Entwerfen von Tyrosinase-siRNAs durch mehrere Vorhersagealgorithmen und Bewertung ihrer anti-melanogenen Wirkung

Abstrakt

Melanin ist ein Pigment, das in Melanozyten aus Tyrosin produziert wird. Obwohl Melanin eine Schutzfunktion gegen durch UVB-Strahlung verursachte Schäden hat, wird es auch mit der Entwicklung von Melanomen und einem dunkleren Hautton in Verbindung gebracht. Tyrosinase ist ein entscheidendes Enzym bei der Melaninsynthese, das den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt während der Umwandlung von Tyrosin in DOPA und Dopachinon reguliert. Um wirksame RNA-Interferenztherapeutika zu entwickeln, haben wir einen Melanin-siRNA-Pool entworfen, indem wir mehrere Vorhersageprogramme angewendet haben, um die menschlichen Tyrosinasespiegel zu senken.

Zunächst bestanden 272 siRNAs die Zielzugänglichkeitsbewertung unter Verwendung des RNAxs-Programms. Dann wählten wir 34 siRNA-Sequenzen mit ΔG größer als oder gleich -34,6 kcal/mol, i-Score-Wert größer als oder gleich 65 und siRNA-Skalen-Score kleiner als oder gleich 30 aus 19-bp-RNA-Duplexe mit einem asymmetrischen 3'-Überhang am 3'-Ende des Antisense-Strangs. Wir testeten mithilfe von qRT-PCR, ob diese siRNAs die Tyrosinase-Genexpression wirksam reduzierten, und stellten fest, dass 17 siRNA-Sequenzen wirksamer waren als kommerziell erhältliche siRNA. Drei weiter getestete siRNAs zeigten eine effektive visuelle Farbänderung in menschlichen MNT-1-Zellen ohne zytotoxische Wirkungen, was darauf hindeutet, dass diese Sequenzen antimelanogen sind. Unsere Studie ergab, dass menschliche Tyrosinase-siRNAs mithilfe mehrerer Vorhersagealgorithmen effizient entworfen werden können.

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Schlüsselwörter:

Tyrosinase, Melanin, siRNA, Melanozyten, Whitening.

EINFÜHRUNG

Die menschliche Hautfarbe wird hauptsächlich durch das Pigment Melanin bestimmt, das von Melanozyten in der Epidermis produziert wird. Die Melaninproduktion wird induziert, wenn die Haut UV-Strahlung ausgesetzt wird, und es wird auf Vesikel-vermittelte Weise zu den Keratinozyten transportiert (Slominski et al., 2004). Zwei Arten von Melanin, Eumelanin und Phäomelanin, werden durch einen mehrstufigen Prozess aus L-Tyrosin hergestellt. Eumelanin ist ein dunkles, braunschwarzes, unlösliches Polymer, das für dunkle Hautfarbe verantwortlich ist (Slominski et al., 2004). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Melanogenese ist die Umwandlung von L-Tyrosin in L-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) durch Tyrosinase (Lerner und Fitzpatrick, 1950; Hearing Tsukamoto, 1991). Für kosmetische und pharmazeutische Zwecke wurden viele Tyrosinase-hemmende Mittel entwickelt, um die Hautpigmentierung zu kontrollieren, wie Hydrochinon (1,4-Dihydroxybenzol), Arbutin, Azelainsäure (1,7-Heptandicarbonsäure), und andere (Gillbro und Olsson, 2011). Obwohl ihre Anti-Pigmentierungswirkung gut bekannt ist, hat das Risiko von Nebenwirkungen zu einem Zögern bei der kontinuierlichen Anwendung von Tyrosinase-Hemmern geführt, wie gezeigt wurde, dass Hydrochinon-Formulierungen mit Konzentrationen über 1 Prozent in Europa verboten wurden (Gillbro und Olsson, 2011 ).

RNA-Interferenz (RNAi) wurde erstmals als antiviraler Abwehrmechanismus im Fadenwurm Caenorhabditis elegans entdeckt, bei dem doppelsträngige RNAs (dsRNAs) das Gen-Silencing komplementärer mRNA-Sequenzen auslösen (Fire et al., 1998). Danach wurde beobachtet, dass künstlich synthetisierte kurze interferierende RNAs (siRNAs) in Säugerzellen prozessiert wurden (Elbashir et al., 2001a). Die RNAi-Verarbeitung besteht aus mehreren Schritten; siRNA-Erzeugung durch dsRNA-Spaltung durch Dicer, Zusammenbau von siRNA mit dem RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC), Trennung von siRNA-Strängen (die Sense- (Passagier-) und Antisense- (Führungs-) Stränge), Bindung des Antisense-Strangs an mRNA mit einer komplementären Sequenz und Abbau von mRNA durch Argonaute 2 (Ago2) (Engels, 2013).

Strukturelle Merkmale von siRNA werden seit Jahrzehnten untersucht. Die klassische Struktur von siRNAs erfordert eine geeignete Duplexlänge, einen 3'-Überhang und eine asymmetrische Struktur. Aus einer Studie an Drosophila melanogaster wurde vorgeschlagen, dass das Standard-siRNA-Design aus dsRNAs mit 21 nt Sense/Antisense-Strängen besteht, die einen 19 Basenpaare (bp) langen dsRNA-Stamm mit 2 nt 3'-Überhängen an beiden Enden bilden (Elbashir et al., 2001b ). In Säugerzellen zeigten neuere Studien jedoch, dass nicht-kanonische siRNA genauso effektiv sein könnte wie klassische siRNA oder sogar durch Variationen in Länge, Symmetrie und Überhang verbessert werden könnte. siRNAs ohne 3'-Überhang(e) (Czauderna et al., 2003; Rose et al., 2005; Chang et al., 2007) und solche, die länger (Kim et al., 2005) oder kürzer (Chu und Rana, 2008) sind ) als 19 bp waren auch beim Gen-Silencing in Säugerzellen wirksam. Asymmetrie in der 3'-Überhangstruktur, nur am Antisense-Strang, führte zu einer besseren Leistung als symmetrische siRNAs (Sano et al., 2008).

Für einen effektiven und spezifischen Knockdown von mRNA-Targets ist ein rationales Design von siRNAs entscheidend. Algorithmen der ersten Generation für das siRNA-Design wurden basierend auf thermodynamischer Stabilität (Schwarz et al., 2003), Positionspräferenz (Amarzguioui und Prydz, 2004; Reynolds et al., 2004; Ui-Tei et al., 2004) und Einzigartigkeit entwickelt der Zielsequenz (Pancoska et al., 2004). Diese Studien deuteten darauf hin, dass funktionelle siRNAs asymmetrisch in der Stabilität der Duplexenden sind, was am instabilen 5'-Terminus von Leitsträngen und der Tatsache zu sehen ist, dass 5'-Termini von Leitsträngen die Basen A oder U bevorzugen. Zusätzlich Bewertung der Zielstelle die Zugänglichkeit zwischen siRNA und mRNA ist entscheidend und wird basierend auf der Energie berechnet, die zum Öffnen der Bindungsstelle und zum Bilden der Hybridisierung erforderlich ist (Muckstein et al., 2006; Tafer et al., 2008). Um die Vorhersagegenauigkeit zu verbessern, verwendeten Algorithmen der zweiten Generation neue Modelle mit einer großen Anzahl von Beobachtungen. Sie verwendeten ein künstliches neuronales Netzwerkmodell (Huesken et al., 2005) oder ein lineares Regressionsmodell (Shabalina et al., 2006; Vert et al., 2006; Ichihara et al., 2007).

In dieser Studie haben wir verschiedene Bedingungen berücksichtigt, um effiziente menschliche Tyrosinase-siRNAs zu entwerfen. Um die Effizienz im siRNA-Design zu maximieren, haben wir bekannte Bewertungskriterien mit mehreren siRNA-Designalgorithmen (RNAxs, i-Score und siRNA-Skalen) kombiniert: Zugänglichkeit der Zielstelle, GC-Gehalt, relative thermodynamische Stabilität an beiden Enden sowie andere Kriterien. Wir demonstrierten ferner die hemmende Wirkung ausgewählter siRNAs auf die Melaninproduktion in menschlichen Melanomzellen.

MATERIALEN UND METHODEN

Kombinatorische Anwendung von siRNA-Designalgorithmen und -Synthese

Für die mRNA-Sequenz der humanen Tyrosinase (TYR) wurde die Referenzsequenz (RefSeq id NM{{0}}) aus der NCBI-Nukleotiddatenbank verwendet. Zur Bewertung der Zielzugänglichkeit wurde das RNAxs-Designtool verwendet. RNAxs kombiniert bekannte siRNA-Funktionskriterien (Asymmetrie, Selbstfaltung, freies Ende) mit der Zugänglichkeit der RISC-Zielstelle (Tafer et al., 2008). 272 siRNAs bestanden mit Standardparametern (8 nt Zugänglichkeitsschwelle; 0.01157, 16 nt Zugänglichkeitsschwelle; 0.001002, Selbstfaltungsenergie; 0,9022, Sequenzasymmetrie; 0,5, Energieasymmetrie; 0,4655, freies Ende; 0,625) in allen Kriterien und wurden nach Punktzahl geordnet. i-Score und siRNA-Skalen basieren auf einem linearen Regressionsmodell und wurden mit dem Huesken-Datensatz trainiert (Huesken et al., 2005). Der i-Score (inhibitory–Score)-Algorithmus berechnet ΔG-Werte von siRNA-Strängen, Dinukleotide an den 5'- und 3'-Enden, die maximale GC-Strecklänge und den GC-Gehalt (Ichihara et al., 2007). Dieser Algorithmus identifiziert die bevorzugte Base für jede Nukleotidposition durch Berechnung des Inhibitions-Scores (i-Score). Um die Genauigkeit des Score-Designs zu verbessern, haben wir außerdem weniger thermostabile siRNAs mit ganzen ΔG-Werten größer oder gleich -34,6 kcal/mol ausgewählt (Ichihara et al., 2007). siRNA-Skalen berechnen die Stabilität der 5'- und 3'-Enden und den Gesamt-GC-Gehalt (Matveeva et al., 2007). Wir haben Filter für die Werte angewendet, sodass iScore größer oder gleich 65 und siRNA-Skalen kleiner oder gleich 30 sind. Alle siRNAs für TYR wurden von Bioneer Inc. (Daejeon, Korea) als 21-mere mit einer 3 synthetisiert '-Überhang auf dem Antisense-Strang. Siehe Tabelle 1 für die vollständige Liste der siRNAs.

Zellkultur

Die hochpigmentierte humane Melanomzelllinie MNT{{0}} wurde freundlicherweise von Dr. Minsoo Noh (Seoul National University, School of Pharmacy) zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in Minimal Essential Medium (MEM), ergänzt mit 20 Prozent fötalem Rinderserum (FBS), 10 Prozent Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und Gentamicin (50 ug/ml) gehalten. Trypsin (0,25 Prozent) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) wurden von Gigbco-BRL bezogen, und 20 mM HEPES wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) bezogen. Die Zellen wurden bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO 2 in der Luft gehalten.

siRNA-Transfektion

Für die Zelltransfektion wurde Lipofectamine 2000 (11668-027, Invitrogen, Waltham, MA, USA) oder DharmaFECT (T-2001-02, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß Herstellerprotokoll verwendet. 34 Anti-Tyrosinase-siRNAs und Nicht-Targeting-siRNA wurden von Bioneer Inc. erworben. Positive Kontroll-siRNA wurde von Santa Cruz (#sc-36766, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) erworben. MNT-1-Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 60 % gezüchtet und je nach Protokoll des Herstellers entweder mit Lipofectamine oder DharmaFECT-Reagenz transfiziert.

Immunoblot-Analyse

Immunoblot-Analyse MNT-1-Zellen wurden mit Lysepuffer (20 mM Tris pH 7,5,5 mM EDTA, 10 mM Na4 P2 O7, 100 mM NaF, 2 mM Na3 VO4, 1 Prozent NP-40, 1 mM PMSF, 10 ug/ml Aprotinin und 10 ug/ml Leupeptin) und 15 ug Protein wurden einer SDS-PAGE unterzogen und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membranen wurden mit einem Anti-Tyrosinase-Antikörper (#sc-7834, Santa Cruz) inkubiert. Die Banden wurden mit einem ChemiDoc-Bildgebungssystem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) visualisiert und mit der ImageJ-Software (Version 1.44p, NIH, USA) quantifiziert.

Messung des Melaningehalts

Der Melaningehalt wurde wie zuvor beschrieben (Hosoi et al., 1985) mit einigen Modifikationen gemessen. Kurz gesagt wurden MNT-1-Zellen auf 6--Well-Platten (6 × 10 5 Zellen/Well) ausgesät und mit siRNA transfiziert. 48 h und 168 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und geerntet. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellpellets in 1 ml 1 N NaOH, enthaltend 10 Prozent DMSO, gelöst und für 1 Stunde bei 80 Grad inkubiert. Die Extinktion der Lösung wurde bei 450 nm gemessen. Der Melaningehalt wurde basierend auf einer aus synthetischem Melanin erhaltenen Standardkurve berechnet.

Zellviabilitätstest (XTT-Assay)

Der XTT-Assay (Kat.-Nr. 11465015001, Roche, Pleasanton, CA, USA) wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt wurden 6 × 10 5 MNT1-Zellen/Vertiefung in Platten mit 6- Vertiefungen plattiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit einzelnen siRNAs transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen fünffach in 96--Well-Mikroplatten ausplattiert und dann zusätzlich für die angegebene Anzahl von Tagen aufbewahrt. Für den XTT-Assay wurden 50 μl XTT-Markierungsmischung (XTT-Markierungsreagenz:Elektronenkopplungsreagenz=50:1, um eine endgültige XTT-Konzentration von 0,3 mg/ml zu erreichen) zu jeder Vertiefung gegeben und die Platten wurden inkubiert bei 37 Grad in einer 5-prozentigen CO2-Atmosphäre für 4 h. Die Extinktion wurde mit einem enzymverbundenen Immunosorbent-Assay-Plattenlesegerät bei 450 nm gemessen.

RNA-Isolierung und quantitative Echtzeit-PCR-Analyse (Polymerase-Kettenreaktion).

Gesamt-RNA wurde aus Zellen unter Verwendung eines easy-BLUE-Kits (das TRIzol-Reagens, iNtRON, Seongnam, Korea) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. TRIzol wurde durch die Zugabe von Chloroform entfernt und mRNA wurde mit Isopropanol präzipitiert. RNA-Präzipitate wurden mit 75-prozentigem Ethanol gewaschen. Die optischen Dichten bei 260 und 280 nm wurden unter Verwendung eines UV-Spektrometers gemessen, um die RNA-Menge und -Reinheit zu bestimmen, und die RNA-Integrität wurde durch Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Genspezifische Primer wurden entwickelt, um die menschliche Tyrosinase (TYR), den Tumornekrosefaktor (TNF), Interleukin 6 (IL6) und das Haushaltsgen Glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) für die interne Kontrolle zu amplifizieren. Die folgenden Primerpaare wurden für TYR (F: 5′-GCCAACGATCCTAT CTTCCTTC-3′, R: 5′-GTGCATTGGCTTCTGGATAAAC-3′), TNF (F: 5′-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3) verwendet ', R: 5'-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3'), IL6 (F: 5'-CTGGATTCAATGAGGAGACTTG-3' R: 5'-CACTACTCTCAAATCTGTTCTGG-3') und GAPDH (F: 5' -GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′, R: 5′-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3′). Alle Amplifikationen wurden unter Verwendung einer Vormischung (20 μL) mit 500 nmol/L genspezifischer Primer und 2 μL Template-RNA unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung bei 95 Grad für 1 Minute, gefolgt von 45 Zyklen von 95 Grad für 20 s, 58 Grad für 20 s und 72 Grad für 25 s, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 Grad für 5 min.

statistische Analyse

Grafische Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistische Signifikanz unter Dreifachversuchen und zwischen Gruppen wurde unter Verwendung einer Ein- oder Zweiweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem mehrfachen Bonferroni-Vergleich nach dem Test bzw. Student's t-Test, bestimmt. Bedeutung wurde angenommen, als p<0.05.

ERGEBNISSE

Design menschlicher Tyrosinase-siRNAs

Um einen effizienten siRNA-Pool aufzubauen, der auf menschliche Tyrosinase abzielt, haben wir Bioinformatik-Tools angewendet, die mehrere fortschrittliche Vorhersagemodelle kombinieren. Wir haben die mRNA-Referenzsequenz (RefSeq id NM_000372) aus dem NCBI-Nukleotiddatensatz für menschliche Tyrosinase erhalten und 5'UTR- und 3'UTR-Regionen von der Vorhersage ausgeschlossen, da sie die RISC-Funktion stören können (Elbashir et al., 2002). Zunächst wurde die Sequenz mithilfe der RNAxs-Software auf RISC-Zugänglichkeit zum Zielort untersucht, was als wichtiger Faktor für die Einschränkung der endonukleolytischen Aktivität von RISC angesehen wird (Tafer et al., 2008). Neben der Zielzugänglichkeit wertet dieser Algorithmus auch die Selbstfaltungsenergie und die Sequenzasymmetrie aus, um die Punktzahlen zu berechnen.

Von diesem Algorithmus haben doppelsträngige 272 19-mer-Sequenzen (17 % von 1.572 Sequenzen) den Standardschwellenwert überschritten. Die Sequenzen wurden auch durch zwei Algorithmen der zweiten Generation basierend auf linearen Regressionsmodellen bewertet: i-Score (Inhibitory-Score) (Ichihara et al., 2007) und siRNA-Skalen (Matveeva et al., 2007). Sowohl der i-Score- als auch der siRNA-Scale-Algorithmus berücksichtigen die nukleotidpositionsabhängige Präferenz. siRNA-Skalen berechnen die lokale Duplexstabilität und den Gesamt-G/C-Gehalt für die Bewertung funktioneller siRNAs. Wir haben Filter für i-Score größer als oder gleich 65 und siRNA-Skalen kleiner als oder gleich 30 angewendet, wobei das ganze ΔG größer als oder gleich -34,6 kcal/mol ist. Wir fanden heraus, dass i-Score strenger war und 191 Sequenzen (12 Prozent) bestand, während siRNA-Skalen weniger streng waren und 47 Prozent der Sequenzen bestanden. Schließlich wurden 71 siRNAs erhalten, die die Kriterien aller drei siRNA-Designalgorithmen erfüllten. Wenn ganze ΔG-Wert-Beschränkungen angewendet wurden, bestanden schließlich nur 34 siRNAs (2,2 Prozent) ohne Off-Target-Effekte, wie unter Verwendung der NCBI-Nukleotiddatenbank bestimmt wurde (Fig. 1A, 1B). Für diese Studie entwarfen wir 19-bp-RNA-Duplexe mit einem asymmetrischen 2-nt-Überhang am 3'-Ende des Antisense-Strangs für eine bessere Leistung, wie vorgeschlagen (Abb. 1C) (Rose et al., 2005). ; Sano et al., 2008). Die vollständigen siRNA-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Bewertung der Wirksamkeit von Tyrosinase-siRNA in der menschlichen Melanom-Zelllinie MNT-1

Um die Wirksamkeit von siRNAs zu bewerten, die von siRNA-Design-Tools ausgewählt wurden, transfizierten wir MNT{{0}}-Zellen mit 34 einzelnen siRNAs und maßen die Tyrosinase-mRNA (TYR)-Expression durch qRT-PCR. Wie in dem in Fig. 2A beschriebenen experimentellen Schema gezeigt, wurden die Tyrosinase-mRNA-Expressionsniveaus am Tag 2 nach der Transfektion gemessen. Die 34 siRNAs reduzierten die Tyrosinase-mRNA-Spiegel im ersten Screening um durchschnittlich 57,8 Prozent (SD=0.141). 13 siRNAs waren signifikant wirksamer als die im Handel erhältliche siRNA, die als positive Kontrolle (PC) verwendet wurde (Abb. 2B, Tabelle 2). Wir haben die Tyrosinase-mRNA weiter quantifiziert, um die Wirksamkeit der 6 wirksamsten (Nr. 16, 17, 23, 26, 28 und 31) und 3 am wenigsten wirksamen (Nr. 2, 3 und 5) siRNAs zu bestätigen. Beim ersten Screening konnten die 6 effektivsten siRNAs die Tyrosinase-Expression effizient (0,294--fach vs. NC) und auch effektiver als die Positivkontrolle (0,39--fach vs NC), während die 3 am wenigsten effektiven siRNAs eine ähnliche oder geringere Wirksamkeit zeigten (Abb. 3A, 3B).

Beim zweiten Screening senkten selbst die am wenigsten effektiven siRNAs die Tyrosinase-Expression etwa 0,5--fach. Um zu sehen, ob siRNAs die Tyrosinase-Proteinspiegel senken, führten wir eine Immunoblot-Analyse durch. Als Ergebnis der mRNA-Spiegel wurde der Tyrosinase-Proteinspiegel effektiv gesenkt (Fig. 3C). Im Allgemeinen zeigten die 6 effektivsten siRNAs eine bessere Leistung als die 3 am wenigsten effektiven. In Anbetracht des effektiven Knockdowns, den selbst unsere leistungsschwächsten siRNAs bieten, unterstützen unsere Ergebnisse die Idee, dass die siRNA-Produktion durch die Kombination mehrerer siRNA-Designalgorithmen ein effizienter Ansatz war.

Anti-melanogene Wirkung von siRNAs in MNT-1-Zellen

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die von uns entworfenen siRNAs die Melaninsynthese in melaninproduzierenden Zellen herunterregulieren könnten. Um die Wirkung unserer siRNAs (#16, 17, 26) auf die Melaninsynthese durch Tyrosinase zu testen, haben wir den Melaningehalt in siRNA-transfizierten MNT-1-Zellen gemessen. Wie in Fig. 4A (oben) gezeigt, war der Melaningehalt am Tag 2 nach der Transfektion nur minimal verändert. Als jedoch der Melaningehalt an Tag 7 analysiert wurde, wurde die anti-melanogene Wirkung dieser siRNAs nachgewiesen (Fig. 4A, unten). Die kolorimetrische Messung dieser Proben (Tag 7) zeigte, dass alle siRNAs den Melaningehalt signifikant reduzierten (S<0.001). siRNAs #16 and 17 were as effective as the positive control in reducing melanin content by approximately 0.55-fold (0.56-fold by P.C.) although siRNA #26 was less effective (~0.74-fold) (Fig. 4B). These data show that the siRNAs we designed are effective in reducing melanin synthesis in cells.

Die Wirkung von siRNAs auf die Zelllebensfähigkeit

Einige siRNAs führen zu Toxizität und beeinträchtigen die Zelllebensfähigkeit durch Off-Target-Effekte im Zusammenhang mit Zellwachstum, Zelltod und anderen Eigenschaften. Um festzustellen, ob diese siRNAs zu Zelltoxizität führen, analysierten wir die Zelllebensfähigkeit durch Beobachtung von Veränderungen in der Zellmorphologie und durch XTT-Assays in siRNA-transfizierten MNT-1-Zellen. An Tag 1 oder 2 nach der siRNA-Transfektion (Nr. 16, 17, 26 und PC) wurde keine signifikante Veränderung der Zellmorphologie beobachtet (Fig. 5A). Außerdem wurde keine wahrnehmbare Veränderung der Zelllebensfähigkeit festgestellt, wie durch den XTT-Assay gemessen wurde (Fig. 5B). Wir haben weiter getestet, ob diese siRNAs eine Immunantwort induzieren können, indem wir die mRNA-Spiegel von TNF und IL-6 gemessen haben. siRNA Nr. 16 und 17 beeinflussten die TNF-mRNA-Expression nicht, während Nr. 26 eine etwa 1,8--fache Zunahme sowohl unter nackten als auch unter Liposomen-unterstützten Bedingungen zeigte (Fig. 5C).

Das Niveau war jedoch nicht höher als das der Positivkontrolle (PC). Im Gegensatz dazu wurde IL-6 von allen drei siRNAs unter Liposomen-unterstützten Bedingungen hochreguliert, während die positive Kontrolle keine schädliche Wirkung zeigte. Insbesondere siRNA #26 und PC lösten sogar im nackten Zustand Immunantworten aus, in denen keine Reduktion der Tyrosinase-mRNA festgestellt wurde. Insgesamt zeigten unsere Daten, dass die Kombination von siRNA-Designalgorithmen ein effizienter Ansatz zur Entwicklung neuartiger siRNA-Sequenzen ist. Darüber hinaus waren die ausgewählten siRNAs (Nr. 16 und 17) wirksam bei der Unterdrückung der Synthese von menschlichem Melanin, was darauf hindeutet, dass diese siRNAs als neue siRNA-Sequenzen zur Verwendung in der biomedizinischen Forschung und auf kosmetischen Gebieten weiterentwickelt werden könnten.

DISKUSSION

Hautaufhellungsmittel sind für kosmetische Zwecke nützlich und viele solcher Formulierungen wurden über Jahrzehnte entwickelt. Derzeit stehen verschiedene Wirkstoffe mit unterschiedlichen Wirkmechanismen zur Verfügung, wie z. und Hemmung der Melanosomenreifung (Arbutin) (Sheth und Pandya, 2011). Tyrosinase ist ein geschwindigkeitsbegrenzendes Enzym bei der Melaninproduktion aus Melanozyten (Lerner und Fitzpatrick, 1950; Hearing und Tsukamoto, 1991). Hier haben wir versucht, die Tyrosinase-Expression zu reduzieren, indem wir Tyrosinase-siRNAs angewendet haben, die mit mehreren Vorhersagewerkzeugen entwickelt wurden.

Effizientes siRNA-Design ist entscheidend, da selbst geringfügige Sequenzänderungen die Funktionalität erheblich verändern können. Derzeit wurden zahlreiche siRNA-Designalgorithmen entwickelt, und diese Algorithmen betrachten verschiedene Faktoren als kritisch für die Funktionalität, wie z. B. Zielzugänglichkeit, sekundäre mRNA-Strukturen und Positionspräferenzen der siRNA-Sequenz. Frühe Studien zu Regeln für bevorzugte siRNA-Sequenzmuster wurden vorgeschlagen: N2SN17WN2 nach Ui-Tei-Regel (Ui-Tei et al., 2004), N4AN6TN2HN5WN2 von Reynolds (Reynolds et al., 2004) und so weiter. Diese Regeln weisen auch allgemein darauf hin, dass eine asymmetrische siRNA-Struktur kritisch ist: Am 5'-Ende des Antisense-Strangs sind mehr A/U-Basen erforderlich, während am 5'-Ende des Sense-Strangs mehr G/C-Basen erforderlich sind. Es wird angenommen, dass ein niedriger GC-Gehalt am 5'-Ende des Antisense-Strangs das Abwickeln und den Einbau des siRNA-Duplex in den RISC-Komplex unterstützt.

i-Score- und siRNA-Scale-Algorithmen berechnen zusätzlich zu anderen Faktoren die Nukleotidpräferenz an jeder Position der siRNA. Aus diesem Grund zeigten die Ergebnisse von i-Score- und siRNA-Skalenalgorithmen eine leichte bis moderate Korrelation (R2 =0.4309) (Daten nicht gezeigt), und die meisten siRNAs, die die Anforderungen des i-Score-Algorithmus erfüllten, wurden eingeschlossen in siRNA-Skalen. Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass der von siRNA-Skalen bereitgestellte Standardschwellenwert weniger streng ist als i-Score (47 Prozent gegenüber 12 Prozent der Gesamtzahl).

Frühere Studien legten nahe, dass die Gesamt-ΔG-Werte der siRNA-Sekundärstruktur eine entscheidende Determinante für die siRNA-Effizienz sind (Ichihara et al., 2007; Ladunga, 2007). Insbesondere siRNAs mit ΔG-Werten von weniger als -34,6 kcal/mol, die thermodynamisch stabil sind, zeigten eine schlechte Knockdown-Effizienz (Ichihara et al., 2007). Als wir den Korrelationskoeffizienten zwischen ΔG-Werten und Unterdrückungsniveaus unter Verwendung unserer Daten berechneten, wurde keine signifikante Korrelation beobachtet (Daten nicht gezeigt). Da wir jedoch nur eine kleine Anzahl von siRNAs untersucht haben, können wir nicht schlussfolgern, dass die ΔG-Werte statistisch nicht mit der siRNA-Effizienz zusammenhängen. Um die Wirkung von Gesamt-ΔG-Werten auf die siRNA-Aktivität zu bestimmen, ist eine große Anzahl von Proben erforderlich, und siRNAs mit niedrigeren Gesamt-ΔG-Werten sollten dem Test zum Vergleich hinzugefügt werden.

Gemeinsam haben wir menschliche Tyrosinase-siRNAs mit mehreren Algorithmen und Parametern entworfen und hocheffiziente siRNAs identifiziert, die im kosmetischen Bereich nützlich sein könnten. Viele siRNAs werden derzeit für den Einsatz in der Biomedizin und im kosmetischen Bereich in Betracht gezogen und wurden weltweit in klinischen Studien getestet. Für die breite Nutzung von siRNA-basierten Anwendungen müssen jedoch noch einige Hindernisse gelöst werden, wie z. B. Probleme mit Sicherheit, Stabilität und Bereitstellung.

DANKSAGUNGEN

Diese Studie wurde durch ein Stipendium von Leaders Cosmetics, Samsung L&S Co., Ltd (#2015/05/20-31) und durch das Basic Science Research Program der National Research Foundation of Korea (KRF) unterstützt, das vom Ministerium für Korea finanziert wurde Bildung (2016R1D1A1B01012515).

VERWEISE

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Department of Life Sciences, Sogang University, Seoul 04107.

2 Leaders Cosmetics Co., Ltd., Anseong 17599.

3 Gachon Institute of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Gachon University, Incheon 21936.

4 School of Pharmacy, Sungkyunkwan University, Suwon 16419.

5 Labor für Zelldifferenzierungsforschung, College of Korean Medicine, Gachon University, Seongnam 13120, Republik Korea.

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