Dichotomische Reaktionen auf chronische fetale Hypoxie führen zu einem vorbestimmten Alterungsphänotyp Ⅱ
Nov 29, 2023
Hypoxisch
Fetale Nieren
Zeigen Sie ein dereguliertes Proteinexpressionsprofil an. Um die molekularen Pfade aufzuklären, die der hypoxiegesteuerten IUGR zugrunde liegen, wurden frisch isolierte Nieren von hypoxischen oder normoxischen E18.5-Feten einer Bottom-up-Proteomprofilierung unter Verwendung eines Nano-LC-Systems (Dionex UltiMate 3{{9 }}00 RSLC), gekoppelt an ein hochauflösendes Orbitrap-Massenspektrometer (Thermo QExactive). Die Hauptkomponentenanalyse zeigte auffällige Unterschiede zwischen den hypoxischen und normoxischen Nieren (Abb. 2A). Insgesamt wurden 6307 Proteine identifiziert (FDR <0,01, Ergänzungstabelle S2), von denen 436 signifikant dereguliert waren (FDR <0,05); 284 mit erhöhter Häufigkeit und 152 mit verringerter Häufigkeit. Funktionelle Annotationsclusterung mithilfe der Genontologie (18–20) ergab eine Anreicherung spezifischer mitochondrialer, lysosomaler, RNA- und DNA-bindender Proteine sowie von Proteinen, die an spezifischen Stoffwechselprozessen oder angeborenen Immunantworten beteiligt sind (Abb. 2, B–D). . Wir haben diese Proteine im Hinblick auf (1) Nephronbildung, (2) metabolische Anpassung und (3) beschleunigtes Altern kategorisiert, wie in den folgenden Abschnitten dargestellt und diskutiert.
Unterdrückte DNA-Replikation und Proteinsynthese tragen zur eingeschränkten Bildung neuer Nephrone bei chronischer Hypoxie bei
Es wurde häufig gezeigt, dass unerwünschte Ereignisse während der Entwicklung, wie chronische fetale Hypoxie, mit einer verringerten Nephronzahl einhergehen (27, 29–32). Ein zugrunde liegender Mechanismus, der diesen Befund überzeugend erklärt, konnte jedoch selten nachgewiesen werden. Die Clusterung aller 64 deregulierten Proteine, die zu den GO-Begriffen „DNA-Bindung“ und „RNA-Bindung“ gehören (eine Heatmap ist in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt), mithilfe der STRING-Datenbank (22) ergab mehrere Subnetzwerke, darunter DNA-Reparatur, DNA-Replikation, mRNA-Spleißen und ribosomale Proteine (Abb. 3A). Eine umfassendere Liste angereicherter Prozesse oder Pfade ist in Abbildung 3B dargestellt (FDR < 0.05). Dabei gehörten „Ribosom“ und „DNA-Replikation“ zu den Oberbegriffen für unterdrückte Proteine, während mRNA-Spleißen und „RNA-Abbau“ zu den Oberbegriffen für induzierte Proteine gehörten. DNA-Reparaturprozesse zeigten ein zweiteiliges Expressionsmuster. Hier wurden Proteine, die an der Nukleotidexzision oder der Reparatur von Fehlpaarungen beteiligt sind, unterdrückt, diejenigen, die die „Base-Exzisionsreparatur“ vermitteln, wurden jedoch induziert. Darüber hinaus war die Häufigkeit des Zellzyklusinhibitors p27Kip1 um das Zweifache erhöht (Abb. 3C) und die des Proliferationsmarkers Ki67 um das Dreifache verringert (Abb. 3D), was zusammen auf eine Verlangsamung der Zelle hinweist Teilungsprozess. Insbesondere wurde das mRNA-Expressionsniveau von Mki67, dem für Ki67 kodierenden Gen, in primären proximalen tubulären Zellen der Maus, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden, signifikant unterdrückt (Abb. 3E). Diese Unterdrückung wurde durch Hypermethylierung der Mki67-Promotorregion in hypoxischen fetalen Nieren vermittelt (Abb. 3F). Daher scheinen in fetalen hypoxischen Nieren die DNA-Synthese, die mRNA-Translation und die meisten DNA-Reparaturprozesse beeinträchtigt zu sein, was die Fähigkeit der Zellen zum Wachstum und zur Proliferation verringert. Zusammenfassend liefern die Proteom-Profiling-Daten hier erstmals molekulare Beweise, die möglicherweise die verminderte Bildung von Nephronen erklären.
Das angeborene Immunsystem und oxidativer Stress werden bei chronischen hypoxischen Zuständen aktiviert
Einer der am häufigsten vorkommenden Begriffe, die in der funktionellen Annotationsanalyse aller 436 Proteine auftauchten, und der oberste für induzierte Proteine, war „Neutrophilen-Degranulation“ (Abb. 2, B und C), was auf eine fortlaufende Aktivierung des angeborenen Immunsystems hinweisthypoxische fetale Nieren. Von den 34 assoziierten Proteinen wurden 29 induziert und fünf unterdrückt (rosa in Abb. 4A). Zu den induzierten Proteinen gehörten viele glykolytische und lysosomenbezogene Enzyme, mehrere Mitglieder der S100A-Proteinfamilie, das inflammatorische Zytokin Macrophage Migration Inhibitor Factor (MIF) sowie die primären und sekundären Granulatproteine Neutrophiles Granulatprotein (NGP) und Myeloperoxidase (MPO). , Cathelicidin (CAMP), Peptidoglycan-Erkennungsprotein 1 (PGLYRP1) und Lactoferrin (LTF). Um die erwartete Invasion von Neutrophilen in hypoxischen fetalen Nieren zu überprüfen und deren Position im Gewebe aufzudecken, wurden Nierenschnitte auf MPO gefärbt. MPO-positive Zellen bildeten Cluster in der nephrogenen Zone der Nierenrinde, in der Nähe von Blutgefäßen, neben dem proximalen Tubulus und konnten gelegentlich in Markregionen hypoxischer Proben gefunden werden (Abb. 4D und ergänzende Abb. S3, A -C). Im Gegensatz dazu zeigten normoxische fetale Nieren keine Infiltration oder Ansammlung von Neutrophilen (Abb. 4C). Es wurde gezeigt, dass Caveolin-1 (CAV1) die transzelluläre Migration von Immunzellen fördert (33). Dementsprechend wurde CAV1 in hypoxischen fetalen Nieren induziert (ergänzende Abbildung S3D), was eine verstärkte Färbung der Nierenblutgefäße zeigte, einschließlich derjenigen, die den kortikalen Bereich der fetalen Niere durchqueren (Abb. 4, E und F). Die Degranulation von Neutrophilen führt zu einem lokalen Ausbruch reaktiver Sauerstoffspezies, was zu erhöhtem oxidativem Stress und Gewebeschäden einschließlich DNA-Oxidation führt. Ein wichtiger Marker der DNA-Oxidation ist 8-Hydroxy-2′-Desoxyguanosin (8-OHdG), das in proximalen Tubuli und in der nephrogenen Zone hypoxischer fetaler Nieren verstärkt war (Abb. 4, G und H) in der Nähe der Neutrophilenclusterung. Dieser Anstieg der durch 8-OHdG geschädigten DNA erfolgte trotz einer gleichzeitigen Induktion von MGMT und OGG1 (Abb. 4, I und J), zwei Enzymen, die für die Entfernung von 8-OHdG verantwortlich sind. Diese Ergebnisse zeigen eine anhaltende Aktivierung des angeborenen Immunsystems in der sich entwickelnden Niere, was zusätzlich zum hypoxischen Stress noch mehr Gewebeschäden verursacht. Zusammen mit der ineffektiven Reparatur dieser Gewebeläsionen könnte ein Teufelskreis in Gang gesetzt werden, der die Nephrogenese weiter beeinträchtigt.
FEIGE. 2. Proteomische Profilierung deckt mehrere mit Hypoxie verbundene Veränderungen auf. Eine Hauptkomponentenanalyse der proteomischen Daten zeigte eine klare Trennung zwischen normoxischen und hypoxischen fetalen Nieren. B–D, funktionale Annotationsclusterung aller signifikant deregulierten Proteine (B), induzierten Proteine (C) und reduzierten Proteine (D). Der signifikant veränderte Anteil eines Signalwegs (x-Achse) wird gegen seine Signifikanz der Anreicherung (y-) aufgetragen. Achse). Die Größe jedes Punkts gibt die Gesamtzahl der Mitglieder in diesem Pfad an. Induzierte Proteine zeigten eine Anreicherung von Stoffwechselprozessen (Glykolyse), mitochondrialen oder lysosomalen Proteinen und Proteinen, die an der Reaktion des Immunsystems beteiligt sind (Degranulation von Neutrophilen), wohingegen reduzierte Proteine für DNA- und RNA-Bindungswege (ein struktureller Bestandteil des Ribosoms) angereichert werden.
(PGLYRP1) und Lactoferrin (LTF). Um die erwartete Invasion von Neutrophilen in hypoxischen fetalen Nieren zu überprüfen und deren Position im Gewebe aufzudecken, wurden Nierenschnitte auf MPO gefärbt. MPO-positive Zellen bildeten Cluster in der nephrogenen Zone der Nierenrinde, in der Nähe von Blutgefäßen, neben dem proximalen Tubulus und konnten gelegentlich in Markregionen hypoxischer Proben gefunden werden (Abb. 4D und ergänzende Abb. S3, A -C). Im Gegensatz dazu zeigten normoxische fetale Nieren keine Infiltration oder Ansammlung von Neutrophilen (Abb. 4C). Es wurde gezeigt, dass Caveolin-1 (CAV1) die transzelluläre Migration von Immunzellen fördert (33). Dementsprechend wurde CAV1 in hypoxischen fetalen Nieren induziert (ergänzende Abbildung S3D), was eine verstärkte Färbung der Nierenblutgefäße zeigte, einschließlich derjenigen, die den kortikalen Bereich der fetalen Niere durchqueren (Abb. 4, E und F). Die Degranulation von Neutrophilen führt zu einem lokalen Ausbruch reaktiver Sauerstoffspezies, was zu erhöhtem oxidativem Stress und Gewebeschäden einschließlich DNA-Oxidation führt. Ein wichtiger Marker der DNA-Oxidation ist 8-Hydroxy-2′-Desoxyguanosin (8-OHdG), das in den proximalen Tubuli und in der nephrogenen Zone hypoxischer fetaler Nieren verstärkt war (Abb. 4, G und H) in der Nähe der Neutrophilenclusterung. Dieser Anstieg der durch 8-OHdG geschädigten DNA erfolgte trotz einer gleichzeitigen Induktion von MGMT und OGG1 (Abb. 4, I und J), zwei Enzymen, die für die Entfernung von 8-OHdG verantwortlich sind. Diese Ergebnisse zeigen eine anhaltende Aktivierung des angeborenen Immunsystems in der sich entwickelnden Niere, was zusätzlich zum hypoxischen Stress noch mehr Gewebeschäden verursacht. Zusammen mit der ineffektiven Reparatur dieser Gewebeläsionen könnte ein Teufelskreis in Gang gesetzt werden, der die Nephrogenese weiter beeinträchtigt.
Stoffwechselanpassungen an Hypoxie führen zu einer ausgeprägten Glykolyse in der fetalen Niere
Chronische Hypoxie ist eine schwere Erkrankung, an die sich Zellen durch Stoffwechselveränderungen anpassen müssen, um zu überleben. Im Vordergrund steht dabei die Aufrechterhaltung der zellulären ATP-Produktion, die bei fehlender ausreichender Sauerstoffversorgung einen Übergang von der oxidativen Phosphorylierung zur Glykolyse erfordert. Von allen Begriffen, die sich aus der funktionalen Anmerkung ergaben, war „glykolytischer Prozess“ der bedeutsamste (Abb. 2B). Alle zehn Enzyme (rot ①–⑩ in Abb. 5A), die für die Umwandlung von Glucose in Pyruvat erforderlich sind, wurden induziertfetale hypoxische Nierenim Vergleich zu normoxischen Kontrollen (eine Heatmap ist in Abb. 5C dargestellt). Darüber hinaus wurden auch die Expressionen des Glukosetransporters 1 (SLC2A1, orange in Abb. 4A) und der Laktatdehydrogenase A (LDHA, dunkelrot in Abb. 5A) verstärkt, was die erhöhte Aufnahme von Glukose in die Zelle und die verstärkte Reduktion von Glukose erleichtern sollte Pyruvat zu Laktat. Die alternative Nutzung von Pyruvat im Zitronensäurezyklus schien durch die verstärkte Expression der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase 1 (PDK1, dunkelrot in Abb. 5A) behindert zu werden (1), die den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex in Mitochondrien und damit die Oxidation von Pyruvat inaktiviert zu Acetyl-CoA; und (2) durch verringerte Mengen an Pyruvatcarboxylase (PC), die die Umwandlung von Pyruvat in Oxalacetat katalysiert. Andererseits wurde Fructose--1,6-Bisphosphatase 1 (FBP1, blau in Abb. 5A) reduziert, was den potenziellen Fluss von Glucose in Richtung Pyruvat weiter steigerte. Alle diese enzymatischen Veränderungen begünstigen die Produktion von Laktat, und tatsächlich war die Laktatkonzentration in hypoxischen fetalen Nieren erhöht (Abb. 5B). Eine erhöhte Laktatproduktion kann zu einer ungünstigen Übersäuerung führen. Dennoch fanden wir unter den angereicherten Proteinen die Monocarboxylattransporter SLC16A3 und SLC5A8 (orange in Abb. 5A), von denen bekannt ist, dass sie Laktat in den extrazellulären Raum ausscheiden, um toxische Auswirkungen der zytoplasmatischen Ansäuerung zu vermeiden. Somit zeigt unser Modell die bemerkenswerte Fähigkeit der fetalen Nieren, sich an chronische Hypoxie anzupassen, indem sie die glykolytische Aktivität erhöhen.
FEIGE. 3. Die Bildung neuer Nephrone bei Hypoxie ist mit einer unterdrückten DNA-Replikation und Proteinsynthese verbunden. Ein aus der STRING-Datenbank abgeleitetes Proteininteraktionsnetzwerk signifikant veränderter DNA- und RNA-bindender Proteine zeigt mehrere Proteincluster: ribosomale Proteine (blau), Proteine, die an der DNA-Replikation (grün), DNA-Reparatur (lila) und mRNA-Spleißen beteiligt sind ( Rot). Der Proliferationsmarker Ki67 (Mki67) ist schwarz markiert, was seine enge Beziehung zur DNA-Reparatur und DNA-Replikation verdeutlicht. B, eine Auswahl von Signalwegen signifikant veränderter DNA- und RNA-bindender Proteine aus KEGG- und Reactome-Datenbanken, die die auffälligsten Veränderungen aufwiesenhypoxische Nieren, dargestellt in absteigender Reihenfolge der Bedeutung. RNA-Spleiß- und RNA-Abbauprozesse wurden angereichert (rot), während RNA-Translation, DNA-Replikation und Reparaturwege unterdrückt wurden (blau). Nur Prozesse mit FDR<0.05 are shown. C and D, the cell cycle inhibitor p27Kip1 was enhanced (unpaired two-tailed t test, Welch's correction, p = 0.0095), whereas the expression of the proliferation marker Ki67 was reduced (unpaired two-tailed t test, Welch's correction, p = 0.0078) in hypoxic fetal kidneys. E, hypoxia reduced the mRNA expression level of Mki67 in mouse primary proximal tubular cells (unpaired two-tailed t test, p < 0.0001). F, this reduction was mediated by hypermethylation of the Mki67 promoter in hypoxic fetal kidneys. Open circle unmethylated, black circle methylated (Fisher's exact test, p = 0.0016; Mann–Whitney U-test, p = 0.0431)
FEIGE. 4. Proteine, die an Entzündungsreaktionen und oxidativem Stress beteiligt sind, werden unter Hypoxie in neu gebildeten Nephronen angereichert. A: Darstellung aller 34 signifikant veränderten Proteine für die als Neutrophile-Degranulation bezeichnete Anmerkung (rosa Kreise) unter allen signifikanten (größere graue Kreise) und nicht signifikanten (kleinere graue Kreise) Proteinen unseres Datensatzes. 29 hatten ein höheres Abundanzniveau, während fünf reduziert waren. B, eine Heatmap, die alle rosa Proteine in (A) und ihre Induktion oder Unterdrückung bei Hypoxie zeigt, dargestellt in absteigender Reihenfolge der Proteinhäufigkeit. C–H, repräsentative immunhistochemische Bilder von E18.5 normoxisch oderhypoxische Nierenzeigt die Infiltration von Neutrophilen und oxidativen Stress. C und D, die Immunhistochemie für den Neutrophilenmarker Myeloperoxidase (MPO) ergab eine Anhäufung dieser Zellen in der Nähe neu gebildeter Nephrone (Sternchen) und neben renalen Blutgefäßen (Pfeilspitze) hypoxischer fetaler Nieren (D). In normoxischen Kontrollen (C) waren MPO-positive Zellen selten vorhanden. (Maßstabsbalken 100 μm). E und F, Immunhistochemie, die eine erhöhte Expression von Caveolin-1 (CAV1) in renalen Blutgefäßen hypoxischer fetaler Nieren (F) im Vergleich zu Kontrollen (E) zeigt (Maßstabsbalken 200 μm). G und H, 8-Hydroxy-2′-Desoxyguanosin (8-OHdG), ein Marker für oxidative DNA-Schäden, waren in neu gebildeten Nephronen (Sternchen) in der Nierenrinde und in deutlich erhöht Zellen der proximalen Tubuli (Pfeil) hypoxischer Nieren (H), wohingegen in normoxischem Gewebe (G) nur wenige Zellen gefärbt waren (Maßstabsbalken 200 μm). I und J, dieser Anstieg der DNA-Schäden trat trotz eines gleichzeitigen Anstiegs der O-6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT; ungepaarter zweiseitiger t-Test, p=0.0002) (I) und {{ 15}}Oxo-Guanin-Glykosylase (OGG1; ungepaarter zweiseitiger t-Test, p=0.0063) (J), zwei Enzyme, die an der Reparatur oxidierter DNA beteiligt sind.
Dies gewährleistet eine ausreichende ATP-Produktion und ein Überleben unter diesen widrigen Bedingungen.
Fetale Hypoxie fördert den kompensatorischen Import mitochondrialer Proteine und den Aufbau der Atmungskette
Neben einer verstärkten Glykolyse fanden wir mehrere Veränderungen in der mitochondrialen Proteinhäufigkeit (eine Heatmap ist in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt). Die Erzeugung von Proteinnetzwerken mithilfe von STRING ergab mehrere Cluster, die Proteine umfassen, die an der Translokation von Proteinen in Mitochondrien, der oxidativen Phosphorylierung und mitochondrialen ribosomalen Proteinen beteiligt sind (Abb. 5, D und E). Bemerkenswert ist, dass mehrere Proteine induziert wurden, die mit der inneren Mitochondrienmembran verbunden sind, dem Ort, an dem die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) stattfindet. OXPHOS umfasst fünf Multiproteinkomplexe, die entlang der inneren Mitochondrienmembran angeordnet sind. Zu den induzierten Proteinen gehörten Komponenten der OXPHOS-Komplexe (NDUSF6), III (UQCR10), IV (COX6B1, COXC und COX7A2) und V (ATP5J, MTATP8), aber auch UQCC3 und SCO2, die für den korrekten Aufbau und die Funktion erforderlich sind von Komplex bzw. IV (Abb. 5D und ergänzende Abb. S4). SDHC und SDHD, Untereinheiten des Komplexes II, wurden ebenfalls hochreguliert (1,6-- bzw. 2,5--fache), erreichten jedoch keine statistische Signifikanz. Darüber hinaus wurden nicht nur Komponenten der Atmungskette im Fötus angereicherthypoxische Nieren, aber auch eine Vielzahl von Proteinen, die ihren Import in die Mitochondrien vermitteln. Dazu gehörten Mitglieder der Außenmembran-Translokase (TOM – TOMM22) und des Innenmembran-Translokase-Komplexes TIM22 (TIMM22, TIMM9 und TIMM10) sowie der zugehörige TIMM8-TIMM13--Komplex (Abb. 5D und ergänzende Abb . S4). Unter den 21 mitochondrialen Proteinen mit reduzierter Häufigkeit befanden sich vier mitochondriale ribosomale Proteine sowie Proteine, die am Aminosäurekatabolismus, der Vitaminbiosynthese oder der Fettsäure-Beta-Oxidation beteiligt sind (Abb. 5, D und E und ergänzende Abb. S4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine potenzielle mitochondriale Dysfunktion und offensichtliche Bemühungen, beschädigte Proteine zu regenerieren, trotz verstärkter Glykolyse und insgesamt verringerter Proteinsynthese abgewendet werden können.
Lysosomale Biogenese und Autophagie werden verbessertHypoxische fetale NierenDas Lysosom war das zweite Organell, das unter hypoxischen Bedingungen angereichert zu sein scheint. Allerdings waren im Vergleich zu Mitochondrien, wo 36 % der Proteine reduziert waren, fast alle Lysosomen-bezogenen Proteine hochreguliert (Abb. 6, A und B). Darunter waren neun lysosomale Säurehydrolasen, die fast 20 % der im KEGG-Weg für Lysosomen annotierten lysosomalen Säurehydrolasen darstellten: vier Proteasen (CTSA, CTSF, CTSZ, TPP1), drei Glykosidasen (GAA, NAGA, NEU1), die lysosomale saure Phosphatase 2 (ACP2) und die lysosomale saure Lipase A (LIPA). Darüber hinaus fanden wir Hinweise auf eine erhöhte Biogenese von Lysosomen und verwandten Organellen. Drei der acht BLOC1-Komponenten (Biogenesis of Lysosome-Related Organelles Complex 1) wurden signifikant induziert (Abb. 6, C–E) sowie der H/Cl-Austauschtransporter 5 (CLCN5), der eine entscheidende Rolle spielt Ansäuerung der Endosomen (Abb. 6F). Bemerkenswert ist, dass Snapin (BLOC1-Untereinheit 7) auch eine Rolle bei der lysosomalen Ansäuerung sowie bei der Reifung und Funktion von Autophagosomen spielt. Andere induzierte Proteine, von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle bei der Autophagie spielen, waren Atg7 und Bnip3 (Abb. 6, G und H). Eine weitere Voraussetzung für den autophagischen Fluss ist die perinukleäre Clusterbildung von Lysosomen, die durch den lysosomalen Ragulator-Komplex (35, 36) und zwei gegensätzliche Motorproteinfamilien vermittelt wird. Bemerkenswerterweise wurden vier der fünf Mitglieder der Regulator-Gerüstuntereinheiten (LAMTOR1, 2, 3 und 5) signifikant induziert (Abb. 6, A und B); LAMTOR4 wurde ebenfalls 1,81-fach induziert, erreichte jedoch keine statistische Signifikanz. Darüber hinaus zeigten Kinesine, die die Auswärtsbewegung von Organellen vermitteln, eine Tendenz zur Unterdrückung, wohingegen Mitglieder der Dyneinfamilie, die die Einwärtsbewegung erleichtern, induziert wurden, wenn auch nicht statistisch signifikant (ergänzende Abbildung S5). Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse starke Beweise dafür, dass die Haushaltsfunktion von Lysosomen verbessert wirdfetale hypoxische Nieren, voll kompatibel mit der erwarteten Notwendigkeit, beschädigte Mitochondrien zu erneuern.
Verfrüht
Das Altern veranschaulicht die janusköpfigen Aspekte der hypoxischen Anpassung. Im Gegensatz zu den kompensatorischen Reparatur- und Verjüngungsmechanismen fanden wir 15 der deregulierten Proteine, die zum GO-Begriff „Alterung“ (Abb. 7A) gehören und die dritte Kategorie hypoxischer Anpassungen repräsentieren: beschleunigtes Altern . Während die meisten dieser Proteine bei einem der oben beschriebenen Prozesse eine Rolle spielen, sind Neutrophilen-Degranulation und Lysosomen (MIF, MPO, PSEN1), Mitochondrien (NDUFS6, FADS1, MTCO1, CYP27B1), Glykolyse (ALDOC) und DNA-Reparatur (OGG1) ; Es wurde beschrieben, dass einige davon einen direkten Einfluss auf die Lebensdauer von Mäusen haben. Insbesondere war die Proteinhäufigkeit von Klotho und Sirtuin 6 bei hypoxischen E18.5-Patienten verringertfötale Nieren(Abb. 7, B und C). Sirtuin 6 ist ein allgegenwärtig exprimiertes Enzym mit Protein-Deacetylase- und Mono-ADP-Ribosyltransferase-Aktivität, das an der Regulierung verschiedener Zellfunktionen, einschließlich Entzündung, Glykolyse und DNA-Reparatur, beteiligt ist. Sein Knockout führt bei Mäusen zu schwerer Progerie mit einer verkürzten Lebensdauer von 1 bis 3 Monaten (37, 38). Die Niere ist der Hauptstandort der Klotho-Synthese (d. h. der distale gewundene Tubulus – DCT trägt den Großteil des Proteins bei, zusätzlich wird die Synthese in den proximalen gewundenen Tubuli durchgeführt), wo es lokal als membrangebundene Beta-Glucuronidase wirkt. Die verringerte Häufigkeit von Klotho scheint ein spezifischer Prozess zu sein, da andere Proteine des DCT, einschließlich CALB1, nicht verändert wurden. Klotho wird auch in den Kreislauf ausgeschieden, entweder durch Spaltung des extrazellulären Teils der membrangebundenen Form oder durch Translation einer alternativen Spleißvariante. Der Spiegel an zirkulierendem Klotho (sKL) nimmt mit dem Alter ab (39, 40), was uns dazu veranlasste, seine Konzentration und die von Sirtuin 6 im Stammblut von hypoxischen oder normoxischen E18.5-Feten zu bestimmen. Tatsächlich waren die Konzentrationen von sKL und Sirtuin 6 bei hypoxischen E18.5-Feten signifikant verringert (Abb. 7, D und E). Darüber hinaus und was wichtig ist, waren die Serumspiegel von Klotho und Sirtuin 6 auch bei älteren Mäusen immer noch deutlich reduziert (Abb. 7, F und G), was auf eine dauerhafte Reduktion dieser beiden Proteine während des gesamten Lebens hinweist. Für Klotho scheint dies auf deutlich verringerte mRNA-Expressionsniveaus in den Nieren von {{22} Monate alten hypoxischen Nachkommen zurückzuführen zu sein (Abb. 7H). Allerdings blieben die renalen mRNA-Expressionsniveaus von Sirtuin 6 zwischen gealterten normoxischen und hypoxischen Mäusen unverändert (Abb. 7I). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Veränderungen in der DNA-Methylierung einer der wichtigsten Mechanismen sind, nicht nur für die Erneuerung und Differenzierung von Nephron-Vorläuferzellen (41), sondern auch für die Klotho-Expression (42, 43). Im Gegensatz zur Hypermethylierung von Mki67 (Abb. 3F) war der Klotho-Promotor jedoch während chronischer Hypoxie hypomethyliert (ergänzende Abb. S6). Das Methylierungsmuster von Sirt6 konnte nicht bestimmt werden. Nach unserem besten Wissen ist unser IUGR-Modell das erste, das einen Mechanismus beschreibt, der zu einem vorzeitigen Alterungsphänotyp führt, und zwar durch Synergien aus entzündlichen Schäden, ineffektiver Reparatur, verändertem Stoffwechsel und verringerter Häufigkeit von Anti-Aging-Proteinen, die bereits bei der Geburt auftreten.
Die Reduzierung von Anti-Aging-Proteinen als Reaktion auf chronische Hypoxie ist bei Mäusen und Männern konservativ. In einer letzten Reihe von Experimenten haben wir gefragt, ob das Zusammenspiel zwischen chronischer Hypoxie und verringerten Serumspiegeln von Anti-Aging-Proteinen ein evolutionär konserviertes Phänomen ist. Zu diesem Zweck wurden Serumproben aus einer kontrollierten Studie (10) mit neun gesunden Freiwilligen (acht Männer, eine Frau) zwei Wochen zuvor (Meeresspiegel, SL) zu drei Zeitpunkten während eines ununterbrochenen 28-Tages entnommen Aufenthalt auf 3454 m (große Höhe, HA3, HA9, HA28) und 1, 7 und 14 Tage nach ihrer Rückkehr nach SL (RSL1, RSL7, RSL14) wurden auf sKL und SIRT6 analysiert (Abb. 8). Die bei SL gewonnenen Proben dienten als Kontrollen für jeden Teilnehmer. Die sKL- und SIRT6-Serumspiegel sanken in großen Höhen und erreichten beide bei H28 statistische Relevanz. Bei der Rückkehr zum Meeresspiegel stieg der sKL bei RSL7 auf ein höheres Niveau als vor dem Aufenthalt in großer Höhe und normalisierte sich bei RSL14 wieder (Abb. 8A). Andererseits nahm SIRT6 nach der Rückkehr zum Meeresspiegel weiter ab und begann erst bei RSL14 wieder zu steigen (Abb. 8B), was auf eine unterschiedliche Regulierung dieser beiden Anti-Aging-Proteine hindeutet. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse nahe, dass verringerte Klotho- und Sirtuin-6-Spiegel im Serum im Allgemeinen eine Exposition gegenüber chronischen hypoxischen Zuständen erfordern und somit einen evolutionär hochkonservierten Prozess darstellen könnten.
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