Die Exposition gegenüber Dieselabgasen verändert die Expression von Netzwerken, die an der Neurodegeneration im Gehirn von Zebrafischen beteiligt sind, Teil 2

Vorbereitung der Proteinprobe

Um Proteinproben vorzubereiten, wurden die Köpfe von 80 bis 100 anästhesierten Larven (5 pdf) sorgfältig isoliert und mit PBS gewaschen, bevor sie in einen Lysepuffer überführt wurden, der aus 15 % vorgekühltem TCA/Aceton mit 0,07 % Beta-Mercaptoethanol (ME) bestand ) und Protease-Inhibitor-Cocktail (benötigt Hersteller) in einem Gesamtvolumen von 500 µl.

In den letzten Jahren gab es großes Interesse an den Auswirkungen von Proteinproben auf das Gedächtnis. Immer mehr Menschen erkennen die Bedeutung der Ernährung für die Gesundheit, insbesondere die wichtige Rolle von Proteinen im menschlichen Körper.

Proteine ​​sind die Grundbausteine ​​des menschlichen Körpers und spielen im menschlichen Körper eine wichtige Rolle. Aus diesem Grund sind Proteinproben für viele Menschen zu einem wichtigen Kanal in ihrem Streben nach Gesundheit und Schönheit geworden. Neben dem Muskelaufbau und der Körperformung können Proteinproben auch das Gedächtnis einer Person verbessern.

Einige Wissenschaftler haben die Beziehung zwischen Proteinen und dem Gedächtnis untersucht. Sie fanden heraus, dass die langfristige Einnahme ausreichender Proteine ​​sich positiv auf alle Aspekte der körperlichen Gesundheit auswirkt, insbesondere auf das Gedächtnis. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Proteinaufnahme über die Nahrung einen wichtigen Einfluss auf die Gehirnfunktion und das Gedächtnis hat.

Protein ist ein wichtiger Bestandteil von Neuronen im menschlichen Gehirn, daher hat die tägliche Proteinaufnahme einen wichtigen Einfluss auf das Gedächtnis und die Denkfähigkeit des Menschen. Eine langfristige Proteinzufuhr deckt nicht nur den Proteinbedarf des Körpers, sondern hilft auch dem Gehirn, aktiv und gesund zu bleiben.

Darüber hinaus kann Protein dem Körper helfen, das Blutzuckergleichgewicht aufrechtzuerhalten und eine stabile Stimmung aufrechtzuerhalten. Dies ist sehr wichtig für die Aufrechterhaltung des Gedächtnisses und der Denkfähigkeit. Daher kann eine moderate Proteinzufuhr dazu beitragen, verschiedene kognitive Funktionen und emotionale Zustände des menschlichen Körpers zu verbessern.

Insgesamt besteht ein enger Zusammenhang zwischen Proteinproben und dem Gedächtnis. Eine erhöhte Proteinzufuhr trägt dazu bei, Ihr Gehirn und Ihren Körper gesund zu halten und Ihr Denkvermögen und Ihr Gedächtnis zu verbessern. Für Menschen, die ihr Gedächtnis verbessern müssen, ist es sehr wichtig, eine angemessene Menge Protein zu sich zu nehmen. Um einen gesunden Körper und einen scharfen Geist zu erhalten, sollten wir proteinhaltige Lebensmittel angemessen essen und auf vernünftige Mahlzeiten achten. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola antioxidative, entzündungshemmende und Anti-Aging-Wirkungen hat, die dazu beitragen können, Oxidations- und Entzündungsreaktionen im Gehirn zu reduzieren und so das Gehirn zu schützen Gesundheit des Nervensystems. Darüber hinaus kann Cistanche deserticola auch das Wachstum und die Reparatur von Nervenzellen fördern und so die Konnektivität und Funktion neuronaler Netzwerke verbessern. Diese Effekte können dazu beitragen, das Gedächtnis, das Lernen und die Denkgeschwindigkeit zu verbessern und können auch die Entwicklung kognitiver Dysfunktionen und neurodegenerativer Erkrankungen verhindern.

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Nach kurzer Homogenisierung wurden die Proteine ​​12 Stunden lang bei 2 {6}} Grad ausgefällt, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation bei 12 {3} U/min bei 4 Grad. Der Überstand wurde entfernt und das Proteinpellet wurde zweimal mit kaltem Aceton (enthaltend 0.07 % ME und Proteaseinhibitor-Cocktails) gewaschen. Das endgültige Proteinpellet wurde in einem Lysepuffer mit 7,0 M Harnstoff gelöst. und 2,0 M Thioharnstoff durch Ultraschallbehandlung auf Eis.

Die solubilisierten Proteinproben wurden 10 Minuten lang bei 4 Grad mit 15 000 U/min zentrifugiert, um unlösliche Partikel auszufällen, und die Konzentration der endgültigen Proteinproben wurde unter Verwendung der Bradford-Methode gemessen.

TMT-basierte Hochdurchsatz-Proteomanalyse

Die Proben wurden durch die aufeinanderfolgende Zugabe von Trypsin und Lys-C-Proteasen reduziert, alkyliert und verdaut. Anschließend wurden die Peptide mit isobaren 10-plexTMT-Tags gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Markierte Proben wurden gemischt und dann mittels Umkehrphasenchromatographie bei hohem pH-Wert fein fraktioniert.

Einzelne Fraktionen wurden dann mittels LC-MS/MS unter Verwendung von Online-Umkehrphasenchromatographie und Tandem-Massenspektrometrie auf einem Thermofsher Fusion Lumos-Massenspektrometer analysiert. Die Daten wurden mit der synchronen Vorläuferauswahl-basierten MS3-Methode erfasst, wie zuvor beschrieben (McAlister et al. 2014). Die Datenbanksuche und die Extraktion von TMT-Reporterioneninformationen wurden mit der MaxQuant-Softwareplattform durchgeführt (Cox und Mann 2008).

Der Vergleich der TMT-Daten zwischen den Proben wurde mit MSStats durchgeführt (Choiet al. 2014). Transkriptomanalyse Ungefähr 80–100 Köpfe wurden aus anästhesierten Embryonen isoliert (120 Stunden), mit PBS gewaschen und einer vollständigen RNA-Extraktion mit Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis) unterzogen , USA) Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Die Qualität und Quantität der RNA wurde mit einem NanoDrop2000-Spektrophotometer (Thermo Scientific, MA) und darüber hinaus mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer bewertet, um eine Mindestkonzentration von 50 ng/ul und eine RNA-Integritätszahl (RIN) von 8 sicherzustellen. Anschließend wurde die Bibliotheksvorbereitung mit einem Illumina HiSeq4000 gemäß durchgeführt das Protokoll: „TruSeqStranded Total RNA Library Prep Workflow with Ribo-Zero Gold“, und die Proben wurden unter den folgenden Bedingungen sequenziert: „Paired End run, R1=75 Zyklen (Antisense-Strang), Index=8 Zyklen, R2=75 Zyklen (Sinnstrang).“

Datenanalyse

Beide Datensätze für proteomische und transkriptomische Studien wurden gleichzeitig hochgeladen und mit dem Online-Tool Metascape analysiert, das die Annotation von Genen für verschiedene Arten ermöglicht, darunter Danio rerio (Zhou et al. 2019). analysiert durch den Einsatz der Software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Krämer et al. 2014).

Datensätze mit Gen- oder Proteinidentifikatoren und entsprechenden Expressionswerten wurden in die Anwendung hochgeladen. Jeder Bezeichner wurde dem entsprechenden Objekt in der Wissensdatenbank von Ingenuity zugeordnet.

Zur Identifizierung von Molekülen, deren Expression unterschiedlich reguliert wurde, wurde ein Expressionsänderungsgrenzwert von 1,3- festgelegt. Die Funktionsanalyse identifizierte die biologischen Funktionen und/oder Krankheiten, die für den Datensatz am bedeutsamsten waren. Für die Analyse wurden Moleküle aus dem Datensatz berücksichtigt, die den Grenzwert erfüllten und mit biologischen Funktionen assoziiert waren. Der exakte Test von Right-tailedFisher wurde verwendet, um einen p-Wert zu berechnen, der die Wahrscheinlichkeit bestimmt, dass jede diesem Datensatz zugeordnete biologische Funktion und/oder Krankheit allein auf Zufall zurückzuführen ist.

Pathway-Analyse

Um den Beitrag von Veränderungen des Proteom- oder Transkriptomprofils in bestimmten Signalwegen zu bewerten, wurden beide Datensätze in die IPA-Software hochgeladen (Krämer et al. 2014). Die signifikantesten veränderten kanonischen Signalwege wurden dann mithilfe von PCR und Western Blot weiter ausgewertet und interpretiert, wie unten beschrieben.

Western Blot

Insgesamt 25 µg Proteine ​​wurden auf eine 12 % NuPAGE (Novex, CA) geladen und wie beschrieben auf PVDFmembranen (Novex, CA) übertragen (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 0,01 % Tween 20 (TBST-Puffer) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert und dann über Nacht bei 4 Grad entweder mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) oder monoklonalem Maus-Anti-GAPDH ( Abcam, CA), verdünnt in TBST-Puffer mit 1 % Magermilch.

Nach dem Waschen in TBST wurden die Blots 2 Stunden lang mit sekundären Esel-Anti-Kaninchen-HRP-Antikörpern (Abcam, CA) oder Ziegen-Anti-Maus-HRP-Antikörpern (Santa Cruz, CA) inkubiert, gefolgt von der Entwicklung mit Pierce™ ECL Plus Western-Blot-Substrat( Thermo Fisher Scientific, USA). Die Banden wurden durch Bildgebung mit einem LI-COR-Scanner sichtbar gemacht und mittels Densitometrie analysiert (LI_COR Biosciences, NE).

Echtzeit-PCR

Die Gesamt-RNA wurde aus den Köpfen mit TRIzol-Reagenz (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und dann mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Scientific, MA) gemessen. Eine Menge von 1 µg jeder RNA-Probe wurde unter Verwendung des iScript™-Reverse-Transkriptions-Supermix (Bio-Rad, CA) revers transkribiert, und eine Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung des SsoAdvancedUniversal SYBR Green-Supermix (Bio-Rad, CA) durchgeführt. Die Primer sind aufgeführt in der Ergänzungstabelle 1. Die relativen Expressionsniveaus wurden mit der 2−ΔΔCT-Methode berechnet und der statistische T-Test wurde verwendet, um die signifikanten Unterschiede zu bewerten.

Resultate und Diskussion

Proteomische und transkriptomische Analysen sind zwei wichtige Instrumente zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die Krankheitsprozessen und Reaktionen auf Umweltreize zugrunde liegen (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012). . Hier führten wir tiefgreifende Expressionsanalysen sowohl auf transkriptomischer als auch auf proteomischer Ebene in den Köpfen von Zebrafischembryonen durch, die DEPe ausgesetzt waren.

Die Köpfe, die größtenteils aus Hirngewebe bestehen, wurden isoliert, um die Expressionsprofile anderer Gewebe zu eliminieren, da wir an der Bestimmung intrinsischer pathologischer Pfade des ZNS interessiert sind.

Das Ausdrucksprofil der Köpfe von Zebrafischembryonen

Die Profilanalyse ergab 11.172 nachgewiesene Proteine ​​und 14.748 mRNA-Ziele aus mehr als 26 kodierenden Genen (Howe et al. 2013). Von den 11.172 Proteinen, die aus den TMT-markierten Proben identifiziert wurden (Ergänzungstabelle 2), waren 141 Proteine ​​deutlich hochreguliert und 607 herunterreguliert (Ergänzungstabelle 3 und Abb. 1a). In ähnlicher Weise wurden 367 Transkripte hochreguliert und 149 unter den 14.748 Transkripten (Ergänzungstabelle 4), die in der RNA-seq-Analyse nachgewiesen wurden (Abb. 1b und Ergänzungstabelle 5), herunterreguliert.
In den meisten Fällen stimmten die Ergebnisse der hochregulierten proteomischen und transkriptomischen Analysen überein. Zu den am stärksten hochregulierten Proteinen gehören beispielsweise Cytochrom P450 Cyp1a, Cyp1c1, die Guaninnukleotid-bindende Proteinuntereinheit Gamma, Annexin, die kurze Isoform von Plexin B2b, Mitglied der Dehydrogenase/Reduktase (SDR-Familie) 13-wie 1, S-Antigen der Netzhaut/Zirbeldrüse (Arrestin) b und Sulfotransferase6B1.

Ebenso gehören zu den Genen mit der höchsten Transkriptomikuregulation Cytochrom P450 (Cyp1a), der Chemokin-Ligand 27a (C-C-Motiv), der Aryl-Kohlenwasserstoffrezeptor-Repressor A, Cytochrom P450 (Cyp1b) und das C-Glykoprotein der Rh-Familie. Herunterregulierte Proteine ​​und Transkripte hingegen waren nicht immer stark korreliert.

Beispielsweise gehören Complexin 2, Spectrin alpha, die leichte Kette von kardialem Myosin-1, das mit SEC23 interagierende Protein, die ATP-Synthase-Membranuntereinheit EA, Cytochrom b und die NAD-abhängige Proteindeacetylase zu den am stärksten herunterregulierten Proteinen, während das Membranprotein 1a des Retinaloutersegments zu den am stärksten herunterregulierten Proteinen gehört , gelöste Trägerfamilie 5 (Iodidtransporter), FBJ murines Osteosarkom-Virus-Onkogen-Homolog B, Complexin 4c, FOSlike-Antigen 1a, Opsin 1 und v-fos zeigen die stärkste Herunterregulierung der Transkription (Tabellen 1 und 2).

Antikörper, die Zebrafischproteine ​​erkennen, sind begrenzt, wir haben jedoch eine Probe dieser Veränderungen mithilfe einer Western-Blot-Analyse bestätigt. Die Hochregulierung des Cyp1A-Proteins und die Herunterregulierung von Complexin 2 (CPLX2) wurden unter Verwendung von GAPDH als Ladekontrolle bestätigt (Abb. 2a). Höhere Werte an TAT- und UGT1B1-Transkription und niedrigere Werte an CHNRB und TH2 wurden auch durch qPCR unter Verwendung von Elf-alpha als interner Kontrolle bestätigt (Abb. 2b).

Genanmerkung

Es gibt mehrere Online-Bioinformatik-Tools und -Software, die nützliche Informationen zur Genannotation liefern können. In dieser Arbeit wurde unter anderem Metascape mit der Fähigkeit zur Genannotation für Danio rerio (Zhouet al. 2019) verwendet.

Beide Datensätze für proteomische und transkriptomische Studien wurden gleichzeitig hochgeladen und mit diesem Online-Tool analysiert. Nach der Kombination der Ausgabe von proteomischen und transkriptomischen Veränderungen in der Software wurden mehrere Prozesse wie die Reaktion auf xenobiotische Reize, der Metabolismus von Xenobiotika durch Cytochrom P450 und die zirkadiane Regulierung der Genexpression analysiert wurden durch DEPe-Behandlung induziert gefunden (Abb. 3a).

Diese Analyse deutete auch auf unterdrückte Ebenen biologischer Prozesse wie „visuelle Wahrnehmung“, „Phototransduktion“ und „G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Internalisierung“ hin. Die Veränderungen in den sehbezogenen Expressionsprofilen waren nicht unerwartet, da die DEPe-Behandlung während der frühen Entwicklung zu kleineren Augen führte (Daten nicht gezeigt).

Xenobiotische Stoffwechselsignale

Xenobiotika, bei denen es sich um fremde natürliche oder synthetische chemische Verbindungen handelt, können die zelluläre Stressreaktion auslösen und zu Differenzierung, Proliferation, Apoptose oder Nekrose führen. Tatsächlich muss sich der Körper aktiv vor Xenobiotika sowie toxischen endogenen Verbindungen und ihren Metaboliten schützen, und zwar durch die Expression von Enzymen und Transportern, die an ihrer Eliminierung und Entgiftung beteiligt sind.

Diese Enzyme werden in drei Gruppen eingeteilt: Phase-I-Enzyme (CYP, ALDH, FMO), die Polarität in die Xenobiotika einführen; Phase-II-Enzyme (UGT, GST, SULT), die Hydrophilie durch Konjugation hydrophiler Moleküle wie Sulfat, Glucuronsäure und Glutathion an die Xenobiotika einführen; und Phase-III-Enzyme (MDR1, OATP2, MRP), die die Xenobiotika oder Konjugate transportieren, die während Phase II gebildet werden in den extrazellulären Bereich.

Diese Enzyme werden durch Signalkaskaden induziert, an denen spezifische Rezeptoren (CAR, PXR, AHR) und MAPK-vermittelte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NRF2, MAF) beteiligt sind (Omiecinski et al. 2011).

In Abwesenheit von Aktivatoren befindet sich der konstitutiv aktive Rezeptor (CAR) als Komplex mit CCRP und HSP90 im Zytoplasma. Wenn jedoch ein Aktivator vorhanden ist, verlagert sich CAR in den Zellkern und bindet an RXR, um ein Heterodimer zu bilden, und bindet außerdem an mehrere Varianten des Wiederholungsmotivs, wie DR3, DR4, ER6 und ER8, und trägt zur Regulierung der Genexpression bei (Ergänzungstabelle 2).

Unsere Proteomikanalyse ergab die Aktivierung des xenobiotischen Stoffwechsels. Tatsächlich zeigt die deutliche Hochregulierung von CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (Hämoxygenase 1), CAT (Katalase) und CES1 (Carboxylesterase 1) die Induktion des Phase-I-Metabolismus, während gleichzeitig die Expression von UGT1A1 (UDP-Glucuronosyltransferase-Familie 1, Mitglied A1) und GSTP1 ( GlutathionS-Transferase pi 1) zeigt die Aktivierung des PhaseII-Metabolismus an.

Interessanterweise deutet die Herunterregulierung von Sulfattransferasen wie SULT1A1 (Sulfotransferasefamilie 1A, Mitglied 1), SULT1C2 (Sulfotransferasefamilie 1C, Mitglied 2) und SULT2B1 (Sulfotransferasefamilie 2B, Mitglied 1) darauf hin, dass die zunehmende Hydrophilie im Phase-II-Metabolismus tendenziell vorzugsweise durch Konjugation mit Glucuronsäure und Glutathion erfolgt , aber keine Sulfatkonjugation (Abb. 4).

Die Ergebnisse der transkriptomischen Studie sind ziemlich konsistent, da CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 und UGT1A1 alle auf der RNA-Ebene hochreguliert sind. Allerdings zeigt SULT2B1 eine Hochregulierung auf RNA-Ebene (während es auf Proteinebene unterrepräsentiert ist).

Dies kann auf die Beteiligung anderer Mechanismen zurückzuführen sein, die den Abbau oder die Inaktivierung von Sulfattransferase-Enzymen bei der Behandlung mit DEPe induzieren. Besonders überraschend ist, dass diese Veränderungen im xenobiotischen Stoffwechsel in den Köpfen (vermutlich Gehirnen) der Fische auftraten. Die Expression xenobiotischer Gene wurde im Nervensystem von Säugetieren beschrieben, dies ist jedoch der erste Bericht darüber im Gehirn von Zebrafischen (McMillan und Tyndale 2018).

Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einer ähnlichen Studie von Shankar und Mitarbeitern, die die Auswirkungen verschiedener Gruppen von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) aus der Umwelt auf die Entwicklung von Embryonen testeten und die Auswirkungen jedes Behandlungsschemas auf das Transkriptomprofil weiter bewerteten.

Am gesamten Körper von 48 hpf-Embryonen (hpf) zeigten sie, dass die Hochregulierung von Cyp1a sowohl auf Transkriptions- als auch auf Proteinebene ein früher zuverlässiger Biomarker für die xenobiotische AHR-Aktivierung und nachgeschaltete transkriptomische Veränderungen ist (Shankar et al. 2019).

Die NRF2-vermittelte Reaktion auf oxidativen Stress

Oxidativer Stress kann Apoptose und Nekrose auslösen und wird als an der Neurodegeneration beteiligt angesehen (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Eine wichtige zelluläre Abwehrreaktion auf oxidativen Stress ist die Induktion von antioxidativen und entgiftenden Enzymen.

Der mit dem Kernfaktor Erythroid 2-verwandte Faktor 2 (Nrf2) bindet an Promotor-Antioxidans-Response-Elemente (ARE) und aktiviert deren Transkription. Inaktives Nrf2 ist mit einem Aktin-bindenden Protein Keap1 assoziiert und wird im Zytoplasma zurückgehalten.

Ausgelöst durch oxidativen Stress wird Nrf2 als Reaktion auf die Proteinkinase-C-, Phosphatidylinositol-3--Kinase- und MAP-Kinase-Wege phosphoryliert. Das phosphorylierte Nrf2 kann dann in den Zellkern wandern und ARE binden, um entgiftende und antioxidative Enzyme zu transaktivieren (Ergänzungstabelle 3) (Ma 2013).

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