Nachweis und Charakterisierung von mineralo-organischen Nanopartikeln in menschlichen Nieren

Tsui Yin Wong^1,2,*, Cheng Yeu Wu^1,2,3,* et al

Ektopische Verkalkung wird mit verschiedenen Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht, darunter Atherosklerose, Krebs,chronischNiereErkrankung, undDiabetesmellitus. Obwohl in verkalkten Blutgefäßen mineralische Nanopartikel nachgewiesen wurden, bleiben die Natur und die Rolle dieser Partikel im menschlichen Körper unklar. Hier zeigen wir zum ersten Mal diesen MenschenNiereGewebe aus dem EndstadiumchronischNiereErkrankungoder Nierenkrebspatienten enthalten runde, multilamellare Mineralpartikel von 50 bis 1.500 nm, während bei gesunden Kontrollen keine Partikel beobachtet werden. Die Mineralpartikel befinden sich hauptsächlich in der extrazellulären Matrix, die die gewundenen Tubuli, Sammelrohre und Henle-Schleifen umgibt, sowie im Zytoplasma von Tubulus-abgrenzenden Zellen und bestehen aus polykristallinem Calciumphosphat, ähnlich dem Mineral, das in Knochen und ektopischen Verkalkungen vorkommt. DasNieremineralische Nanopartikel enthalten mehrere Serumproteine, die ektopische Verkalkung in Körperflüssigkeiten hemmen, darunter Albumin, Fetuin-A und Apolipoprotein A1. Da die mineralisch-organischen Nanopartikel nicht nur in verkalkten Ablagerungen, sondern auch in Bereichen ohne mikroskopische Verkalkungen gefunden werden, deuten unsere Beobachtungen darauf hin, dass die Nanopartikel Vorläufer von Verkalkungen und Nierensteinen beim Menschen darstellen können.

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Ektopische Verkalkung wird mit Arteriosklerose, Krebs,chronischNiereErkrankung, und Diabetes mellitus1–3. Jüngste Studien zeigen, dass Atherosklerose undchronischNiereErkrankungPatienten mit Anzeichen von Gefäßverkalkung weisen ein erhöhtes Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko auf, was darauf hindeutet, dass ektopische Verkalkung der menschlichen Gesundheit abträglich ist1,3. Unerwünschte Verkalkung wird auch bei älteren Menschen beobachtet und die meisten Menschen über 60 Jahre zeigen Anzeichen von Gefäßverkalkung4. Aus diesen Gründen sind die Entschlüsselung der Faktoren, die eine ektopische Verkalkung induzieren, und die Entwicklung einer wirksamen Behandlung wichtige Ziele.

Ektopische Verkalkung kann als ein Ungleichgewicht zwischen Inhibitoren und Induktoren der Verkalkung im Körper definiert werden. Zu den Verkalkungsinhibitoren gehören Serumproteine ​​wie Albumin, Fetuin-A, Osteopontin und Matrix-GLA-Protein sowie kleine Verbindungen wie Pyrophosphat, während Hyperphosphatämie und Entzündungen die Hauptinduktoren der Verkalkung darstellen5–7. Jüngste Studien weisen darauf hin, dass Verkalkungsinduktoren einen zellulären Prozess ähnlich der Knochenbildung während der Gefäßverkalkung aktivieren7,8. Matrixvesikel, die denen ähneln, die eine Mineralisierung in sich entwickelnden Knochen induzieren, wurden auch in verkalkten Weichteilen nachgewiesen7–9. Diese Matrixvesikel werden wahrscheinlich von vaskulären glatten Muskelzellen freigesetzt, die sich zu Osteoblasten-ähnlichen Zellen differenzieren, die eine Verkalkung induzieren7.

Mineralische Nanopartikel (NPs) wurden in Weichgeweben nachgewiesen, die Anzeichen einer ektopischen Verkalkung zeigten. Preis u. fanden heraus, dass das Serum von Ratten, die entweder mit dem Bisphosphonat Etidronat oder mit Vitamin D behandelt wurden, Mineralien-Protein-Komplexe enthielt, die die Verkalkungsinhibitoren Fetuin-A und das Matrix-GLA-Protein enthielten10,11. In ähnlicher Weise haben Jahnen-Dechent et al. beobachteten, dass Fetuin-A-haltige Mineralkomplexe, die als Calciprotein-Partikel (CPPs) bezeichnet wurden, in der Aszitesflüssigkeit von Patienten mit kalzifizierender Peritonitis nachgewiesen werden konnten12. Eine aktuelle Studie von Bertazzo et al. zeigten das Vorhandensein mineralischer NPs in den Aortenklappen und Koronararterien sowohl von Patienten mit atherosklerotischem als auch mit rheumatischem Fieber13. Während sich Studien zur Bildung von Mineralpartikeln normalerweise auf das menschliche Herz-Kreislauf-System konzentriert haben, bleibt unklar, ob die Partikel in anderen Geweben gefunden werden können und ob diese Einheiten eine Rolle bei Gesundheit oder Krankheit spielen.

Wir haben früher beobachtet, dass sich mineralisch-organische NPS spontan in menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten bilden14–28. Diese mineralischen NPs wurden ursprünglich als Nanobakterien (NB) beschrieben und galten nicht nur als die kleinsten Zellen der Erde29, sondern auch als mögliche übertragbare Ursache zahlreicher Krankheiten, darunter Alzheimer, Atherosklerose, Krebs,NiereSteinBildung, polyzystischNiereErkrankung, und Prostatitis30–32. Unsere Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass NB tatsächlich nicht lebende mineralische NPs sind, die gewöhnliche Bakterien in Bezug auf ihre Morphologie, ihr Wachstum, ihre Proliferation und ihre Subkultur nachahmen15,18,22. Die Möglichkeit, dass dem sogenannten NB ähnliche mineralische Partikel in menschlichen Geweben gefunden werden können und ob diese Partikel eine Rolle bei Krankheiten spielen, muss noch untersucht werden.

In der vorliegenden Studie haben wir einen Nanomaterial-Ansatz entwickelt, um mineralisch-organische NPs in erkrankten Menschen nachzuweisen und zu analysierenNiereGewebe. Wir zeigen, dass Nierengewebe von Patienten mit chronischer Nierenerkrankung und Nierenkrebs im Endstadium multilamellare Mineral-NPs enthalten, die den biomimetischen Mineralpartikeln ähneln, die in vitro spontan in Körperflüssigkeiten ausfallen. Unsere Ergebnisse offenbaren entscheidende Einblicke in die biochemische Zusammensetzung, den Bildungsmechanismus und die biologische Funktion dieser mineralisch-organischen Partikel und geben Aufschluss über die Mechanismen der ektopischen Verkalkung und der Entstehung von Krankheiten im menschlichen Körper.

Ergebnisse

Wir untersuchten chirurgisch entferntes Nierengewebe von menschlichen Patienten mit chronischer Nierenerkrankung im Endstadium (n=2) oder Nierenkrebs (n=18; siehe Tabelle 1; bei Proben von Nierenkrebs konzentrierten wir uns auf die nicht -krebsartiger Teil des Gewebes). Als gesunde Kontrollpersonen untersuchten wir Nierenbiopsien, die von Patienten mit Traumata oder Hämatomen, aber ohne vorherige abnormale Nierenfunktion (n=2; Tabelle 1) entnommen wurden.

Nierengewebe von gesunden Personen zeigten normale histologische Merkmale, und nach der von-Kossa-Färbung wurde keine ektopische Verkalkung beobachtet (Abb. 1A, B). Andererseits zeigten von erkrankten Personen erhaltene und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbte Nierengewebe Anzeichen von Gewebeschäden (Abb. 2A–C, durch Pfeile gekennzeichnet), und 80 Prozent der untersuchten erkrankten Gewebe zeigten mineralisierte Ablagerungen durch von-Kossa-Färbung (Abb. 1C – T, Abb. 2E, F, Verkalkung ist als schwarzes Material sichtbar, das durch schwarze Pfeile angezeigt wird; siehe auch Tabelle 1). Verkalkte Ablagerungen wurden im Kortex und Medulla festgestellt, einschließlich des extrazellulären Raums, der die distalen gewundenen Tubuli, proximalen gewundenen Tubuli, Sammelrohre und Henle-Schleifen umgibt, sowie im Zytoplasma von Zellen, die die Tubuli und Gänge abgrenzen (Abb. 1C–T und Abb 2E, F). Im Nierenkörperchen wurde keine Verkalkung festgestellt (Abb. 2D).

Um die Art der Mineralausscheidungen zu untersuchen, präparierten wir ultradünne Nierenschnitte zur Beobachtung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). In Proben, die mikroskopisch kleine Mineralablagerungen enthielten, wurden Mineralpartikel oder Körnchen im Zytoplasma von Nierenepithelzellen, in der extrazellulären Matrix unter der Basalmembran und im Lumen der proximalen und distalen gewundenen Tubuli nachgewiesen (Abb. 3A, B, Partikel sind vergrößert in den Tafeln A1–A4 und B1–B4). Mineral-NPs wurden auch in Zellen beobachtet, die die Henle-Schleifen und Sammelrohre auskleideten (Abb. 3C, D, vergrößert in den Feldern C1, C2 und D1). Einige Partikel wurden in intrazellulären Vesikeln in Nierenzellen gefunden (Fig. 3A, Felder A1 und A2). Der hier verwendete elektronenmikroskopische Ansatz ermöglichte es uns auch, das Innere der Mineralpartikel sichtbar zu machen; einige Partikel enthielten elektronendichte Ringe, die sich mit hellen, elektronendurchlässigen Schichten abwechselten (Abb. 3A, Tafeln A3 und A4, Abb. 3C, Tafel C1). Mehrere Blutgefäße wie die Vasa recta rents (die geraden Arterien der Niere) sind von einer großen Anzahl mineralischer NPs umgeben (Abb. 3D, Tafel D1). Mineralische NPs wurden daher an verschiedenen Stellen in allen menschlichen Nierengeweben gefunden, die Anzeichen einer ektopischen Verkalkung zeigten, während bei den untersuchten gesunden Kontrollen keine Partikel gefunden wurden.

Die in Nierengewebe gefundenen Mineralpartikel scheinen den mineralo-organischen NPs sehr ähnlich zu sein, die in unseren früheren Studien beschrieben wurden15,17 (und die wir als Bion24 bezeichnet haben). Um diese Möglichkeit zu überprüfen, präparierten wir mineralische organische NPs (oder Bionen) unter Verwendung einer Präzipitationsmethode, wie wir sie zuvor beschrieben haben15. Diese Methode besteht aus der Zugabe von präzipitierenden Ionen wie Calcium und Phosphat in ein Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium oder DMEM), das eine Körperflüssigkeit wie ein menschliches Serum (HS) enthält, gefolgt von einer Inkubation unter Zellkulturbedingungen (siehe Methoden). Die auf diese Weise hergestellten Partikel (HS-NPS) waren entweder kugelförmig oder ellipsoid und zeigten eine glatte oder kristalline mineralische Oberfläche (Abb. 4A–E), ähnlich den zuvor beschriebenen Partikeln in Körperflüssigkeiten22,23 sowie in menschlichem Aszites12 und verkalkte Arterien13. Die Mineralpartikel waren den in Nierengewebe beobachteten Mineral-NPs oder -Granulaten in Bezug auf ihre Gesamtmorphologie, Mehrschichtstruktur und Oberflächeneigenschaften sehr ähnlich (Abb. 4F–J). Die Größe der von HS abgeleiteten Partikel und Nierenkörnchen war ebenfalls vergleichbar und variierte zwischen 50 und 1.500 nm im Durchmesser (Abb. 4A–E,F–J). Wie oben angemerkt, waren einige Nierenkörnchen von einer Lipidmembran umgeben, die möglicherweise intrazelluläre Frachtvesikel oder extrazelluläre Membranvesikel darstellen ( 4H , I, Membranen sind durch Pfeile gekennzeichnet); solche Membranstrukturen fehlten in HS-NP-Proben, die in vitro hergestellt wurden (Abb. 4A–E). Diese Beobachtungen legen nahe, dass Nierengranula den im Serum zusammengesetzten mineralo-organischen NPs ähnlich sind.

Mithilfe der Elektronenbeugungsanalyse ausgewählter Bereiche beobachteten wir, dass die Mineralphase der in vitro hergestellten HS-NPs aus einem polykristallinen Nanomaterial bestand (Abb. 4E, Einschub; beachten Sie die schwachen konzentrischen Ringe). Ähnliche Ergebnisse wurden für Nierengranulat (Abb. 4J, Einschub) und für Knochen und ektopische Verkalkungen erzielt, wie in früheren Studien beschrieben33,35.

Wir untersuchten die chemische Zusammensetzung von HS-NPs und Nierengranulat mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX). HS-NPs zeigten Hauptpeaks von Kohlenstoff (C), Calcium (Ca), Sauerstoff (O) und Phosphor (P) (Abb. 4K), was mit dem Vorhandensein eines Calciumphosphatminerals übereinstimmt. Ein niedriger Peak von Silizium (Si) wurde auch in HS-NPs festgestellt (Abb. 4K), der möglicherweise einen kleineren Partikelbestandteil darstellt. Nierenkörnchen zeigten auch Peaks von Kohlenstoff, Calcium, Sauerstoff und Phosphor, was auf ein Calciumphosphatmineral hinweist, zusammen mit zusätzlichen Peaks von Silizium und Eisen (Fe) (Abb. 4L). Uran-Peaks (U) wurden dem Uranylacetat zugeschrieben, das während der Probenvorbereitung als Kontrastreagenz verwendet wurde (das Vorhandensein von Uran in einigen Proben von Mineralpartikeln wie Nierenkörnchen und sein Fehlen im Kontrollgewebe in Abb. 4M kann dem Hoch zugeschrieben werden Affinität von Uran zu Phosphat, wie zuvor berichtet35). Kontroll-EDX-Spektren von Nierengewebe, das die Partikel umgibt, zeigten Spitzen von Kohlenstoff und Sauerstoff (Fig. 4M), was darauf hindeutet, dass Calcium und Phosphor hauptsächlich in den Mineralpartikeln gefunden wurden.

Calcium:Phosphor (Ca:P)-Verhältnisse von HS-NPs und Nierengranulat variierten von 0,65 bis 1,18. Diese Verhältnisse unterscheiden sich von dem theoretischen Wert von 1,67, der für stöchiometrisches Hydroxylapatit beobachtet wurde, liegen aber immer noch innerhalb des Bereichs, der früher für Calciumphosphat- und Apatitkristalle bei verschiedenen Kristallisationsgraden beobachtet wurde15. Zusammen bestätigen diese Befunde, dass die Nierenkörner aus Calciumphosphat-NPs bestehen.

Es wurde festgestellt, dass verschiedene Proteine ​​die ektopische Verkalkung im Körper systemisch hemmen36,37. Darüber hinaus wird angenommen, dass die auf der Oberfläche synthetischer NPs gefundene Proteinkorona die Bioverteilung und die Wirkungen der Partikel auf Zellen in vivo bestimmt38,39. Andererseits ist die Proteinzusammensetzung von mineralo-organischen NPs, die in menschlichen Nierengeweben gefunden werden, noch unvollständig verstanden. Wir haben zuvor festgestellt, dass Albumin, Fetuin-A und Apolipoprotein-A1 (Apo-A1) die Hauptproteine ​​darstellen, die mit mineralo-organischen NPs interagieren, die in Körperflüssigkeiten gebildet werden17,20. Hier haben wir die Immungoldmarkierung verwendet, um das Vorhandensein und die ultrastrukturelle Lage dieser Proteine ​​innerhalb der Nierenkörnchen zu untersuchen.

Wir verwendeten polyklonale Antikörper gegen Humanserumalbumin (HSA), Humanserum-Fetuin-A (HSF), Human-Apo-1A und ganzes HS, um das Vorhandensein von Serumproteinen in HS-NPs und Nierengranulaten zu untersuchen. Die Spezifität der polyklonalen Antikörper (hergestellt wie zuvor beschrieben25) wurde mittels Western-Blotting verifiziert (Abb. 5). Jeder der polyklonalen Antikörper reagierte positiv mit den in vitro hergestellten HS-NPs sowie mit den in menschlichen Nierengeweben gefundenen Mineralgranulaten (Abb. 6A, B, Tafeln A1–A3 und B1–B3; schwarze Punkte). Die Antikörper reagierten hauptsächlich mit den elektronendichten Schichten oder dem dunklen Kern von HS-NPs und Nierenkörnern (Abb. 6A, B), was darauf hindeutet, dass diese dunklen Bereiche im Vergleich zu elektronendurchlässigen Bereichen möglicherweise höhere Proteinkonzentrationen enthalten. Negative Kontrollen, die ohne primären Antikörper durchgeführt wurden, erzeugten keine Reaktion (Fig. 6A, B, Tafeln A4 und B4, Kontrolle). Wir kamen zu dem Schluss, dass Nierengranula mineralo-organische NPs darstellen, die HS-NPs nicht nur aufgrund ihrer Morphologie und Mineralzusammensetzung, sondern auch aufgrund ihrer Bindung an die wichtigsten im Serum vorhandenen Verkalkungsinhibitoren ähnlich sind.

Als nächstes wurde Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um das Vorhandensein von HSA und HSF enthaltenden Mineralgranulaten in erkrankten menschlichen Nieren zu bestätigen. Mit dieser Technik zeigte sich menschliches Nierengewebe

positive Färbung für die beiden Proteine ​​in verschiedenen Bereichen, einschließlich des Interstitiums, das die Nierentubuli umgibt, sowie des Cytoplasmas von Tubulus-abgrenzenden Zellen ( 7A , Tafeln A1 und A2). In diesen Bereichen wurden auch Proteinaggregate festgestellt, die sowohl Albumin als auch Fetuin-A enthielten, wenn auch in geringeren Mengen im Vergleich zur Färbung der einzelnen Proteine ​​(Abb. 7A und Bild A3, gemischte Färbung in Gelb). Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass die durch Immunfluoreszenz nachgewiesene Proteinfärbung eng mit dem Muster der ektopischen Verkalkung überlappte, das bei der von-Kossa-Färbung beobachtet wurde (Abb. 7A, B, Verkalkung ist als schwarzes Material sichtbar, das durch Pfeile in B angezeigt wird). Diese Ergebnisse liefern eine weitere Unterstützung für das Vorhandensein von mineralo-organischen Partikeln in den untersuchten menschlichen Nierengeweben.

Diskussion

Während unser Verständnis der Wechselwirkungen zwischen synthetischen NPs und menschlichen Zellen Fortschritte gemacht hat, wissen wir erheblich weniger über die Auswirkungen von mineralisch-organischen NPs, die sich spontan in Körperflüssigkeiten bilden. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass sich diese Partikel in biologischen Flüssigkeiten bilden, wenn die Konzentrationen von Calcium und Phosphat die Sättigung überschreiten15,16. Wir haben auch beobachtet, dass diese Partikel von Immunzellen internalisiert werden, aber dass nur große Partikel entzündungsfördernde Immunreaktionen induzieren23. Allerdings wurde bisher nicht untersucht, wie sich diese Partikel im menschlichen Gewebe verteilen und ob sie eine physiologische oder pathologische Rolle im Körper spielen.

In der vorliegenden Studie haben wir zum ersten Mal mineralo-organische NPs in den Nieren von menschlichen Patienten nachgewiesen, die entweder an einer Nierenerkrankung im Endstadium oder an Nierenkrebs leiden. Die nachgewiesenen mineralo-organischen NPs enthalten schlecht kristallisiertes Calciumphosphat, ähnlich dem Knochenmineral, sowie Albumin, Fetuin-A und Apo-A1, die als systemische Verkalkungsinhibitoren in Körperflüssigkeiten wirken. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, die das Vorhandensein von Mineral-Protein-Komplexen in Gefäßgeweben und Körperflüssigkeiten beschrieben haben12,13,34,40. Da die von uns beobachteten Partikel in Bereichen gefunden wurden, die keine mikroskopischen Verkalkungen enthielten, deuten unsere Beobachtungen darauf hin, dass die Partikel Vorläufer ektopischer Verkalkung in menschlichem Gewebe darstellen könnten. Angesichts der Möglichkeit, dass mineralo-organische NPs allmählich an Größe zunehmen und unter günstigen Bedingungen eine Partikel-zu-Film-Umwandlung durchlaufen, wie in unseren früheren Studien beschrieben15,18, deuten die hier präsentierten Beobachtungen darauf hin, dass die mineralischen Vorläufer zur Bildung größerer führen können Mineralablagerungen in vivo, wie Randall-Plaque und Nierensteine.

Unsere Beobachtungen, dass mineralische ektopische Verkalkungen und mineralo-organische NPs in verschiedenen anatomischen Strukturen der Nieren gefunden werden, stimmen mit früheren Erkenntnissen über ektopische Verkalkungen in diesem Organ überein41. Die Beobachtungen von Evan et al. deuteten darauf hin, dass die Mineralisierung in den Nieren von Patienten mit Nephrolithiasis hauptsächlich im interstitiellen Gewebe der Henle-Schleifen beginnen und auftreten kann40,42. Diese Autoren beobachteten, dass sich in diesem Bereich bildende Mineralablagerungen aus der basalen Seite des Urothels herausragen und zur Bildung von Nierensteinen führen können. Unsere Beobachtungen deuten darauf hin, dass neben den Henle-Schleifen auch andere Nierenbereiche mineralische NPs enthalten können, die sich schließlich entwickeln können, um große Mineralvorkommen in menschlichen Nieren zu bilden. Wir untersuchen auch die Möglichkeit, dass mineralische NPs, die sich im Blutkreislauf bilden, in Nierengewebe translozieren und ektopische Verkalkung und Steinbildung in den Nieren induzieren können.

Mehrere Nierenkörnchen, die in der vorliegenden Studie entdeckt wurden, werden in intrazellulären oder extrazellulären Vesikeln gefunden (Abb. 4H, I), und diese ähneln den Matrixvesikeln, von denen gezeigt wurde, dass sie eine Verkalkung in Knochen und Zähnen induzieren7,8. Wir haben kürzlich beobachtet, dass aus menschlichem und tierischem Serum isolierte Vesikel die Bildung von mineralischen NPs und mikroskopischen Präzipitaten in vitro induzieren25. Schlieper et al.34 beobachteten auch, dass in Arterien gefundene Mineralpartikel mit Membranstrukturen assoziiert sind, und schlugen vor, dass Matrixvesikel oder apoptotische Körper Nukleatoren von Mineralpartikeln in diesen Geweben darstellen könnten. In ähnlicher Weise haben Khan et al. berichteten, dass Calciumphosphatablagerungen, die in den Nieren menschlicher Patienten mit idiopathischen Nierensteinen gefunden wurden, mit Kollagenfasern und Matrixvesikeln assoziiert sind9. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die in Nierengewebe nachgewiesenen mineralo-organischen NPs über einen Mechanismus bilden können, der Membranvesikel einbezieht, eine Situation, die analog zu dem ist, was in atherosklerotischen Arterien beobachtet wird7,8. Andererseits zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass ektopische Verkalkung, die in Brustarterien von Frauen gefunden wurde, nicht mit osteogenen oder apoptotischen Zellmarkern assoziiert war43, was darauf hindeutet, dass der Mechanismus der Verkalkung spezifisch für das betroffene Organ oder den beteiligten biologischen Kontext sein kann. Darüber hinaus können sich mineralo-organische NPs wie die hierin beschriebenen menschlichen Nierengewebe auch aufgrund eines Versagens bilden, physiologische Konzentrationen von Ionen (z. B. Calcium und Phosphat) und Verkalkungsinhibitoren (z. B. Albumin, Fetuin-A und Apo) aufrechtzuerhalten -A1) in den Körperflüssigkeiten des Menschen.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die elektronendichte Schicht und der Kern von mineralisch-organischen NPs im Vergleich zu den elektronendurchlässigen Bereichen der Partikel einen höheren Gehalt an Proteinen und organischen Molekülen enthalten können (Abb. 6A, B). Diese elektronendichten Schichten scheinen mineralisiert zu sein, wie aus der kristallinen Natur dieses Materials unter TEM hervorgeht (siehe Abb. 4A–J). Andere Autoren, darunter Ryall41 und Evan et al.44, haben vorgeschlagen, dass die elektronendurchlässige Schicht Mineralien darstellen könnte, während elektronendichte Schichten organischen Molekülen entsprechen könnten. Diese Interpretationen können zumindest teilweise auf die Art und Weise zurückzuführen sein, in der die Proben in jeder Studie verarbeitet und untersucht wurden, sowie auf die Art der verwendeten Ausgangsgewebe.

Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der ektopischen Verkalkung können mineralisch-organische Partikel Entzündungen im Nierengewebe hervorrufen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass mineralorganische Nanopartikel die Sekretion von entzündungsförderndem Interleukin-1 durch menschliche Makrophagen zwar nicht induzieren, Mineralaggregate mit einer Größe von mehr als 1 μm jedoch dazu in der Lage sind23. Es wurde gezeigt, dass die Freisetzung von Interleukin-1 als Reaktion auf kristalline Materialien auf der Aktivierung intrazellulärer molekularer Komplexe beruht, die als Inflammasome bezeichnet werden45–47. Darüber hinaus wurden die Mineralpartikel in Nieren nachgewiesen, die Tumore beherbergen, und der Zusammenhang zwischen Krebs und Entzündungen ist inzwischen allgemein anerkannt48. Die Möglichkeit, dass aggregierte Mineralpartikel ein Inflammasom aktivieren und zur Entwicklung von Entzündungen und Krebs in Nieren oder anderen Geweben beitragen, muss noch untersucht werden.

Neben der ektopischen Verkalkung können die hier beschriebenen Mineralgranulate an anderen Krankheitsprozessen beteiligt sein. Zum Beispiel haben wir früher vorgeschlagen, dass mineralische NPs an verschiedene Proteine ​​in Körperflüssigkeiten binden und diese organischen Moleküle aus Körperflüssigkeiten abbauen können20,26. Andererseits kann der menschliche Körper unter normalen Umständen die Bildung und Akkumulation von mineralischen NPs verhindern, indem er sich auf das Vorhandensein von Verkalkungsinhibitoren und das retikuloendotheliale System (dh Makrophagen) verlässt. Mineralische NPs können sich daher erst dann anreichern, wenn die systemische oder lokale Kalziumhomöostase gestört ist und wenn die Schutzmechanismen im menschlichen Körper versagt haben.

Wir schlagen vor, dass der hier entwickelte Nanomaterial-Ansatz verwendet werden kann, um die Bildung mineralo-organischer NPs in tierischen und menschlichen Geweben zu untersuchen. Beispielsweise können Antikörper, die gegen Verkalkungsinhibitorproteine ​​wie Albumin, Fetuin-A und Apo-A1 gezüchtet wurden, in Kombination mit einer Mineralanalyse verwendet werden, um die Bildung mineralo-organischer NPs in den Geweben von Tiermodellen nachzuweisen und zu charakterisieren. Die unter Verwendung dieses Ansatzes erhaltenen Ergebnisse können auf klinische Messungen angewendet werden, die an menschlichen Körperflüssigkeiten durchgeführt werden, um biologische Parameter zu identifizieren, die den Zustand der Bildung von Mineralpartikeln und ektopischer Verkalkung im Körper widerspiegeln. Wir erwarten, dass dieses Wissen zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien zur Vorbeugung und Behandlung menschlicher Krankheiten und Zustände im Zusammenhang mit ektopischer Verkalkung führen kann.

Methoden

Nierengewebe.Die Verwendung von menschlichem Gewebe und die in dieser Studie durchgeführten Experimente wurden vom Institutional Review Board des Chang Gung Memorial Hospital genehmigt; Die Methoden und Experimente wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt. Von den Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Gesundes Kontrollnierengewebe wurde aus Biopsien von Trauma- und Hämatompatienten ohne Nierenerkrankung in der Vorgeschichte gewonnen (n=2); Nierengewebe wurde auch von Nierenkrebspatienten (n=20) und von Patienten mit Nierenerkrankung im Endstadium (n=2) erhalten, deren Nieren während der Transplantation entfernt oder biopsiert wurden (Tabelle 1). Bei Nierenkrebsgeweben wurde der nicht krebsartige Teil des Gewebes präpariert und in der vorliegenden Studie analysiert.

Histologische Analyse.Nierengewebe wurden auf Paraffinblöcke montiert. Die Blöcke wurden geschnitten und Gewebescheiben wurden auf einer Heizplatte bei 70 Grad für 30 Minuten erhitzt, um Paraffin zu entfernen. Die Schnitte wurden dreimal für 15 min in eine frische Xylollösung getaucht, um das restliche Paraffin vollständig zu entfernen. Die Schnitte wurden jeweils 5 Minuten lang mit 95-prozentigem, 80-prozentigem und 70-prozentigem Ethanol rehydriert. Rehydrierte Proben wurden 5 Minuten lang mit bidestilliertem Wasser (ddH2O) gewaschen. Zellkerne wurden mit Hämatoxylin für 8 min gefärbt. Der Farbstoff wurde mit warmem Wasser für 10 min von den Proben entfernt. Nierenproben wurden in ddH2O gespült und zehnmal in 95-prozentiges Ethanol getaucht. Die mit Ethanol behandelten Proben wurden 1 Minute lang mit Eosin Y gegengefärbt. Die Proben wurden jeweils 10 Minuten lang mit 95-prozentigem und 100-prozentigem Ethanol dehydriert, gefolgt von einem 10-minütigen Dehydratisierungsschritt in Xylol. Die endgültigen dehydrierten Nierenproben wurden auf Glasobjektträger mit 50 Prozent Glycerin aufgebracht und unter einem mit einer Digitalkamera ausgestatteten Lichtmikroskop betrachtet.

Entparaffinierte und rehydrierte Proben wurden wie für die H&E-Färbung beschrieben vorbereitet. Rehydrierte Schnitte wurden mit Silbernitrat (5 Prozent) gefärbt, gefolgt von einer 20-minütigen Bestrahlung mit UV-Licht. Die Lösung wurde 15 Minuten lang mit ddH 2 O gewaschen. Die Schnitte wurden mit Natriumthiosulfat (5 Prozent) für 5 Minuten gefärbt, gefolgt von Waschen mit ddH2O für 15 Minuten. Die Schnitte wurden mit Kernechtrot (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) für 5 Minuten gefärbt. Gefärbte Proben wurden nacheinander jeweils 10 Minuten lang mit 95-prozentigem und 100-prozentigem Ethanol dehydriert, bevor sie 10 Minuten lang in Xylol dehydriert wurden. Nierenproben wurden auf Glasobjektträger aufgebracht und wie oben beschrieben untersucht.

Elektronenmikroskopie und EDX-Analyse.Nierenproben wurden unter Verwendung eines LGPS-Dissektionsmikroskops (Olympus, Tokio, Japan) in kleine Stücke mit einer Dicke von weniger als 1 mm geschnitten. Die Gewebe wurden mit 2,5 Prozent Glutaraldehyd und 1 Prozent Paraformaldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer bei 4 Grad über Nacht fixiert. Fixierte Proben wurden dreimal mit 0,1 M Cacodylatpuffer in 8 % Saccharose (pH 7,2) auf Eis für 10 Minuten gewaschen. Gewaschene Gewebe wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) enthaltend 1 Prozent Osmiumtetroxid und 1,5 Prozent Kaliumferrocyanid für 2 Stunden auf Eis inkubiert. Die Gewebe wurden dreimal 10 Minuten lang mit ddH 2 O auf Eis gewaschen. Gewaschene Gewebe wurden auf Eis mit 1 Prozent Uranylacetat in ddH2O für 1 Stunde gefärbt, bevor sie dreimal mit ddH2O auf Eis gewaschen wurden. Nierengewebe wurden jeweils 10 Minuten lang mit 30, 50, 70, 80 und 90 Prozent Ethanol dehydriert, außer wenn Ethanol 70 Prozent erreichte, in welchem ​​Fall die Proben bei 4 Grad über Nacht gelagert wurden. Die Gewebe wurden mit 1 Prozent Phosphorwolframsäure in 95 Prozent Ethanol für 15 Minuten gefärbt, bevor sie mit 95 Prozent Ethanol für 5 Minuten dehydriert wurden. Die Proben wurden jeweils 10 Minuten lang in Propylenoxid bei 40, 57, 67 und 100 Prozent in Ethanol eingetaucht, gefolgt von einem weiteren Eintauchen in 100 Prozent Propylenoxid für 5 Minuten. Nierengewebe wurden jeweils 1 Stunde lang mit 50, 70 und 100 Prozent Eponat 812 (Ted Pella, Redding, CA) infiltriert. Eponate 812--eingebettete Nierenproben wurden durch zweimalige Inkubation in 100 % Eponate hergestellt. Eingebettete Proben wurden über Nacht bei 60 Grad in einem Ofen inkubiert, um eine Harzpolymerisation zu ermöglichen.

Gewaschene HS-NP-Pellets, die wie oben erhalten wurden, wurden mit Glutaraldehyd (2,5 Prozent) und Paraformaldehyd (1 Prozent) in ddH 2 O für 4 Stunden bei 4 Grad fixiert. Fixierte Pellets wurden dreimal für jeweils 10 min mit ddH 2 O gewaschen. Pellets wurden mit aufeinanderfolgenden Inkubationen in 30, 50, 70, 80, 90, 95 und 100 Prozent Ethanol für jeweils 10 Minuten dehydriert, außer wenn Ethanol 70 Prozent erreichte, in dem die Pellets bei 4 Grad über Nacht gelagert wurden. Andere Ethanollösungen wurden nur für 10 min mit den Pellets in Kontakt gebracht. Dehydrierte Pellets wurden mit weißem LR-Einbettungsmedium (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) unter Verwendung unterschiedlicher Verhältnisse von Ethanol und LR-Medium (3:1, 1:1 und 1:3) jeweils 30 Minuten lang infiltriert. Die Pellets wurden vor der Polymerisation über Nacht mit frischem LR-Medium (100 Prozent) infiltriert. Mit LR-Medium infiltrierte Pellets wurden in einem Ofen bei 60 Grad für 2 Tage inkubiert, um eine Harzpolymerisation zu ermöglichen. Nierenblöcke und HS-NPs wurden geschnitten, um Scheiben mit einer Dicke von 70–100 nm unter Verwendung eines Reichert Ultracut S Mikrotoms (Leica, Wetzlar, Deutschland) herzustellen. Gewebeschnitte wurden mit 4 Prozent Uranylacetat gefärbt, bevor sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop JEM 1230 (JEOL, Tokio, Japan), das bei 100 kV betrieben wurde, sichtbar gemacht wurden. Unter Verwendung des gleichen Systems wurden Elektronenbeugungsmuster erhalten. Als Träger wurden Nickelgitter verwendet.

Für die EDX-Analyse wurden Dünnschnitte von Nierengewebe mit Uranylacetat gefärbt und wie oben mit ddH 2 O gewaschen, gefolgt von Trocknen in einem elektronischen Exsikkatorschrank. Die Proben wurden unter einem hochauflösenden JEM 2100-Transmissionselektronenmikroskop (JEOL), das bei 120 kV betrieben wurde, beobachtet. EDX-Spektren wurden dreifach unter Verwendung eines INCA Energy EDS-Systems (Oxford Instruments, Abingdon, UK) erhalten. Dünnschnitte von HS-NPs wurden ohne Färbung beobachtet.

Präparation von mineralo-organischen NPs.Alle Ausgangslösungen wurden vor der Verwendung auf pH 7,4 eingestellt und durch Filtration durch 0,2-μm-Membranen sterilisiert. HS wurde von gesunden menschlichen Freiwilligen unter Verwendung einer herkömmlichen Venenpunktionstechnik erhalten. Die Verwendung menschlicher biologischer Flüssigkeiten in dieser Studie wurde vom Institutional Review Board des Linko Chang Gung Memorial Hospital genehmigt und von den Freiwilligen wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. HS-NPs wurden durch Zugabe von jeweils 3 mM CaCl2 und Na2HPO4 zu DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) mit 10 % HS hergestellt, gefolgt von einer einwöchigen Inkubation unter Zellkulturbedingungen (37 Grad, 5 % CO2, befeuchtete Luft). Die Partikel wurden durch Zentrifugation bei 16,000 × g für 15 Minuten bei 4 Grad pelletiert und zweimal mit HEPES-Puffer (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) unter Verwendung des gleichen Zentrifugationsverfahrens gewaschen.

SDS-PAGE und Western-Blotting.Die SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse wurde im Wesentlichen wie zuvor durchgeführt15. Kurz gesagt, 0,2 ug (Fig. 5A, D) oder 1,2 ug (Fig. 5B, C) HS-Proteine, 47 ug (Fig. 5A, B, D) oder 59 0 ug von HS-NP-Proteinen (Abb. 5C), 0.1 ug HSA (Abb. 5A–D) und 0.6 ug (Abb. 5A, C, D) oder {{23} }.15 ug HSF (Fig. 5B) wurden in 5× "Ladepuffer" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10 % SDS, 0,05 % Bromphenolblau, 50 % Glycerin, 12,5 % - Mercaptoethanol) auf eine Endkonzentration von 1x, vor dem Erhitzen auf 95 Grad für 5 min und Trennung unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen auf einer 10-prozentigen SDS-PAGE unter Verwendung eines Minigelsystems (Hoefer, Holliston, MA). Die NP-Kontrolle (verwendet in Spur 1 von Abb. 5A–D) bestand aus mineralischen NPs, die durch Zugabe von jeweils 3 mM CaCl2 und Na2HPO4 zu DMEM (Endvolumen von 1 ml) und anschließender Inkubation für einen Tag unter Zellkulturbedingungen hergestellt wurden; die Partikel wurden durch Zentrifugation bei 16 000 × g für 15 min pelletiert, zweimal mit HEPES-Puffer gewaschen und in 50 ul HEPES-Puffer resuspendiert. Ein Aliquot von 20 ul resuspendierter Partikel wurde wie oben für SDS-PAGE verarbeitet. PVDF-Membranen wurden für 1 Stunde in 5 Prozent (w/v) entfetteter Milch bei Raumtemperatur blockiert. Die primären Antikörper, die wie zuvor beschrieben intern erzeugt wurden25, wurden in einer Verdünnung von 1:1, 000 ( -apo-A1 und -HS-NP), 1:3, 000 ( -HSF) verwendet. , oder 1:6,000 ( -HSA). Der Ziegen-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Antikörper wurde basierend auf den Anweisungen des Herstellers (Millipore, Billerica, MA) verwendet. Die Blots wurden unter Verwendung von verstärkter Chemilumineszenz (Amersham Biosciences, Amersham, UK) und autoradiographischen Filmen sichtbar gemacht.

Immunogold-Markierung.Proben wurden für die TEM-Beobachtung vorbereitet. HS-NP-Blöcke wurden in Scheiben mit einer Dicke von weniger als 7 0 nm geschnitten. Probenschnitte auf Gittern wurden mit 1 % Fischgelatine (Sigma) in 0,1 M HEPES-Puffer (pH 8,0) für 25 Minuten blockiert. Die Gitter wurden mit den folgenden primären Antikörpern inkubiert: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. Die Negativkontrolle enthielt keinen primären Antikörper (1 Prozent Fischgelatine in HEPES-Puffer). Die inkubierten Schnitte wurden 15 min mit HEPES-Puffer gespült. Gespülte Schnitte wurden mit 1 % Fischgelatine in HEPES-Puffer für 20 Minuten blockiert. Die Proben wurden 1 Stunde lang mit dem sekundären 5-nm-Gold-Konjugat-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG behandelt. Die Proben wurden 10 Minuten lang mit HEPES-Puffer gewaschen, bevor sie 10 Minuten lang mit ddH2O gewaschen wurden. TEM-Beobachtungen wurden wie oben durchgeführt.

Fluoreszenzmikroskopie.Wie oben hergestellte histologische Nierengewebe-Objektträger wurden mit 1 % Rinderserumalbumin für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Objektträger wurden mit primären polyklonalen Antikörpern in einer Verdünnung von 1:4, 000 inkubiert. Nach den Waschschritten wurden die Proben mit den sekundären Antikörpern Ziege-Anti-Kaninchen-FITC (492/520 nm) und Ziege-Anti-Kaninchen-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) bei 1:100 inkubiert 1h. Die Komplexe wurden 15 min mit PBST gewaschen. Der fluoreszierende Farbstoff 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) wurde bei 10 ug/ml für 15 Minuten verwendet. DAPI-gefärbte Proben wurden jeweils 10 Minuten lang mit 95- und 100-prozentigem Ethanol dehydriert, gefolgt von einer weiteren 10-minütigen Dehydratisierung in Xylol. Dehydrierte Nierenproben wurden mit Vectashield-Fluoreszenz-H-1000-Eindeckmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) fixiert und unter einem konfokalen Mikroskop (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Deutschland), das mit einer Spot-Flex-Kamera ausgestattet war, beobachtet.

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