

17. Hébert SS, Horré K, Nicolaï L, Papadopoulou AS, Mandemakers W, Silahtaroglu AN, Kauppinen S, Delacourte A, De Strooper B. Verlust des microRNA-Clusters miR-29a/b-1 sporadisch Die Alzheimer-Krankheit korreliert mit einer erhöhten BACE1/Beta-Sekretase-Expression. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105:6415–20.

18. Johnson R, Zuccato C, Belyaev ND, Gast-DJ, Cattaneo E, Buckley NJ. Ein auf microRNA basierender Gen-Dysregulationsweg bei der Huntington-Krankheit. Neurobiol Dis. 2008; 29:438–45.

19. Packer AN, Xing Y, Harper SQ, Jones L, Davidson BL. Die bifunktionale microRNA miR-9/miR-9* reguliert REST und CoREST und ist bei der Huntington-Krankheit herunterreguliert. J Neurosci. 2008; 28:14341–46.

20. Nolan K, Mitchem MR, Jimenez-Mateos EM, Henshall DC, Concannon CG, Prehn JH. Erhöhte Expression von microRNA-29a in ALS-Mäusen: Funktionsanalyse ihrer Hemmung. J Mol Neurosci. 2014; 53:231–41.

21. Roshan R, Shridhar S, Sarangdhar MA, Banik A, Chawla M, Garg M, Singh VP, Pillai B. Der gehirnspezifische Abbau von miR-29 führt bei Mäusen zum neuronalen Zelltod und zur Ataxie. RNA. 2014; 20:1287–97.

22. Khanna S, Rink C, Ghoorkhanian R, Gnyawali S, Heigel M, Wijesinghe DS, Chalfant CE, Chan YC, Banerjee J, Huang Y, Roy S, Sen CK. Der Verlust von miR-29b nach einem akuten ischämischen Schlaganfall trägt zum Absterben neuronaler Zellen und zur Infarktgröße bei. J Cereb Blood Flow Metab. 2013; 33:1197–206.

23. Shi G, Liu Y, Liu T, Yan W, Liu X, Wang Y, Shi J, Jia L. Hochreguliertes miR-29b fördert den neuronalen Zelltod durch Hemmung von Bcl2L2 nach einer ischämischen Hirnverletzung. Exp Brain Res. 2012; 216:225–30.

24. Bai . Sci Rep. 2017; 7:5411.

25. Han L, Tang Y, Bai X, Liang X, Fan Y, Shen Y, Huang F, Wang J. Zusammenhang der Serum-microRNA-29-Familie mit kognitiver Beeinträchtigung bei Parkinson. Altern (Albany NY). 2020; 12:13518–28.

26. Chinta SJ, Woods G, Demaria M, Rane A, Zou Y, McQuade A, Rajagopalan S, Limbad C, Madden DT, Campisi J, Andersen JK. Die Zellalterung wird durch das Umweltneurotoxin Paraquat induziert und trägt zur Neuropathologie im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit bei. Cell Rep. 2018; 22:930–40.

27. Willard AM, Bouchard RS, Gittis AH. Unterschiedlicher Abbau motorischer Defizite während des allmählichen Dopaminabbaus mit 6-Hydroxydopamin bei Mäusen. Neurowissenschaften. 2015; 301:254–67.

28. Kam TI, Mao X, Park H, Chou SC, Karuppagounder SS, Umanah GE, Yun SP, Brahmachari S, Panicker N, Chen R, Andrabi SA, Qi C, Poirier GG usw. Poly(ADP-Ribose) treibt die pathologische Synuclein-Neurodegeneration bei der Parkinson-Krankheit voran. Wissenschaft. 2018; 362:eaat8407.

29. Huang D, Xu J, Wang J, Tong J, Bai Parkinson-Dis. 2017; 2017:9349487.

30. Ugalde AP, Ramsay AJ, de la Rosa J, Varela I, Mariño G, Cadiñanos J, Lu J, Freije JM, López-Otín C. Alterung und chronische DNA-Schadensreaktion aktivieren einen regulatorischen Weg, an dem miR{{2} beteiligt ist. } und S. 53. EMBO J. 2011; 30:2219–32.

31. Hu Z, Klein JD, Mitch WE, Zhang L, Martinez I, Wang XH. MicroRNA-29 induziert über mehrere Signalwege die Zellalterung im alternden Muskel. Altern (Albany NY). 2014; 6:160–75.

32. Fenn AM, Smith KM, Lovett-Racke AE, Guerau-deArellano M, Whitacre CC, Godbout JP. Erhöhte microRNA 29b im gealterten Gehirn korreliert mit der Verringerung des insulinähnlichen Wachstumsfaktors-1 und des Fractalkin-Liganden. Neurobiol-Alterung. 2013; 34:2748–58.

33. Wang R, Yang Y, Wang H, He Y, Li C. MiR-29c schützt vor Entzündung und Apoptose im Parkinson-Krankheitsmodell in vivo und in vitro, indem es auf SP1 abzielt. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020; 47:372–82.

34. Caravia Die microRNA-29/PGC1-Regulationsachse ist entscheidend für die metabolische Kontrolle der Herzfunktion. PLoS Biol. 2018; 16:e2006247.

35. Varela I, Cadiñanos J, Pendás AM, Gutiérrez-Fernández A, Folgueras AR, Sánchez LM, Zhou Z, Rodríguez FJ, Stewart CL, Vega JA, Tryggvason K, Freije JM, LópezOtín C. Beschleunigtes Altern bei Mäusen, denen Zmpste fehlt24 Protease ist mit der Aktivierung des p53-Signals verbunden. Natur. 2005; 437:564–68.

36. Park SY, Lee JH, Ha M, Nam JW, Kim VN. miR-29 miRNAs aktivieren p53, indem sie auf p85 alpha und CDC42 abzielen. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16:23–29.

37. Martinez I, Cazalla D, Almstead LL, Steitz JA, DiMaio D. miR-29 und miR-30 regulieren die B-Myb-Expression während der zellulären Seneszenz. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:522–27.

38. Collier TJ, Kanaan NM, Kordower JH. Alter und Parkinson: Verschiedene Seiten derselben Medaille? Mov Disord. 2017; 32:983–90.

39. Massart J, Sjögren RJ, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ, Egan B, Zierath JR, Krook A. Die veränderte miR- 29-Expression bei Typ-2-Diabetes beeinflusst den Glukose- und Lipidstoffwechsel im Skelett Muskel. Diabetes. 2017; 66:1807–18.

40. Dooley J, Lagou V, Garcia-Perez JE, Himmelreich U, Liston A. miR-29a-Mangel verändert den Verlauf des murinen Pankreas-Azinuskarzinoms nicht. Oncotarget. 2017; 8:26911–17.

41. Kwon JJ, Factora TD, Dey S, Kota J. Eine systematische Übersicht über miR-29 bei Krebs. Mol Ther Onkolytika. 2018; 12:173–94.

42. Lu M, Su C, Qiao C, Bian Y, Ding J, Hu G. Metformin verhindert den Tod dopaminerger Neuronen im MPTP/PI-induzierten Mausmodell der Parkinson-Krankheit durch Autophagie und mitochondriale ROS-Clearance. Int J Neuropsychopharmacol. 2016; 19:pyw047.

43. Salminen A, Hyttinen JM, Kaarniranta K. AMP-aktivierte Proteinkinase hemmt die NF-κB-Signalübertragung und Entzündung: Auswirkungen auf Gesundheit und Lebensdauer. J Mol Med (Berl). 2011; 89:667–76.

Xiaochen Bai 1,2, Xiaoshuang Zhang 1, Rong Fang 1, Jinghui Wang 1, Yuanyuan Ma 1, Zhaolin Liu 1, Hongtian Dong 1, Qing Li 1, Jingyu Ge 1, Mei Yu 1, Jian Fei 3,4, Ruilin Sun 4, Fang Huang 1

1. Abteilung für translationale Neurowissenschaften, Jing'an District Center Hospital of Shanghai, State Key Laboratory of Medical Neurobiology und MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, China

2. Abteilung für Rehabilitationsmedizin, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital, Shanghai 200233, China

3. School of Life Science and Technology, Tongji-Universität, Shanghai 200092, China

4. Shanghai Ingenieurwesen Forschung Zentrum für Modell Organismen, Shanghai Modell Organismen Zentrum, INC, Shanghai 201203, China