Entdeckung und Identifizierung potenzieller antimelanogener Wirkstoffe von Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 und Hongjiang Chen1,2*

Abstrakt

Hintergrund:Bletilla striata ist das Hauptarzneimittel vieler klassischer Formeln zur Hautaufhellung in der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) und wird seit kurzem in der Kosmetikindustrie weit verbreitet. Seine Wirkstoffe sind jedoch noch unklar und seine faserigen Wurzeln werden nicht effektiv genutzt. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, seine potenziellen antimelanogenen Wirkstoffe durch Zebrafischmodell und molekulares Docking zu entdecken und zu identifizieren.

Methoden:DasAntioxidansAktivitäten wurden anhand von 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Radikalfängeraktivität, 2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS ) Radikalfängeraktivität und Eisen(III)-ReduktionAntioxidansPower (FRAP)-Assay. Die antimelanogene Aktivität wurde durch bewertetTyrosinasehemmendAktivitätin vitro und melaninhemmend bei Zebrafischen. Die chemischen Profile wurden durch Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie in Kombination mit Quadrupol-Flugzeit-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-Q-TOF-MS/MS) erstellt. Zwischenzeitlich wurden die potenziellen antimelanogenen Wirkstoffe durch Molecular Docking vorläufig identifiziert.

Ergebnisse:Der 95-prozentige Ethanolextrakt aus B. striata-Faserwurzeln (EFB) besaß die stärksten DPPH-, ABTS-, FRAP- und Tyrosinase-hemmenden Aktivitäten mit IC50 5.94 mg/L, 11,69 mg/L, 6,92 mmol FeSO4/g, bzw. 58,92 mg/l. Darüber hinaus reduzierten EFB und 95-prozentiger Ethanolextrakt aus B. striata tuber (ETB) die Melaninsynthese von Zebrafischembryonen dosisabhängig signifikant. 39 chemische Zusammensetzungen, darunter 24 Stilbenoide, wurden vorläufig aus EFB und ETB identifiziert. Molekulares Docking zeigte, dass 83 (einschließlich 60 Stilbenoide) und 85 (einschließlich 70 Stilbenoide) Verbindungen stärkere Bindungsaffinitäten gegenüber Tyrosinase und Adenylatcyclase aufwiesen.

Fazit:Die vorliegenden Ergebnisse unterstützten die Begründung für die Verwendung von EFB und ETB als natürliche Hautaufhellungsmittel in der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie.

Schlüsselwörter: Bletilla striata, Antioxidans, Anti-melanogene Aktivität, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafisch, Molekulares Andocken

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Hintergrund

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. ist eine krautige mehrjährige Pflanze, die in Asien wie China, Korea und Japan weit verbreitet ist [1]. Die getrocknete Knolle von B. striata, auch bekannt als Baiji, erstmals in Shennongs Classic of Materia Medica erwähnt, wird seit Tausenden von Jahren in China als traditionelle chinesische Medizin (TCM) verwendet. Chinesische Arzneibücher geben an, dass es die Fähigkeit zur Adstringenz bei Hämostase und Analgesie besitzt, daher wurde es häufig zur Behandlung von Hämatemesis, Hämoptyse, traumatischen Blutungen, Geschwüren, Schwellungen und rissiger Haut eingesetzt [2, 3]. Pharmakologische Studien zeigten, dass B. striata ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten besitzt, wie Wundheilung [4, 5], Antiulkus [6, 7], Blutstillung [8],Anti-Entzündung[9], Antioxidans[10], antibakteriell [11], anti-influenzaviral [12] und Anti-Aging [13]. Gleichzeitig enthält B. striata verschiedene Klassen chemischer Zusammensetzungen, einschließlichPolysaccharide[14], Bibenzyle, Phenanthrene, Anthrachinone,Flavonoide, und 2-Isobutylmalate [3, 15] usw.

B. striata ist das Hauptarzneimittel vieler klassischer Formeln zur Hautaufhellung in der TCM [16] und wird seit kurzem in der Kosmetikindustrie weit verbreitet [17]. Seine Wirkstoffe sind jedoch noch unklar und sogar einige Forschungsergebnisse waren widersprüchlich. Zum Beispiel die Forschungsergebnisse von Chenet al. wiesen darauf hin, dass 95-prozentiger Ethanolextrakt von B. striata eine höhere Tyrosinase-Hemmaktivität besaß als der Wasserextrakt mit einer Hemmrate von 68,36 Prozent in vitro[18], während das Ergebnis von Huang et al. zeigten, dass die inhibitorische Aktivität von B. striata-Wasserextrakt auf Tyrosinase stärker war als die von 95-prozentigem Ethanolextrakt mit einer Inhibitionsrate von 62 Prozent in vitro [19]. Die Forschungsergebnisse von Luetal.[20] und Linghuetal.[21] zeigten, dass sowohl Wasser als auch 95-prozentiger Ethanolextrakt von B. striata, insbesondere seine Chloroformfraktionierung, das Wachstum von B16-Zellen hemmen und ihre Apoptose konzentrationsabhängig induzieren können.

Da die In-vitro-Tests zur Tyrosinase-Hemmung und Melanom-Zelllinien nicht die komplexen physiologischen In-vivo-Bedingungen und die Absorption, Metabolisierung, Verteilung und Ausscheidung der Testprobe beinhalteten, zeigten viele der Proben eine signifikante inhibitorische Aktivität gegen Tyrosinase und Melanom-Zelllinien vitro zeigte jedoch in vivo eine schwache Wirksamkeit oder sogar Unwirksamkeit [22,23]. Das Glabridin zeigte eine signifikante tyrosinasehemmende Aktivität mit IC50 0.43 μmol/l, was 176-mal stärker war als die von Kojisäure. Dennoch gab es in vivo keine hemmenden Wirkungen auf die Pigmentierung von Zebrafischen[24].

Unterdessen waren B. striata-Faserwurzeln (FB) die Nebenprodukte, die während der Verarbeitung von B. striatatuber (TB) erzeugt wurden. Moderne Forschungen haben gezeigt, dass FB ähnliche Verbindungen mit TB und mit höherem Phenolgehalt enthält [25]. Darüber hinaus waren die antibakteriellen [26], antioxidativen und Anti-Tyrosinase-Aktivitäten von FB-Extrakt stärker als die von TB-Extrakt [25]. Die Ressourcen von FB wurden jedoch nicht effektiv genutzt und wurden auf dem Ackerland zurückgelassen, was zur Verschwendung von FB-Ressourcen und Umweltverschmutzung führte [27].

Der Zebrafisch (Danio rerio), ein kleiner tropischer Süßwasserfisch, ist ein aufstrebendes Tiermodell für die Pharmakologie

und toxikologische Forschung in vivo, mit vielen Vorteilen, darunter niedrige Kosten, kurzer Lebenszyklus, hohe Transparenz, einfache Wartung, hohe Fruchtbarkeit und weniger Testproben erforderlich [28, 29]. Darüber hinaus hat Zebrafisch Melaninpigmente auf der Oberfläche, was eine einfache Beobachtung des Pigmentierungsprozesses ermöglicht, und wurde häufig in der Anti-Melanogen-Studie verwendet [28, 30].

In der vorliegenden Studie verglichen wir die antioxidativen und tyrosinasehemmenden Aktivitäten von rohem Polysaccharid und 95-prozentigem Ethanolextrakt von TB und FB in vitro und die anti-melanogenen Aktivitäten im Zebrafischmodell. Zwischenzeitlich wurden die potentiellen antimelanogenen Wirkstoffe durch Molecular Docking vorläufig identifiziert. Wir entdeckten, dass ein 95-prozentiger Ethanolextrakt von TB (ETB) und FB (EFB) signifikant antioxidative und Anti-Tyrosinase-Aktivitäten besitzt und die Melaninsynthese von Zebrafischembryos dosisabhängig reduzieren kann. Somit können ETB und EFB als natürliche Hautaufhellungsmittel in der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie verwendet werden.

Methoden

Chemikalien und Reagenzien

Tyrosinase, 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanin (L-DOPA) und Arbutin wurden von Aladdin Reagent Company (Shanghai, China) gekauft.2,2-Diphenyl{{8 }}Picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS),6-Hydroxy-2,5,7 ,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox) und 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazin (TPTZ) wurden von Sigma-Aldrich bezogen (St. Louis, MO, USA). Acetonitril und Methanol (HPLC-Qualität) wurden von Tedia (Fairfield, OH, USA) bezogen. Deionisiertes Wasser wurde durch das Milli-Q-Wassersystem (18,2 MΩ, Millipore, USA) hergestellt.

Pflanzensammlung und Extraktionsverfahren

B. striata wurde von Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, China) gesammelt. Belegexemplare wurden im Herbarium des Zhejiang Pharmaceutical College (Zugangsnummer 190615) hinterlegt. Die ganze Pflanze war in Knollen und faserige Wurzeln unterteilt. Anschließend wurden sie in kleine Stücke geschnitten und jeweils durch Vakuum-Gefriertrocknung getrocknet.

Die getrockneten und pulverisierten Proben (TB und FB) wurden dreimal (jeweils 1,5 h) mit 95 % Ethanol unter Rückfluss extrahiert. Der Extrakt wurde unter Verwendung eines What-Man-Filterpapiers (Nr. 1) filtriert. Das Filtrat wurde in einem Rotationsverdampfer (Hei-VAP, Heidolph, Deutschland) bei 50 Grad bis zur Trockne eingeengt und anschließend durch einen Vakuum-Gefriertrockner getrocknet. Die Ausbeuten der Ethanolextraktion von TB (ETB) und FB (EFB) betrugen 5,21 bzw. 6,53 Prozent. Der Bodensatz wurde verwendet, um das rohe Polysaccharid zu extrahieren, indem er 4 Stunden lang in 80-Grad-Wasser dispergiert und mit Ethanol ausgefällt wurde [31]. Die Polysaccharidausbeuten von TB (PTB) und FB (PFB) betrugen 14,75 bzw. 6,45 Prozent.

Cistanche-Extrakt

Chemische Analyse

Die chemische Analyse wurde auf einer Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie in Kombination mit Quadrupol-Flugzeit-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-Q-TOF-MS/MS) durchgeführt. Die chromatographische Trennung wurde auf einem Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, US) mit einer WatersBEH Shield RP C18-Säule (100×2,1 mm, 1,7 μm) bei 3{ {43}} Grad . Die mobile Phase bestand aus 0,1 Prozent Ameisensäure in Wasser (A) und Acetonitril (B) mit einem linearen Gradienten: 0–3 min, 5–16 Prozent B; 3–8 Minuten, 16–30 Prozent B; 8–10 Minuten, 30–35 Prozent B; 10–15 Minuten, 35–55 Prozent B; 15–18 Min., 55–80 % B; 18–19 Min., 80–5 % B; 19–20 min, 5 Prozent B. Die Flussrate betrug 0,3 ml/min und das Injektionsvolumen betrug 2 μl.

Die TOF-MS/MS-Experimente wurden unter Verwendung eines Massenspektrometers AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, USA) durchgeführt, das mit einer Elektrospray-Ionisierung (ESI) ausgestattet war. Der MS-Nachweis wurde im negativen Ionisationsverfahren durchgeführt. Die Parameter wurden wie folgt eingestellt: Quellen- und Desolvationstemperatur betrugen 100 Grad bzw. 450 Grad; die Strömungsgeschwindigkeit des Desolvatisierungsgases betrug 900 l/h; die Kapillarspannung betrug 2 kV; Kegelspannung war 40 V; Kollisionsenergie war 22 eV; und das vollständige Scanspektrum war von 100 bis 2000 Da.

Antioxidans-Assays Radikalfängeraktivität von DPPH

Die Radikalfängeraktivität von DPPH wurde nach Ali et al. mit geringfügigen Modifikationen [32]. Kurz gesagt, 50 μL Testprobenlösung wurden mit 150 μLDPPH-Ethanollösung (0,2 mM) in 96-Well-Platten gemischt und 30 Minuten lang im Dunkeln aufbewahrt . Die Extinktion der Mischung bei 517 nm (E1) wurde mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, America) bestimmt. Die Blindlösung ohne Testprobe gemischt mit DPPHethanol-Lösung wurde als positive Gruppe (A0) gesetzt. Als Blindgruppe (A2) wurde die mit Testprobenlösung vermischte Blindlösung ohne DPPH gesetzt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die DPPH-Radikalfängerrate wurde nach folgender Formel berechnet:

DPPH-Radikalfängerrate ( Prozent ) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 Prozent .

Radikalfängeraktivität von ABTS

Die Radikalfängerkapazität von ABTS wurde nach der von Ali et al. [32]. Kurz gesagt wurde eine wässrige 7 mMABST-Lösung mit 2,45 mM Kaliumpersulfat in einem Verhältnis von 1:1 (v/v) gemischt und bei Raumtemperatur im Dunkeln für 16 h inkubiert, um die ABST plus Stammlösung zu erhalten. Die Stammlösung wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, um die Extinktion von (0,72 ± 0,2) bei 734 nm einzustellen. 20 μL Testproben in verschiedenen Konzentrationen wurden gründlich mit 180 μL ABTS plus Lösung gemischt. Die reaktiven Mischungen wurden 5 min lang im Dunkeln gehalten und anschließend die Extinktion (B1) bei 734 nm gemessen. Die Extinktion der Mischungen ohne Testprobe und ABST plus wurden als B bzw. B eingestellt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die ABTS-Radikalfängerrate wurde nach folgender Formel berechnet:

ABTS-Radikalfängerrate ( Prozent ) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 Prozent .

Ferric Reduction Antioxidant Power Assay (FRAP)

Die Eisen(III)-Reduktionsaktivität wurde gemäß den Verfahren von Kosakowska et al. bestimmt. [33]. 300 mM Acetatpuffer, 10 mM TPTZ (2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazin) und 20 mM FeCl3 wurden bei (v/v/v) gemischt Verhältnis von 10:1:1, um das Arbeitsreagenz herzustellen. 100 μl jeder Testprobenlösung wurden mit 100 μl TPTZ-Arbeitsreagenz gemischt, bei 37 Grad für 20 Minuten inkubiert und die Extinktion bei 593 nm bestimmt. Inzwischen wurde eine Reihe von FeSO4-Standardlösungen in den Konzentrationsbereichen von 0–1000 ug/mL verwendet, um die Kalibrierkurve zu erstellen. Die Eisen(III)-Reduktionskapazität wurde anhand der Bildung eines intensiven Fe2-plus-TPTZ-Blau-Komplexes berechnet. Die Ergebnisse wurden als Fe2 plus antioxidative Kapazität (mmol FeSO4/g Extrakt) ausgedrückt.

Tyrosinase-hemmende Aktivität

Tyrosinase-Hemmaktivitäten wurden durch ein spektrophotometrisches Verfahren unter Verwendung von L-DOPA als Substrat [34] bestimmt. 50 μl Probenlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden kurz mit 50 μl Tyrosinase (200 Einheiten/ml, gelöst in Phosphatpuffer, pH 6,8) in 96--Vertiefungen gemischt plattieren und 15 min bei 25 Grad inkubieren . Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von L-DOPA (50 &mgr;l) gestartet. Nach 30-minütiger Inkubation bei 25 Grad wurde die Extinktion bei 490 nm (Aa) unter Verwendung eines Multiskan-Sky-Mikroplatten-Spektrophotometers (ThermoFisher Scientific, America) bestimmt. In ähnlicher Weise wurde die Extinktion der Probenvertiefungen ohne Tyrosinase (Ab) und der Kontrollvertiefungen mit Enzym, aber ohne Probe (Ab) gleichzeitig erfasst. Die tyrosinasehemmende Aktivität wurde nach folgender Gleichung berechnet:

Tyrosinase-Hemmrate (Prozent)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 Prozent .

Der IC50 wurde unter Verwendung der GraphPad Prism-Gleichung wie folgt berechnet:

Y=min plus (max − min)/1 plus 10(x−logIC50)×Hügelneigung

X stellte die Inhibitorkonzentration dar; Y stellte die Hemmungsdaten (Prozent) zusammen mit ihren minimalen (min) und maximalen (max) Werten dar; Hill Slope ist der Steigungsfaktor.

Cistanche hemmt die Tyrosinase-Aktivität.

Melanin-hemmend bei Zebrafischen

Wildtyp-Zebrafische der AB-Linie (bereitgestellt von Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Provinz Zhejiang) wurden in Fischwasser gehalten (0,2 Prozent Instant-Ozeansalz in deionisiertem Wasser, pH 6,9–7,2, Leitfähigkeit 48{ {18}}–510 mS/cm und Härte 53,7–71,6 mg/L CaCO3) in einer 14/10-h-Hell/Dunkel-Photoperiode bei einer konstanten Temperatur von 28 ± 0,5 Grad und zweimal täglich mit lebenden Salzgarnelen gefüttert. Die Zebrafischembryos wurden aus natürlicher Laichzeit gewonnen und innerhalb von 30 Minuten eingesammelt. Der Zebrafisch-Assay wurde von der Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care (AAALAC) akkreditiert. Die vorliegende Studie wurde vom IACUC (Institutional Animal Careand Use Committee) bei Hunter Biotechnology, Inc. genehmigt, und die IACUC-Zulassungsnummer lautete 001458.

Embryonen im Stadium 6 h nach der Befruchtung (hpf) wurden mit jedem Extrakt in sechs Konzentrationen (1 0, 30, 62,5, 125, 250 und 500 mg/L) für 72 h behandelt, um die maximale nicht-tödliche Konzentration (MNLC) zu bestimmen ). Als Ergebnis betrugen die MNLCs des gesamten Extrakts mehr als 62,50 mg/l. 10 Embryonen wurden in 6--Vertiefungen gegeben und getesteten Proben in Konzentrationen von 10 und 30 mg/l von 6 hpf bis 54 hpf (48-stündige Exposition) ausgesetzt ). DMSO (0,05 Prozent, v/v) und Arbutin (10 und 30 mg/l) wurden als normale bzw. positive Kontrolle verwendet.

Synchronisierte Embryonen wurden gesammelt und unter einem Stereomikroskop (SZX7, Olympus, Japan), das mit einer Digitalkamera (VertA1, China) ausgestattet war, beobachtet. Die Melaninakkumulation, die direkt mit den Zebrafischpigmentierungsbereichen korreliert, wurde mit dem GNUImage Manipulation Program (GIMP Version 2.10.2) berechnet und als Prozentsatz in Bezug auf die Negativkontrolle (Melaninakkumulation 100 Prozent) ausgedrückt [28, 30].

Molekulare Docking-Studie

158 aus B. striata isolierte Verbindungen in der Literatur[2], darunter 19 Glykoside, 28 Bibenzyle, 19 Phenanthrene, 18 Biphenanthrene, 23 Dihydrophenanthrene, 5 Anthocyane, 11 Steroide, 8 Triterpenoide, 12 Phenolsäuren, 5 Chinone, und 10 andere Verbindungen, wurden als Liganden verwendet. Die 3D-Strukturen wurden von ChemBio3D gezeichnet und mit MM2 und Autodock Tools optimiert. Die 3D-Kristallstruktur von Tyrosinase (PDBID:5M8N) und Adenylatcyclase (PDB ID:5IV3) wurde von der RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do) abgerufen. Alle Wassermoleküle und Heteroatome wurden mithilfe von Chimera und MGL Tools aus den Kristallstrukturen entfernt. Schließlich Autodock

Vina wurde verwendet, um das Rezeptorprotein mit den kleinmolekularen Liganden anzudocken. Die Parameter der Andockstelle des Rezeptorproteins wurden entsprechend dem ursprünglichen Liganden Mimosin und LRE1 auf –36,700, 7,034, –19,104 bzw. –17,467, –22,807, 2,786 eingestellt [35]. Um eine höhere Rechengenauigkeit zu erreichen, wurden 20 Vollständigkeitsparameter für jeden Rezeptor generiert, und die Konformation mit der höchsten Affinität wurde als endgültige Docking-Konformation ausgewählt und in Pymol2.3 visualisiert. Inzwischen wurden die ursprünglichen Liganden Mimosin und LRE1 als positive Kontrolle genommen [36].

In silico ADMET-Vorhersage

Die Top-3-Treffer von B. striata besaßen eine bessere Bindungsaffinität mit Tyrosinase und Adenylatcyclase und wurden einer ADMET-Analyse unterzogen. QikProp in der Schrödingersuite wurde verwendet, um ihre physikalischen Eigenschaften und arzneimittelbezogenen Eigenschaften zu berechnen, einschließlich Molekulargewicht (MW), vorhergesagter Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient (QPlogPo/w), vorhergesagte Wasserlöslichkeit (QPlogS), vorhergesagte scheinbare Caco-2-Zelle Permeabilität für die Darm-Blut-Schranke (QPPCaco), vorhergesagter Gehirn-/Blutverteilungskoeffizient (QPlogBB), vorhergesagte Hautpermeabilität (QPlogKp), vorhergesagter IC50 für die Blockierung von HERGK-plus-Kanälen (QPlog HERG) und vorhergesagte orale Absorption beim Menschen. Die Eigenschaften wurden basierend auf der Fünferregel von Lipin-Ski und Literatur [37, 38] bewertet.

Molekulardynamik-Simulation

Um die Stabilität und dynamischen Schwankungen des Ligand-Protein-Komplexes unter einer simulierten biologischen Umgebung zu untersuchen und die Docking-Ergebnisse weiter zu validieren, wurde die Verbindung Blestrin D (75) als Ligand für die Molekulardynamik (MD)-Simulationsstudie ausgewählt, basierend auf der Molekulares Docking-Ergebnis. Der Komplex von Blestrin D mit Tyrosinase und Adenylatcyclase wurden MD-Simulationen durchgeführt und für 100 ns im TIP3P-Wassermodus laufen gelassen. Die Werte der mittleren quadratischen Abweichung (RMSD) der Atome des Proteinrückgrats relativ zur Ausgangsstruktur wurden berechnet, um die Proteinstabilität über den Verlauf der Simulationsdauer zu untersuchen [39].

Ergebnisse

Chemische Zusammensetzung

Die typischen Basispeak-Chromatogramm-Chromatogramme von ETB und EFB sind in Fig. 1 gezeigt. Die PeakView-Software wurde verwendet, um die Bestandteile zu identifizieren. Die Molekularformel wurde innerhalb eines Massenfehlers von 10 ppm genau zugeordnet. Das exakte Molekulargewicht und die Fragmente wurden verwendet, um die Komponenten gemäß der Literatur und der freien chemischen Strukturdatenbank, wie ChemSpider und Massbank, zu identifizieren. Als Ergebnis wurden 39 chemische Zusammensetzungen, darunter 24 Stilbenoide (Bibenzyle, Phenanthrene und ihre Derivate), 6 Glykoside, 4 Phenolsäuren, 3 Chinone, 1 Steroid und 1 andere Verbindung vorläufig von EFB und ETB identifiziert. Gleichzeitig wurde ihre relative Halbquantifizierung durchgeführt, indem die Peakflächen jeder Verbindung im MS-Modus unter Verwendung der extrahierten Ionenchromatogramme gemessen wurden [40]. Konzentration) wurden in Tabelle 1 zusammengefasst.

Antioxidative Kapazität

Es ist allgemein bekannt, dass Ultraviolett-A (UVA)-Bestrahlung die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) induzieren und eine übermäßige Melanogenese in Hautzellen vermitteln kann. Natürliches Polyphenol war der Inhibitor der ROS-Erzeugung und könnte für die antimelanogene Aktivität von Pflanzenextrakten verantwortlich sein [41 , 42]. Daher wurde in der vorliegenden Studie die antioxidative Kapazität durch DPPH, ABTS-Radikalfängeraktivität und FRAPassay bewertet. Die Ergebnisse (Tabelle 2 und Abb. 2) zeigten, dass das EFB (IC50=5.94 mg/L) im Vergleich zum PTB (IC50=548.24 mg/L) die stärkste DPPH-Radikalfängeraktivität in vitro besitzt. , PFB (IC50=285,81 mg/l) und ETB (IC50=65,25 mg/l). Ein ähnlicher Trend wurde im ABTS- und FRAP-Assay beobachtet. Die zu 95 Prozent ethanolischen Extrakte von TB und PB hatten in vitro eine stärkere Antioxidationsaktivität als ihre rohen Polysaccharide. Darüber hinaus zeigt EFB eine stärkere Antioxidationsaktivität als ETB, was mit den früheren Forschungsergebnissen übereinstimmt [25].

Tyrosinase-hemmende Aktivität

Tyrosinase war das geschwindigkeitsbegrenzende Schlüsselenzym im Melaninbiosyntheseweg und wurde weithin verwendet, um das Potenzial von Naturstoffen mit Anti-Melanogenese-Effekt zu identifizieren [43]. Die Ergebnisse (Abb. 3) zeigten, dass ETB und EPB in vitro eine stärkere tyrosinasehemmende Aktivität aufwiesen als PTBand PPB, was mit früheren Forschungsergebnissen übereinstimmte [25]. EFB zeigte in dosisabhängiger Weise (zwischen 20 und 200 mg/l) mit IC50=58.92 mg/l eine stärkere tyrosinhemmende Aktivität als ETB(IC50=75.44 mg/l) und die positive Verbindung Arbutin (IC{ {11}},02 mg/l).

Melanin-hemmend bei Zebrafischen

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), was darauf hinweist, dass das Vehikel 0,05 Prozent DMSO die Melaninproduktion in Zebrafischembryos nicht beeinflusste. Nach 48-stündiger Exposition gegenüber den getesteten Proben und Arbutin zeigten Zebrafischembryos jedoch unterschiedliche Grade von Melaninablagerung (Fig. 3B, 4), mit Ausnahme der Gruppe mit PFB 10 mg/l. Es fällt auf, dass der relative Melaningehalt in den ETB-Gruppen mit 10 mg/L (78,38 Prozent) und 30 mg/L (64,72 Prozent) signifikant niedriger war als in den PTB-Gruppen mit 10 mg/L (93,06 Prozent) und 30 mg/L (82,02 Prozent) (S<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Molekulares Andocken

Tyrosinase ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym in der Melaninbiosynthese: Hydroxylierung von Tyrosin zu 3,4-Dihydroxy-Phenylalanin (DOPA) und Oxidation von DOPA-Todopachinon. Daher wurde Tyrosinase als kritisches Ziel für die Entwicklung von Melanogenese-Inhibitoren angesehen [44]. Darüber hinaus ist Adenylatcyclase ein Schlüsselenzym der cAMP-induzierten Melanogenese. Die Bindung von Melanotropin-Alpha-Polypeptid (-MSH) an MC1R-Rezeptoren induzierte die Aktivierung von Adenylatcyclase, eine Erhöhung des cAMP-Spiegels, eine hochregulierte Expression des Tyrosinase-Gens und anschließend eine Erhöhung der Melaninsynthese [45]. Daher führten wir eine molekulare Docking-Studie der 158 zuvor aus B. striata isolierten Verbindungen [2] mit Tyrosinase und Adenylatcyclase durch. Die Bindungsenergien der untersuchten Liganden mit Tyrosinase und Adenylatcyclase sind in Tabelle S1 zusammengefasst. Es gab 83 (einschließlich 6 0 Stilbenoide) und 85 (einschließlich 70 Stilbenoide) Verbindungen, die stärkere Bindungsaffinitäten zu Tyrosinase und Adenylatcyclase aufweisen, verglichen mit denen der ursprünglichen Liganden Mimosin (– 6,4 kcal/mol) und LRE1 (– 8,5 kcal /Mol). 1,8-Bis(p-hydroxybenzyl)-4-methoxyphenanthren-2,7-Diol (56), Blestrin D (75) und 2,7-Dihydroxy -1,6-bis(p-hydroxybenzyl)-4-methoxy-9,10-dihydrophenanthren (93) waren die wichtigsten drei Liganden für Tyrosinase mit Bindungsenergie −10,2, 10,0 bzw. 9,7 kcal/mol. Während Blestrin D (75), Blestrin B (73) und 3,3′-Dihydroxy-5-methoxy-2,5′,6-tris(p-hydroxybenzyl)bibenzyl (42) waren die drei besten Liganden gegenüber Adenylatcyclase mit Bindungsenergien von −12,1, −11,9 bzw. −11,6 kcal/mol. Ihre theoretischen Bindungsaffinitäten und Ligand-Aminosäure-Wechselwirkungen sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Es ist erwähnenswert, dass Blestrin D (75), eine Biphenanthrenverbindung, in die Bindungstasche von Tyrosinase und Adenylatcyclase eindringt (Fig. 5) und signifikante Bindungsaffinitäten sowohl zu Tyrosinase als auch zu Adenylatcyclase zeigt. Die Van-der-Walls-Wechselwirkungen tragen zum Gesamtwert der Energiewechselwirkung bei, während die Hydroxylgruppe Wasserstoffbrückenbindungen mit den Aminosäureresten Glu 451, Arg114 der Tyrosinase bzw. Val 167 der Adenylatcyclase herstellt (Tabelle 3 und Abb. S1). Verbindung 93 zeigte ebenfalls signifikante Bindungsaffinitäten in Richtung Tyrosinase durch Bildung von 6 Wasserstoffbrückenbindungen mit den Aminosäureresten Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 und Gln236.

In silico ADMET-Vorhersage

Die vorhergesagten Werte mehrerer wichtiger Parameter zusammen mit ihrem akzeptablen Bereich sind in Tabelle 4 zusammengefasst. }Trimethoxybibenzyl, alle anderen berechneten ADMET-Eigenschaften der Top-3-Hits lagen innerhalb der erwarteten Bereiche, während die QPlog HERG aller Top-3-Hits weniger als –5 waren, was darauf hinweist, dass sie ein medizinisches Potenzial für den menschlichen Gebrauch hatten. Die QPlog Kp aller Top-3-Hits für sowohl Tyrosinase als auch Adenylatcyclase, mit Ausnahme von 3,3′,5-Trimethoxybibenzyl, lagen im günstigen Bereich, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen leicht in die Haut eindringen können.

Molekulardynamische Simulation

Der RMSD-Plot zeigte, dass die RMSD-Werte des Protein-Liganden-Komplexes während des gesamten Simulationszeitraums nicht signifikant schwankten. Die RMSD-Werte (Fig. 6A) von Blestrin D mit Tyrosinase und Adenylatcyclase-Komplex wurden im Bereich von 1,5 bis 2,8 Å bzw. von 2,0 bis 3,6 Å bestimmt. Der RMSF-Wert spiegelt die Flexibilität jedes Rests während der Simulationen wider. Die Reste mit höheren RMSF-Werten zeigten, dass sie flexibler waren (Abb. 6B). Es wurde festgestellt, dass die RMSF-Werte der Aminosäurereste in Schleifenregionen stark schwanken. Während die Reste des aktiven Zentrums einen kleinen RMSF-Wert (weniger als 1,0 Å) behielten, wie Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 und Arg230 in der Tyrosinase und Val167, Leu102, Phe45, Lys95 und Leu166 in der Adenylatcyclase, was darauf hinweist, dass die Bindungstaschen stabil gehalten wurden. Die molekularen Wechselwirkungen von Blestrin D mit Tyrosinase und Adenylatcyclase wurden in Abb. 7 gezeigt.

Die freien Bindungsenergien wurden durch die Molekularmechanik-verallgemeinerte Born-Surface-Area(MM-GBSA)-Methode berechnet [39]. Die vorhergesagte freie Bindungsenergie von Blestrin D mit Tyrosinase und Adenylatcyclase betrug –96,94 kcal/mol bzw. –139,69 kcal/mol, was impliziert, dass die Bindungswechselwirkungen spontan waren (Tabelle 5). Darüber hinaus waren die Beiträge, die die Ligandenbindung begünstigten, unpolare Solvatationswechselwirkungen, Van-der-Waals-Wechselwirkungen und elektrostatische Wechselwirkungen.

Es war erwähnenswert, dass die Arten und Inhalte der chemischen Komponenten in EFB größer waren als die in ETB. Die Peakflächen aller identifizierten Verbindungen in EFB waren etwa doppelt so groß wie die in ETB. Militarin war die am häufigsten vorkommende Verbindung in beiden EF und ETB, die signifikante antioxidative, entzündungshemmende und neuroprotektive Aktivitäten aufwiesen, und wurde als chemischer Marker für die Qualitätskontrolle von B. striata in der Ausgabe des Chinesischen Arzneibuchs 2020 ausgewählt [46]. Die relative Spitzenfläche von Militarin in EFB (38,39 × 106) war etwas höher als die in ETB (30,48 × 106). Gastrodin ist eine wohlbekannte Verbindung in vielen chinesischen Kräuterarzneimitteln, wie Gastrodia elata, die signifikante tyrosinasehemmende und Radikalfängerwirkungen aufweist [30]. Die relative Peakfläche von Gastrodin in EFB (1,43 x 106) war etwas geringer als die in ETB (2,17 x 106).

Die zu 95 Prozent ethanolischen Extrakte von TB und PB hatten in vitro eine stärkere Antioxidationsaktivität als ihre rohen Polysaccharide. Darüber hinaus zeigen EFB eine stärkere Antioxidationsaktivität als ETB, was mit den früheren Forschungsergebnissen übereinstimmte [25]. Dieses Phänomen kann darauf zurückgeführt werden, dass das EFB einen höheren Gehalt an Antioxidantien wie Militarin und Stilbenoiden (natürliche Pflanzenpolyphenole) enthält. Zum Beispiel die relative Peakfläche von 4,8,4′,8′-Tetramethoxy-[1,1′-biphenanthren]-2,7,2′,7′-tetrol, einem Biphenanthren mit vier phenolischen Hydroxylgruppen, betrug 9,15 × 10 6 in FB, während es 0,01 × 106 in TB betrug.

In der vorliegenden Studie zeigten PPB und PTB dosisabhängig eine leichte Tyrosinase-Inhibitionsaktivität. Es zeigte sich jedoch, dass im wässrigen Extrakt von PB (enthält PPB) keine Aktivität nachgewiesen wurde [25]. Dieses Phänomen kann auf die unterschiedliche Probenvorbereitung zurückzuführen sein. Der wässrige Extrakt von PB wurde zur Bewertung der Tyrosinase-Hemmaktivität in Jiangs Experiment [25] verwendet, während in der vorliegenden Studie der wässrige Extrakt mit Ethanol ausgefällt wurde, um das rohe Polysaccharid zu erhalten.

Kürzlich wurde das Zebrafischmodell häufig zur Bewertung der Anti-Melanogenese-Wirkung in vivo verwendet [47, 48]. Arbu-tin, eine in verschiedenen Pflanzen vorkommende Hydrochinon-Glucosid-Verbindung, die kommerziell in der Kosmetikindustrie verwendet wird, wurde als positive Kontrolle eingesetzt. Die Anti-Melanogenese-Aktivitäten von ETB und EFB waren stärker als die von Arbutin, was darauf hindeutet, dass ETB und EFB als hautaufhellende Mittel in der Kosmetikindustrie angewendet werden können.

Die relative Peakfläche von Blestrin D in EFB(1,91 × 106) ist ungefähr viermal so groß wie die in ETB(0,46 × 10). Die relative Peakfläche von Verbindung 56 (8,73 × 106) und 93 (0,64 × 106) in EFB ist ebenfalls signifikant höher als die in ETB (weniger als 0,01 × 106 und 0,10 × 106). Dies könnte einer der Gründe sein, warum EFB stärkere antimelanogene Wirkungen aufweist als ETB. Es ist interessant festzustellen, dass die drei wichtigsten Liganden für Tyrosinase und Adenylatcyclase alle zu Stilbenoiden gehören (Bibenzyle, Phenanthrene und ihre Derivate). Stilbenoide sind die natürlichen Pflanzenpolyphenole, die in den letzten Jahren aufgrund ihrer bemerkenswerten Bioaktivitäten wie entzündungshemmende, antimikrobielle und antioxidative Aktivität großes Interesse auf sich gezogen haben [49]. Resveratrol ist das am weitesten verbreitete Stilbenoid. Die frühere Forschung zeigte, dass Resveratrol und seine Derivate die katalytische Aktivität, Genexpression und posttranslationale Modifikationen von Tyrosinase signifikant hemmen können. Daher erwiesen sie sich als potenziell nützlich als Hautaufheller und Anti-Aging-Wirkstoffe in Kosmetika [41, 50].

Cistanche erwies sich als potenziell nützlich als Hautaufheller und Anti-Aging-Mittel in Kosmetika.

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Schlussfolgerungen

In dieser Studie wurden die antioxidative und antimelanogene Aktivität des rohen Polysaccharids aus B. striatatuber (PTB) und Faserwurzeln (FPB) und 95-prozentigem Ethanolextrakt aus B. striata tuber (ETB) und Faserwurzeln (EFB) systematisch untersucht . Die Ergebnisse zeigten, dass EFB die stärkste DPPH-, ABTS-Radikalfängeraktivität und Eisen(III)-reduzierende Aktivität besaß. Darüber hinaus können ETB und EFB die Tyrosinaseaktivität in vitro und die Melaninsynthese von Zebrafischembryos dosisabhängig signifikant reduzieren. Molekulares Docking deutete darauf hin, dass es eine große Anzahl von Verbindungen gab, die größtenteils zu Stilbenoiden gehörten und im Vergleich zur Bindungsaffinität des ursprünglichen Liganden stärkere Bindungsaffinitäten zu Tyrosinase und Adenylatcyclase aufwiesen. Die vorliegenden Ergebnisse unterstützten die Begründung für die Verwendung von ETB und EFB als natürliche Hautaufheller in der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie.