Dendrimer-Tesaglitazar-Konjugat induziert eine Phänotypverschiebung von Mikroglia und verstärkt die -Amyloid-Phagozytose† Teil 3

D-Tesa steigerte die Expression von Enzymen, die für die Entfernung pathogener Proteine ​​verantwortlich sind

Das Insulin abbauende Enzym (Ide) und die Matrix-Metalloprotease 9 (MMP9) sind von Mikroglia sezernierte Enzyme, die extrazelluläres -Amyloid und -Synuclein abbauen.71,72 Die Behandlung mit D-Tesa erhöhte die Expression von Ide signifikant um das 3-{8}fache (p < 0.001) mit einem Trend zur Erhöhung der MMP9-Expression (1,8-facher Anstieg, p=0.057) im Vergleich zu nur mit LPS behandelten Kontrollen (Abb. 6A und B).

In den letzten Jahren haben immer mehr Studien gezeigt, dass ein enger Zusammenhang zwischen insulinabbauenden Enzymen und dem Gedächtnis besteht. Diese Entdeckung liefert uns wertvolle Hinweise, um den Bildungs- und Aufrechterhaltungsmechanismus des Gedächtnisses weiter zu erforschen.

Das Insulin abbauende Enzym ist ein wichtiges Enzym, dessen Hauptfunktion darin besteht, Insulin abzubauen, um das Blutzuckergleichgewicht aufrechtzuerhalten. Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, dass das insulinabbauende Enzym nicht nur eine metabolische Rolle spielt, sondern auch direkt das Wachstum und die Reparatur von Neuronen im Gehirn beeinflusst und eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Gedächtnisses spielt.

Viele Studien haben gezeigt, dass das Gedächtnis umso besser ist, je höher der Spiegel des insulinabbauenden Enzyms ist. Denn insulinabbauende Enzyme können das Wachstum und die Reparatur von Neuronen fördern und dadurch die Lern- und Gedächtnisfähigkeit des Gehirns verbessern. Darüber hinaus können insulinabbauende Enzyme auch die Verbindung zwischen Neuronen fördern und so die Assoziation und den Erhalt des Gedächtnisses verbessern.

Die wichtige Rolle von Insulin abbauenden Enzymen im Gedächtnis wird in der klinischen Medizin häufig genutzt. Forscher haben herausgefunden, dass durch die Inhalation von insulinabbauenden Enzymen nicht nur das Gedächtnis, sondern auch die kognitiven Fähigkeiten und depressiven Symptome verbessert werden können.

Kurz gesagt, der Zusammenhang zwischen insulinabbauenden Enzymen und dem Gedächtnis ist ein sehr wichtiges Gebiet, das uns wertvolle Hinweise zur Untersuchung des biologischen Mechanismus des Gedächtnisses liefert. Zukünftige Forschungen werden die Funktion und Rolle von Insulin abbauenden Enzymen weiter erforschen, uns helfen, den Bildungs- und Speichermechanismus des Gedächtnisses besser zu verstehen und eine bessere Grundlage für die Verbesserung der Lern- und Gedächtnisfähigkeit des menschlichen Gehirns zu schaffen. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholinspiegels und der Wachstumsfaktoren, die für das Gedächtnis und das Lernen sehr wichtig sind. Darüber hinaus kann Cistanche auch die Durchblutung verbessern und die Sauerstoffversorgung fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält, wodurch die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert werden.

Klicken Sie auf Möglichkeiten, um Ihr Gedächtnis zu verbessern

Freies Tesa erhöhte die Expression von Ide signifikant um das 2--Fache (p=0,011) und erhöhte MMP nicht signifikant um das 92--Fache (p=0,35) (Abb. 6A). und B). M2-Mikroglia können bei neurodegenerativen Erkrankungen -Amyloid, -Synuclein und andere pathogene Proteine ​​durch enzymatischen Abbau oder Phagozytose entfernen, und D-Tesa reguliert die an diesen Prozessen beteiligten Proteine ​​(z. B. Ide und MMP9) hoch.71–73

Ideexpression wird in der AD- und PD-Pathologie herunterreguliert und wird bekanntermaßen durch PPAR-Agonisten hochreguliert, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt.

71,72 Funktionell wurde gezeigt, dass nur ein {{2}facher Anstieg der Ide-Spiegel die Amyloidakkumulation und den neuronalen Tod in vivo verringert.74,75 Daher ist der von D-Tesa beobachtete {{6}fache Anstieg des Ide und Eine 2-fache Erhöhung von Ide durch freeTesa könnte in vivo therapeutisch wirksam sein.

D-Tesa erhöht die Phagozytose von Amyloid

CD36 ist ein Mikroglia-Scavenger-Rezeptor, der die Phagozytose und den Abbau von Amyloid erleichtert.73 Seine Herunterregulierung in AD führt zu einer verringerten Entfernung von Amyloid, wird jedoch durch PPAR-Aktivierung hochreguliert.

Sowohl D-Tesa als auch freies Tesa erhöhten die CD36-Expressionsniveaus im Vergleich zu nur LPS-exponierten Zellen signifikant (p < 0.0001 vs. p < 0,005 für D-Tesa und freies Tesa ), aber D-Tesa war viel effektiver als freies Tesa (6-fache Steigerung gegenüber 2,8-facher Steigerung für D-Tesa bzw. freies Tesa, p < 0,0005) (Abb. 6C ).

Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Studien mit Pioglitazon (einem anderen PPAR-Agonisten) überein, die zeigten, dass eine erhöhte mikrogliale Phagozytose von Amyloid durch einen PPAR- und CD36--abhängigen Mechanismus erfolgt.73

Um zu untersuchen, ob die Hochregulierung von CD36 durch die D-Tesa-Behandlung mit der erhöhten Phagozytosefähigkeit dieser Zellen zusammenhängt, führten wir einen funktionellen Phagozytosetest von Amyloid durch. 73

Kurz gesagt, nachdem wir die Zellen wie in den vorherigen In-vitro-Tests behandelt hatten, applizierten wir zwei Stunden lang fluoreszierend markiertes Amyloid 1–42 auf die Zellen, wuschen die Zellen und führten dann eine Durchflusszytometrie durch, um das Ausmaß der zellulären Aufnahme von Amyloid zu untersuchen. D-Tesa erhöhte sowohl den Prozentsatz der Zellen, die -Amyloid phagozytierten, als auch die durchschnittliche Menge an internalisiertem -Amyloid pro Zelle (Abb. 7A und B).

Im Gegensatz dazu führte freies Tesa zu keiner Verbesserung der Phagozytose von Amyloid. Die überlegenen Wirkungen von D-Tesa im Vergleich zu Tesa sind wahrscheinlich auf eine verbesserte zelluläre Internalisierung zurückzuführen, die durch die Dendrimer-Konjugation ermöglicht wird.

Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten, die zeigten, dass über 95 % der mit fluoreszierend markiertem G4-PAMAM-OH behandelten BV2-Zellen das Dendrimer innerhalb von 30 Minuten internalisiert hatten und das Dendrimer mindestens 24 Stunden lang weiter internalisierten.76

Ebenso zeigte die Konjugation des kleinen Moleküls Minocyclin an fluoreszenzmarkiertes G4-PAMAM-OH, dass 99 % der BV2-Zellen das fluoreszenzmarkierte Dendrimer-Wirkstoff-Konjugat innerhalb von 3 Stunden internalisiert hatten.26 Sie zeigten auch, dass das Konjugat die Stickoxidspiegel deutlich reduzierte zum freien Medikament nach der Behandlung von BV2-Zellen mit LPS, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt.

Die mit D-Tesaphagozytose behandelten Zellen 1,9-fach mehr Amyloid als die LPS-behandelten Kontrollzellen (p < 0.001), was mit der 2,{8}fachen Steigerung von vergleichbar ist -Amyloid-Phagozytose durch primäre Mikrogliazellen von Ratten, die mit Pioglitazon behandelt wurden, berichtet von Yamanaka et al.73 Das etwas höhere Ausmaß der -Amyloid-Phagozytose in der vorherigen Studie könnte entweder darauf zurückzuführen sein, dass sie ihre Zellen nicht wie wir gleichzeitig mit LPS behandelten, oder weil primäre Mikrogliazellen PPAR exprimieren ein höherer Wert als die in dieser Studie verwendeten BV2-Zellen.77

Daher kann eine niedrigere D-Tesa-Dosis als die aus den In-vitro-Experimenten in unserer Studie geschätzte Dosis wahrscheinlich in vivo-Studien und am Menschen wirksam sein, da BV2-Zellen bekanntermaßen PPAR in geringeren Mengen exprimieren als primäre Mikroglia.77

Mikroglia sind an vielen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt, und die BHS hat verhindert, dass viele Medikamente, die den Phänotyp der Mikroglia von einem entzündungsfördernden, neurotoxischen M1-Phänotyp zu einem entzündungshemmenden, neuroprotektiven M2-Phänotyp verändern können, therapeutische Werte im Gehirn erreichen.5,6, 14,15

Beispielsweise wurden zwei PPAR-Agonisten, Pioglitazon und Rosiglitazon, jeweils in klinischen Phase-III-Studien für die Alzheimer-Krankheit untersucht, da sie den Phänotyp von Mikroglia verändern können, scheiterten jedoch wahrscheinlich aufgrund des schlechten Transports durch die BHS.13,14 Daher besteht klinisches Interesse an einer Veränderung der Phänotyp von Mikroglia bei neurodegenerativen Erkrankungen.

Ein solcher Ansatz erfordert die Abgabe des Arzneimittels an die Mikroglia in ausreichender Menge, um eine Reaktion auszulösen. Zu diesem Zweck wurde gezeigt, dass G4-OH-PAMAM-Dendrimere in vielen Tiermodellen nach systemischer Injektion Medikamente an Mikroglia abgeben und werden daher derzeit in klinischen Studien zur Behandlung von ccTLD (NCT03500627) und schwerem COVID evaluiert -19-assoziierte Entzündung (NCT04458298).18–28

Um die vorteilhaften Wirkungen der Veränderung des Mikroglia-Phänotyps mit der Fähigkeit zu kombinieren, Medikamente an Mikroglia abzugeben, haben wir Tesaglitazar (ein PPAR / dualer Agonist) an ein G4-OH-PAMAMdendrimer konjugiert (Abb. 1–3). Wir haben gezeigt, dass D-Tesa in der Lage ist, den Phänotyp der M1-Mikroglia in Richtung eines M2-Phänotyps zu verändern (Abb. 4 und 5), was zu einer Verringerung der Sekretion schädlicher reaktiver Sauerstoffspezies führt.

Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die mit D-Tesa behandelten Mikroglia ihre Expression von Enzymen erhöhen, die pathologische Proteine ​​wie -Synuclein und -Amyloid abbauen, sowie die Phagozytose von -Amyloid in einem Funktionstest hochregulieren (Abb. 6 und 7).

Obwohl wir keine Daten vorlegen, die die Fähigkeit von D-Tesa belegen, die Blut-Hirn-Schranke zu umgehen und sich in Mikroglia anzureichern, haben wir zuvor gezeigt, dass G4-OH-PAMAM-Wirkstoffkonjugate mit ähnlicher Wirkstoffbeladung, Größe und ähnlichem Zeta-Potenzial in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren beeinträchtigte BHS und Akkumulation von Mikroglia nach intravenöser Verabreichung.26,36,52

Diese Ergebnisse unterstützen die weitere Entwicklung von D-Tesa zur Behandlung mehrerer neurologischer Erkrankungen. Während wir uns in diesem Artikel auf die Alzheimer- und Parkinson-Krankheiten konzentrieren, hat D-Tesa das Potenzial für die klinische Umsetzung bei mehreren neurologischen Erkrankungen. Aufgrund der ähnlichen Rolle von Mikroglia in der Pathologie mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen wurde auch der PPAR-Agonist Pioglitazon untersucht oder wird derzeit in klinischen Phase-II-Studien für Parkinson-Krankheit,78 ALS,79 Adrenomyeloneuropathie (NCT03864523), Multiple Sklerose (NCT03109288) und Hämatom untersucht Auflösung bei intrazerebraler Blutung (NCT00827892).

Sollten auch diese klinischen Studien aufgrund der schlechten Abgabe von Pioglitazon über die Blut-Hirn-Schranke scheitern, könnte D-Tesa dieses Abgabehindernis überwinden und Patienten mit diesen Krankheiten behandeln.

Andere Gruppen haben Nanopartikel verwendet, um die Abgabe von PPAR-Agonisten an Makrophagen zu verbessern, haben jedoch nicht versucht, diese Agonisten an Mikroglia abzugeben. Osinski et al. zeigten, dass Tesa-beladene Liposomen in einem männlichen Adipositasmodell mit Leptinmangel größtenteils von Makrophagen im viszeralen weißen Fett aufgenommen wurden.80

Sie zeigten außerdem, dass mit Tesa beladene Liposomen die Expression des M1-Markers Mcp-1 nicht veränderten, jedoch die Expression des M2-Markers Arg1 erhöhten, während die Behandlung mit freiem Tesa die Gesamtzahl der M1-Makrophagen und die Expression von Mcp{{6} verringerte }} und hat den Ausdruck von Arg1 nicht erhöht.

Nakashiro et al. verwendeten Poly(milch-co-glykolsäure) (PLGA)-Nanopartikel, um Pioglitazon (einen PPAR-Agonisten) im Zusammenhang mit Arteriosklerose an Makrophagen abzugeben.81

In vivo zeigten sie, dass PLGA-Pioglitazon die Menge an Immunzellen im Blut senkte. In primären, aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen, die mit LPS und Interferon behandelt wurden, stellten sie fest, dass PLGA-Pioglitazon die IL-4- und IL-10-Marker (M2-Marker) erhöhte und die IL-6- oder TNF-Spiegel nicht senkte.

Ihre Ergebnisse ähneln unseren; Die M2-Marker wurden durch die Behandlung mit Nanopartikel-PPAR-Agonisten erhöht, während die IL-6- und TNF-Spiegel nicht abnahmen. Di Mascolo et al. verwendete PLGA-Polyvinylalkohol-Nanopartikel zur Abgabe von Rosiglitazon (einem weiteren PPAR-Agonisten).82

In vitro zeigten sie, dass ihre Nanopartikel-Wirkstoffkomplexe die iNOS-, TNF- und IL-1-Expression in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen verringerten. Sie behandelten ihre Zellen vor der Stimulierung mit LPS mit dem Nanopartikel-Medikament vor, während wir die Zellen vor der Behandlung mit D-Tesa mit LPS vorbehandelten, was ein Grund dafür sein könnte, dass wir keinen Rückgang von TNF- und IL-1 beobachteten, obwohl wir dies auch beobachteten Eine Verringerung des iNOS-Ausdrucks.

Abschluss

Für viele neurodegenerative Erkrankungen gibt es derzeit keine pathologieverändernde Therapie, und da die Bevölkerung immer älter wird, werden die Prävalenz und die Kosten für die Behandlung dieser Erkrankungen weiter steigen, was die dringende Notwendigkeit verdeutlicht, eine Lösung zu entwickeln. In jüngster Zeit spielen proinflammatorische M1-Mikroglia eine entscheidende Rolle bei der Pathologie mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen.

Folglich hat die Fähigkeit, ein Arzneimittel über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren, das eine Verschiebung des Phänotyps „M1 zu M2“ in Mikroglia induzieren kann, therapeutisches Potenzial für mehrere Krankheiten, insbesondere die Alzheimer- und Parkinson-Krankheit.

D-Tesa wurde entwickelt, um nach systemischer Verabreichung ein „M1 zu M2“-induzierendes Medikament an Mikroglia abzugeben, um die mikrogliale Sekretion neurotoxischer Substanzen zu reduzieren und gleichzeitig einen entzündungshemmenden Zustand zu induzieren, der den Abbau und die Phagozytose pathogener Proteine ​​im Gehirn erhöht. Wir haben D-Tesa erfolgreich mithilfe eines hocheffizienten Klick-Chemie-Ansatzes synthetisiert.

Das Arzneimittel ist über eine Esterbindung, die unter lysosomalen Bedingungen intrazellulär gespalten werden kann, an das Dendrimer gebunden, wobei etwa 60 % von Tesa in den ersten 48 Stunden unter lysosomalen Bedingungen freigesetzt werden.

Es wurde gezeigt, dass D-Tesa Tesa in vitro überlegen ist, indem es eine Verschiebung des Phänotyps von M1 zu M2a/M2b/M2c induziert, was zu einer verringerten Stickoxidsekretion, einer erhöhten Expression von -Synuclein- und -Amyloid-abbauenden Enzymen und einer erhöhten Phagozytose von -Amyloid führt.

Somit kombiniert D-Tesa die vorteilhaften Abgabeeigenschaften des Dendrimers mit den M1-zu-M2-Umschalteigenschaften von Tesa. Aufgrund der gemeinsamen Rolle von Mikroglia und des gemeinsamen therapeutischen Nutzens der Auslösung einer Verschiebung des Phänotyps M1 zu M2 hat D-Tesa das Potenzial, viele neurologische Störungen zu behandeln, wenn es im richtigen Stadium des Krankheitsverlaufs verabreicht wird.

Autorenbeiträge

LD, AS, KL, RS, SK und RMK konzipierten die Experimente. LD, AS und RS führten die Synthese und Charakterisierung des Dendrimer-Wirkstoff-Konjugats durch. LD, KL und JJ führten die Zellexperimente durch. LD und K. L. führte die Statistik durch. LD und AS haben das Manuskript geschrieben und alle Autoren haben das Manuskript redigiert.

Interessenkonflikte

RMK und SK sind Miterfinder der Verwendung des hydroxylterminierten Dendrimers zur gezielten Abgabe an Mikroglia bei neurologischen Erkrankungen sowie Patente im Zusammenhang mit der in diesem Artikel beschriebenen Dendrimertechnologie.

Sie sind Mitbegründer von Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. und RiniSight Inc., den Unternehmen, die die klinische Entwicklung der Plattform anführen. SK und RMK sind Vorstandsmitglieder von AshvatthaTherapeutics Inc. RS ist derzeit bei AshvatthaTherapeutics angestellt und besitzt Aktien des Unternehmens; das WerkR. S. hat für diese Arbeit gearbeitet, bevor er zu Ashvattha kam. Der Interessenkonflikt wird von der JohnsHopkins University verwaltet.

Danksagungen

Wir möchten Elizabeth Smith Khoury für hilfreiche Diskussionen zu den In-vitro-Experimenten danken. Dieses Projekt wurde vom Patz Distinguished Professorship Endowment von Johns Hopkins und NICHD (Fördernummer HD076901) (RMK) finanziert. Wir danken dem Wilmer Core Grant for Vision Research, Microscope, and Core Module (Fördernummer EY001865) für den Zugang zum Sony-Durchflusszytometer.

Wir danken Servier Medical Arts für die Nutzung ihrer Bildersammlung (http://smart.servier.com/), die unter einer Creative Common Attribution 3.0 GenericLicense lizenziert ist, die geändert wurde, um die grafische Zusammenfassung zu erstellen.

Referenzen

1 CL Gooch, E. Pracht und AR Borenstein, Die Belastung durch neurologische Erkrankungen in den Vereinigten Staaten: Ein zusammenfassender Bericht und ein Aufruf zum Handeln, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf und K. Zhong, Entwicklungspipeline für Medikamente gegen die Alzheimer-Krankheit: wenige Kandidaten, häufige Misserfolge, Alzheimer-Res. Ther., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng und J.-S. Kang, Geschichte und Fortschritt von Hypothesen und klinischen Studien zur Alzheimer-Krankheit, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto und S. Pritzkow, Proteinfehlfaltung, -aggregation und Konformationsstämme bei neurodegenerativen Erkrankungen, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry und C. Holmes, Mikroglia-Priming bei neurodegenerativen Erkrankungen, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang und W. Le, Differenzielle Rollen von M1- und M2-Mikroglia bei neurodegenerativen Erkrankungen, Mol. Neurobiol.,2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter und B. Stevens, Mikroglia erweisen sich als zentrale Akteure bei Gehirnerkrankungen, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, et al., The TREM2-APOE Pathway Drives theTranscriptional Phenotype of DysFunctional Microglia inNeurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., Die antidepressiv wirkenden Wirkungen von Pioglitazon in einem Mausmodell mit chronischem mildem Stress sind mit einer PPAR-vermittelten Veränderung der Mikroglia-Aktivierungsphänotypen verbunden, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., Polarization of Microglia to the M2Phenotype in a Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorGamma-Dependent Manner Attenuates axonal InjuryInduced by Traumatic Brain Injury in Mice, J. Neurotrauma, 2018, 35, 2330–2340.

11 W. Cai, et al., Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR): Ein Meister-Gatekeeper bei ZNS-Verletzungen und -Reparatur,Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal, et al., Glitazon-Einsatz verbunden mit verringertem Risiko der Parkinson-Krankheit, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com